世界衛(wèi)生組織《優(yōu)化肉湯微孔板法結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群藥物敏感性試驗(yàn)方法學(xué)》解讀

夏輝 鄭揚(yáng) 宋媛媛

盡管世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦并廣泛應(yīng)用的分子生物學(xué)耐藥檢測(cè)技術(shù)如GeneXpert MTB/RIF、線(xiàn)性探針檢測(cè)等解決了結(jié)核分枝桿菌(MTB)對(duì)利福平(RFP)、異煙肼(INH)及氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥性的快速檢測(cè)問(wèn)題[1]，但畢竟檢測(cè)藥物種類(lèi)有限?；蚪M測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)預(yù)測(cè)MTB對(duì)多種藥物的耐藥，彌補(bǔ)了商品化分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不足，但是在尋找和解釋MTB新型突變時(shí)若沒(méi)有可靠的表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果，則仍存在挑戰(zhàn)[2]。目前應(yīng)用的傳統(tǒng)表型藥敏試驗(yàn)方法是一支培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)一種藥品的一個(gè)濃度，且大多數(shù)藥物僅基于一個(gè)臨界濃度(critical concentration)進(jìn)行敏感或耐藥的定性分類(lèi)。臨界濃度是一個(gè)較低的濃度，但對(duì)于某些藥物如莫西沙星(Mfx)，建議在更高的臨床折點(diǎn)濃度(clinical breakpoint)下進(jìn)一步檢測(cè)其耐藥性。這里所說(shuō)臨界濃度指體外實(shí)驗(yàn)抗結(jié)核藥物能抑制99%的表型野生型菌(phenotypically wild type，pWT)生長(zhǎng)時(shí)的最低濃度。而臨床折點(diǎn)濃度則是一個(gè)高于臨界濃度的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，使用該濃度將可能對(duì)治療有反應(yīng)的菌株與可能對(duì)治療無(wú)反應(yīng)的菌株區(qū)分開(kāi)來(lái)。即在體外低濃度檢測(cè)耐藥但高濃度下仍敏感時(shí)意味著患者使用更高的藥物劑量可以克服在較低劑量下觀察到的耐藥，該濃度的確定需要依據(jù)臨床治療結(jié)果、MIC分布和藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)數(shù)據(jù)(包括藥物劑量)等綜合確定。MIC指在固體培養(yǎng)基或液體肉湯培養(yǎng)基藥敏試驗(yàn)中，能阻止99%以上微生物生長(zhǎng)的抗菌劑的最低濃度。還有一個(gè)重要的概念是流行病學(xué)臨界值(epidemiological cut-off value，ECOFF)。ECOFF在以前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷領(lǐng)域未被引入，但是在其他病原菌的藥敏試驗(yàn)中是非常重要的概念?，F(xiàn)階段結(jié)核病診斷領(lǐng)域的臨界濃度即對(duì)應(yīng)于ECOFF[3]。通常，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)化方法測(cè)試MIC時(shí)，針對(duì)pWT會(huì)形成單個(gè)高斯分布形態(tài)，即pWT分布；ECOFF對(duì)應(yīng)于pWT分布的右端(即通常包含99%的pWT菌株)。

肉湯微孔板法結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群藥敏試驗(yàn)一般使用96孔微孔板(單孔底面積約0.32 cm2，加液量不超過(guò)200 μl)，根據(jù)藥物在微孔板上的排列方式和每種藥物包含的濃度范圍，每塊微孔板可以同時(shí)檢測(cè)多種藥物，相比以往的基于單支培養(yǎng)基的固體和液體表型藥敏試驗(yàn)可以減輕工作量，同時(shí)減少孵育空間需求。并且，微孔板法可以得到每株具體的MIC值，區(qū)別于單純的二分類(lèi)敏感/耐藥定性結(jié)果。下面將重點(diǎn)針對(duì)微孔板法藥敏試驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)及優(yōu)化方法進(jìn)行解讀。

一、肉湯微孔板法結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群藥敏試驗(yàn)介紹及優(yōu)化思路

(一)方法優(yōu)勢(shì)

1.識(shí)別不同水平耐藥：目前抗結(jié)核治療方案的選擇依據(jù)藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果(耐藥和敏感)，尤其是某些核心藥物如RFP和氟喹諾酮類(lèi)藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果。因?yàn)閷?duì)于大多數(shù)藥物而言，傳統(tǒng)表型藥敏試驗(yàn)僅檢測(cè)基于臨界濃度的結(jié)果(Mfx除外)，無(wú)法獲知耐藥水平對(duì)療效的影響。盡管已知某些突變導(dǎo)致的MTB耐藥為低水平耐藥，但多數(shù)情況下基因型藥敏試驗(yàn)也僅報(bào)告敏感或耐藥二分類(lèi)結(jié)果，臨床也僅依據(jù)該結(jié)果制定相應(yīng)的治療方案。盡管WHO已更新了線(xiàn)性探針技術(shù)的結(jié)果解讀和報(bào)告，但在臨床系統(tǒng)并未進(jìn)行更新[4]。而微孔板法可以包含數(shù)量不等的高于臨界濃度的多個(gè)濃度，可以區(qū)分低水平和高水平耐藥，進(jìn)一步告知臨床醫(yī)師是使用標(biāo)準(zhǔn)的藥物劑量還是需要提高藥物劑量來(lái)治療感染MIC輕微升高M(jìn)TB菌株的患者。同時(shí)，通過(guò)積累數(shù)據(jù)還可以為其他藥敏試驗(yàn)方法是否需要設(shè)置高于ECOFF的折點(diǎn)(即臨床折點(diǎn))提供更多的證據(jù)。而這些都是以往基于耐藥/敏感的二分類(lèi)結(jié)果的表型藥敏試驗(yàn)無(wú)法獲得的。

2.解釋并發(fā)現(xiàn)某些不穩(wěn)定結(jié)果及不一致結(jié)果：多數(shù)情況下耐藥MTB菌株的MIC值升高較明顯，但對(duì)于部分抗結(jié)核藥物因某些耐藥機(jī)制(如某些rpoB臨界突變引起的RFP耐藥)導(dǎo)致的耐藥MTB的MIC僅輕微升高[5]，致其MIC分布與敏感菌株的MIC分布重疊較多，意味著選定的臨界濃度與這些耐藥機(jī)制引起的耐藥菌株MIC分布會(huì)發(fā)生交叉。對(duì)此類(lèi)菌株如果僅依據(jù)單一的臨界濃度檢測(cè)耐藥與敏感二分類(lèi)結(jié)果，重復(fù)性必然會(huì)差。減少這種將耐藥誤分類(lèi)為敏感的最佳方法是通過(guò)減少M(fèi)IC檢測(cè)技術(shù)不確定性來(lái)消除或最小化MIC分布之間的重疊程度。因ECOFF或臨界濃度的設(shè)置是抑制99%的pWT菌株，所以理論上當(dāng)耐藥菌株在全部菌株中占比接近1%時(shí)，現(xiàn)有表型藥敏試驗(yàn)方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值會(huì)很差，因?yàn)檫@1%的敏感菌株會(huì)由于不可避免的技術(shù)層面的不確定性被錯(cuò)誤分類(lèi)為耐藥。某種程度上，可以獲得具體MIC值的微孔板法將能夠識(shí)別這種隨機(jī)的錯(cuò)誤導(dǎo)致的耐藥結(jié)果，即當(dāng)MIC值升高僅高于ECOFF一個(gè)濃度時(shí)出現(xiàn)此類(lèi)錯(cuò)誤的概率會(huì)較大，而對(duì)于MIC值高于ECOFF兩個(gè)濃度的菌株，則不太可能發(fā)生此類(lèi)錯(cuò)誤。對(duì)于某些基因型和表型藥敏試驗(yàn)不一致結(jié)果，也可以通過(guò)具體的MIC值解釋。

(二)方法設(shè)計(jì)需考慮的問(wèn)題

1.現(xiàn)行使用的微孔板法存在的問(wèn)題：技術(shù)專(zhuān)家小組對(duì)現(xiàn)有的商品化微孔板或定制微孔板的現(xiàn)狀尤其是存在的問(wèn)題進(jìn)行了匯總。全球應(yīng)用最多的是自2010年開(kāi)始商業(yè)化的稱(chēng)為SensititreTMMYCOTB或SensititreTMMYCOTBI的微孔板(簡(jiǎn)稱(chēng)“MYCOTB”)。該商品在我國(guó)也已經(jīng)獲得批準(zhǔn)使用。除了MYCOTB微孔板外，還分析了另外5種主要用于科研用途的由美國(guó)ThermoFisher公司提供的定制板，包含需要冷凍儲(chǔ)存及干燥形式的兩類(lèi)微孔板，藥品涵蓋12～14種。歐洲抗菌藥物敏感試驗(yàn)委員會(huì)(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)則推薦了非商品化微孔板法的標(biāo)準(zhǔn)參考方法。

MYCOTB在96孔微孔板中固定12種凍干的一線(xiàn)和二線(xiàn)抗結(jié)核藥物，但不包含A組和B組中的重要藥物，因此，無(wú)法界定更新的準(zhǔn)廣泛或廣泛耐藥結(jié)核病。此外，也沒(méi)有明確界定臨界濃度，從而無(wú)法給出敏感或耐藥分類(lèi)結(jié)果。某些藥品的濃度范圍設(shè)置也不合理，無(wú)法確保使用質(zhì)控菌株H37Rv獲得可靠的質(zhì)控結(jié)果，且MYCOTB說(shuō)明書(shū)中的質(zhì)控濃度范圍與美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)也不相同[6]。

除了藥物及濃度外，藥粉在幾種微孔板的存在形式(干燥或冷凍)、培養(yǎng)基的成分、接種菌懸液的配制流程及濃度、是否使用CO2孵育也不完全相同。

2.藥品數(shù)量設(shè)置需要考慮的問(wèn)題：基于藥物濃度范圍的需求、各組藥物重要性、同類(lèi)藥物中共同耐藥機(jī)制及交叉耐藥的情況，文件提出了優(yōu)化的同一微孔板的藥品數(shù)量上限。鑒于其他細(xì)菌病原體的質(zhì)控濃度范圍通常包括3～4個(gè)濃度，假設(shè)質(zhì)控范圍的上限對(duì)應(yīng)于所有藥物的臨界濃度，這意味著至少需要5～6個(gè)濃度才能確保質(zhì)控菌株H37Rv濃度范圍符合這一通用標(biāo)準(zhǔn)，即包括質(zhì)控范圍下限以下的一個(gè)濃度和臨界濃度以上的一個(gè)濃度。

技術(shù)專(zhuān)家小組承認(rèn)對(duì)于大多數(shù)抗結(jié)核藥物而言，細(xì)分藥物的耐藥水平在現(xiàn)階段更多的是科研用途而非臨床診斷，因此，不應(yīng)為了刻意引入額外的高于臨界濃度的臨床折點(diǎn)而舍棄其他藥物。但是對(duì)于以下這些藥物的臨床折點(diǎn)的作用已被WHO承認(rèn)或?qū)⒃诮谶M(jìn)行推薦，因此應(yīng)該納入。如左氧氟沙星(Lfx)應(yīng)至少包含臨界濃度(1 mg/L)以上的兩個(gè)濃度，以便作為Mfx高濃度耐藥檢測(cè)的替代。再如INH，目前利用基因型方法依據(jù)不同的耐藥基因及位點(diǎn)的突變可以進(jìn)行耐藥水平的區(qū)分，但表型藥敏試驗(yàn)并未設(shè)置臨床折點(diǎn)。如果要推薦一個(gè)濃度用于區(qū)分僅有inhA啟動(dòng)子區(qū)域突變的低水平耐藥和其他突變導(dǎo)致的高水平耐藥，其臨床折點(diǎn)可能需要設(shè)置在高于臨界濃度(0.125 mg/L)三個(gè)濃度的位置(如1 mg/L)。而如果認(rèn)為katGS315T突變的菌株也有可能獲益于高劑量INH治療，那么還需要增加額外更高的濃度。高劑量RFP治療也在評(píng)估中，對(duì)于臨界rpoB耐藥導(dǎo)致的輕微的MIC水平增高，增加RFP劑量可能有效。雖然這項(xiàng)評(píng)估結(jié)果預(yù)期短期內(nèi)無(wú)法獲得，但是包含ECOFF之上3～4個(gè)濃度有助于日常收集數(shù)據(jù)以便獲得更多的證據(jù)。另外，如果卡那霉素(Km)作為阿米卡星(Am)的替代，那么Km需要包含ECOFF之上的一個(gè)臨床折點(diǎn)濃度。

經(jīng)過(guò)分析各種藥物的特征，結(jié)合最新的結(jié)核病治療指南及藥物分組，在文件中列出了納入優(yōu)化后的微孔板的藥物優(yōu)先級(jí)別，分為非常高、高、中等、低、極低5個(gè)級(jí)別：(1)4種一線(xiàn)藥物除了乙胺丁醇為高外，其他均為非常高級(jí)別，但須注意吡嗪酰胺藥敏試驗(yàn)由于需要酸性培養(yǎng)基，因此不適合納入同一微孔板。(2)A組藥物中Lfx/Mfx、貝達(dá)喹啉(Bdq)、利奈唑胺(Lzd)均為非常高級(jí)別，同時(shí)提出Lfx耐藥檢測(cè)可作為Mfx耐藥檢測(cè)的替代。(3)B組藥物中氯法齊明(Cfz)屬于非常高級(jí)別，環(huán)絲氨酸(Cs)為高級(jí)別，特立齊酮(Trd)耐藥檢測(cè)可以使用Cs作為替代。(4)C組藥物中僅有德拉瑪尼(Dlm)是最高級(jí)別，乙硫異煙胺(Eto)為高[同時(shí)替代丙硫異煙胺(Pto)的耐藥檢測(cè)]，Am中等且推薦由Km的耐藥檢測(cè)替代，鏈霉素(Sm)、對(duì)氨基水楊酸(PAS)、亞胺培南-西司他丁(Imp-Cln)和美羅培南(Mpm)均為低優(yōu)先級(jí)別。(5)其他組別藥物中普瑞瑪尼(PMD)為非常高優(yōu)先級(jí)別，但目前并未建立相應(yīng)的方法，利福噴丁耐藥檢測(cè)可以由RFP替代，而利福布汀是極低級(jí)別，氧氟沙星等同于Lfx，Km可以作為Am的替代，卷曲霉素不需要納入。

綜合以上各個(gè)藥品優(yōu)先級(jí)別及替代檢測(cè)藥品，同時(shí)考慮判讀結(jié)果時(shí)讀板的簡(jiǎn)便性，認(rèn)為一塊96孔微孔板上最多能包含12種藥品，分別是RFP、INH、EMB、Lfx、Bdq、Lzd、Cfz、Cs、Dlm、Eto、PMD、Km。文中后續(xù)還列出每種藥品在結(jié)核病治療中的作用及地位，同時(shí)也指明了其藥敏試驗(yàn)存在的問(wèn)題和特點(diǎn)，并解釋了采用某些藥品替代另一種藥品藥敏試驗(yàn)的可行性及理由，但也指出了這種替代性方法存在潛在問(wèn)題和風(fēng)險(xiǎn)。

3.藥物位置布局及濃度設(shè)置的考慮問(wèn)題：文件推薦了臨時(shí)的藥物及濃度布局框架，但須注意這僅是現(xiàn)階段臨時(shí)推薦，仍然需要更多研究驗(yàn)證?，F(xiàn)階段推薦的藥物位置布局及濃度設(shè)置主要從以下幾方面考慮：(1)平衡對(duì)照孔放在左上角的好處及風(fēng)險(xiǎn)后，將陰性和2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照生長(zhǎng)放在最左上角。(2)96 孔微孔板每列設(shè)置一個(gè)藥品，以盡量減少結(jié)果判讀時(shí)的錯(cuò)誤。(3)對(duì)于重要性相對(duì)低的藥品如EMB、Eto，將其安排在微孔板的最外側(cè)，因?yàn)槿绻跤^(guò)程中由于液體蒸發(fā)而影響結(jié)果判讀時(shí)，相對(duì)其他藥品來(lái)說(shuō)這兩個(gè)藥品重要性要低一些。(4)與其他成熟的表型藥敏試驗(yàn)方法比，目前對(duì)于微孔板法的很多藥物的ECOFF仍缺乏全面和系統(tǒng)的評(píng)估。考慮到現(xiàn)階段各微孔板法的多樣性，文件提出需要著重考慮的因素包括：①盡可能考慮到藥物分組及共同的耐藥機(jī)制，如Lfx的ECOFF僅用于定義檢測(cè)Lfx耐藥和低水平Mfx耐藥，而臨床折點(diǎn)僅作為Mfx高水平耐藥檢測(cè)的替代。Km的ECOFF為4 mg/L，但僅作為參考，臨床已很少應(yīng)用Km，8 mg/L 的臨床折點(diǎn)濃度將用作Am耐藥性檢測(cè)的替代。②新型藥物的ECOFF值并不完全確定。Bdq的ECOFF目前也有不同的觀點(diǎn)，如0.125 mg/L和0.25 mg/L。而對(duì)于Lzd，冷凍藥物微孔板的ECOFF為2 mg/L，但1 mg/L似乎更適合干燥的藥物微孔板。Lzd的H37Rv的質(zhì)控范圍也需要更多研究，因其似乎比臨床菌株更加耐藥。Cfz、Cs的ECOFF目前也不是十分確定?？紤]到Dlm的pWT的MIC分布≤0.008 mg/L，其目前的臨界濃度0.125 mg/L似乎太高，因此，為了更好定義pWT的MIC分布下限并設(shè)置質(zhì)控范圍/目標(biāo)，微孔板需要包括低至至少0.002 mg/L的濃度?？梢灶A(yù)期的是，一旦確定了質(zhì)控范圍的下限，Dlm的濃度范圍也將被重新優(yōu)化。(5)雖然PMD的優(yōu)先級(jí)別非常高，但迄今為止對(duì)該藥品僅在MGIT 960系統(tǒng)中進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)。目前建議的濃度范圍僅作為評(píng)估在凍干藥粉微孔板方法中與MGIT相比是否匹配及在多大程度上偏移的初始濃度范圍。因此，現(xiàn)階段尚無(wú)推薦的臨界濃度。(6)對(duì)于Bdq和Cfz包含了ECOFF之上的2個(gè)或3個(gè)濃度以促進(jìn)對(duì)Rv0678突變菌株的解釋。先前的研究對(duì)pWT分布進(jìn)行建模時(shí)，未排除Rv0678突變菌株，而Rv0678突變導(dǎo)致mmpL5-mmpS5外排泵的高表達(dá)，如果泵是有活性的，表型非野生型菌株的MIC分布將會(huì)與pWT分布的右端重疊，從而可能導(dǎo)致高估pWT的MIC分布的第99百分位的濃度。

(三)方法學(xué)及結(jié)果判讀優(yōu)化考慮事宜

1.方法學(xué)方面：文件中通過(guò)對(duì)現(xiàn)有商品化微孔板及其他方法的回顧發(fā)現(xiàn)方法學(xué)多種多樣。因此，提出幾項(xiàng)非常細(xì)節(jié)的措施以確保高質(zhì)量檢測(cè)：(1)推薦藥物采用干燥而非冷凍形式，減少運(yùn)輸對(duì)于冷鏈的需求。(2)使用U形底微孔板便于縮短閱讀時(shí)間，微孔板材質(zhì)應(yīng)由聚苯乙烯制成，以確保Bdq和Cfz可以準(zhǔn)確測(cè)試，并且其表面應(yīng)未經(jīng)處理。不同類(lèi)型的聚苯乙烯可能會(huì)影響一些藥物的MIC，故更換微孔板供應(yīng)商也應(yīng)受到監(jiān)控。(3)微孔板應(yīng)覆蓋半滲透密封膜，以提高生物安全性并最大限度地減少蒸發(fā)。(4)設(shè)置1個(gè)陰性生長(zhǎng)對(duì)照孔及2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照孔(分別是100%和1%的接種菌懸液)。從視覺(jué)上突出顯示這3個(gè)孔(例如用不同顏色圈畫(huà)出)將最大限度地減少加液錯(cuò)誤。在微孔板上顯示每列藥品的縮寫(xiě)名稱(chēng)可以最大限度地減少主觀讀板錯(cuò)誤。最后，在板上標(biāo)記臨界濃度或臨床折點(diǎn)有助于將注意力集中在這些閾值附近的孔的生長(zhǎng)，當(dāng)然這也可能導(dǎo)致一些偏倚。(5)微孔板法使用的7H9-OADC培養(yǎng)基不得含有孔雀綠，培養(yǎng)基嚴(yán)禁包括丙氨酸，因?yàn)闀?huì)干擾Cs抗菌活性。也不能使用吐溫-80，會(huì)影響MIC值。當(dāng)前使用的甘油可繼續(xù)應(yīng)用，但需要繼續(xù)研究不包括丙酮酸時(shí)對(duì)于非洲分枝桿菌和動(dòng)物適應(yīng)性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群其他成員生長(zhǎng)的影響。(6)某些藥品必須使用二甲基亞砜(DMSO)來(lái)制備儲(chǔ)存液和隨后的稀釋液，確保藥品不發(fā)生沉淀(如Bdq和Cfz)?？紤]到移液器頭并不是聚苯乙烯材質(zhì)，故藥品稀釋步驟的多少可能也會(huì)產(chǎn)生影響。(7)使用符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織要求的濃度(即基于1 mg/L 的2倍稀釋系列)，并且必須能夠使用H37Rv進(jìn)行質(zhì)控測(cè)試來(lái)定義質(zhì)控范圍和目標(biāo)。(8)與比例法相比，微孔板法更容易出現(xiàn)接種菌懸液量的波動(dòng)，可采取一系列措施來(lái)減少這種波動(dòng)。如使用校準(zhǔn)的濁度儀制備0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，每次或定期進(jìn)行細(xì)菌單克隆計(jì)數(shù)，制備菌懸液后應(yīng)進(jìn)行沉淀并將上清轉(zhuǎn)移至新管再比濁，以減少大塊菌落的干擾，減少生物安全風(fēng)險(xiǎn)。(9)由新鮮MGIT陽(yáng)性培養(yǎng)物進(jìn)行微孔板法的方法尚未成熟，使得微孔板法常規(guī)臨床的應(yīng)用價(jià)值受到限制(因需要在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的傳代培養(yǎng)，從而更加延長(zhǎng)結(jié)果報(bào)告時(shí)間)。(10)如果按照CLSI要求使用CO2將會(huì)阻礙該方法推廣使用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)基層實(shí)驗(yàn)室不具備CO2氣體，因此，微孔板法應(yīng)在普通空氣環(huán)境孵育下進(jìn)行更多的驗(yàn)證。未使用CO2可能會(huì)導(dǎo)致部分菌株在第21天沒(méi)有顯示出足夠的生長(zhǎng)，但通過(guò)與1%生長(zhǎng)對(duì)照進(jìn)行比較，將會(huì)減少出現(xiàn)假陰性結(jié)果。(11)接種后第2或第3天應(yīng)檢查微孔板是否被快速生長(zhǎng)的微生物污染，以避免不必要的延誤。

2.結(jié)果判讀：關(guān)于結(jié)果判讀，雖然WHO目前將MIC定義為“在固體培養(yǎng)基或肉湯稀釋藥敏試驗(yàn)中，能夠阻止99%以上微生物生長(zhǎng)的抗菌劑的最低濃度”。但其他大多數(shù)病原菌定義為抑制肉眼所有可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低濃度(以下稱(chēng)為“視覺(jué)臨界比例”)，而且所有美國(guó)ThermoFisher公司生產(chǎn)的微孔板，EUCAST推薦的參考方法及其他病原體的微孔板均以后者為準(zhǔn)。因?yàn)榧词乖诜跤Y(jié)束時(shí)添加染料通過(guò)顯色法判讀，也無(wú)法用肉眼對(duì)1%的生長(zhǎng)程度進(jìn)行準(zhǔn)確界定。此外，出于生物安全考慮，應(yīng)避免使用顯色法，因?yàn)樾枰未蜷_(kāi)培養(yǎng)陽(yáng)性的板子。另外，染料測(cè)試的是代謝活動(dòng)，與觀察生長(zhǎng)比較，染料不一定產(chǎn)生與視覺(jué)判讀生長(zhǎng)可比的結(jié)果。

當(dāng)然，對(duì)于MTB來(lái)說(shuō)，選擇1%的臨界比例仍有其作用，如為了增加重復(fù)性，且這個(gè)臨界比例代表低于這個(gè)界值的耐藥菌株占比與臨床治療效果不存在相關(guān)性，但是同時(shí)技術(shù)專(zhuān)家組也承認(rèn)至少對(duì)于新藥來(lái)說(shuō)，沒(méi)有明確的證據(jù)表明更低比例耐藥菌占比用該藥物治療時(shí)有反應(yīng)，而高于1%則是治療無(wú)反應(yīng)。盡管1%的臨界比例看起來(lái)具有任意性，且沒(méi)有明確的臨床證據(jù)表明1%是最佳臨界比例，但技術(shù)專(zhuān)家小組同意微孔板法需要有一個(gè)約1%耐藥比例的檢測(cè)限。為了達(dá)到這一目的，推薦了EUCAST微孔板法中的關(guān)于讀取MIC的方法，使用濁度計(jì)進(jìn)行菌懸液的準(zhǔn)確定量，確保1%生長(zhǎng)對(duì)照能在21 d內(nèi)生長(zhǎng)。此舉主要目的是盡量減少接種量的不確定性，并確保僅在生長(zhǎng)對(duì)照足夠時(shí)讀板以檢測(cè)低頻率異質(zhì)性耐藥。此外，大家一致認(rèn)為應(yīng)該在1%和100%對(duì)照孔陽(yáng)性但陰性對(duì)照不生長(zhǎng)時(shí)的最早的時(shí)間點(diǎn)讀板。具體來(lái)說(shuō)，建議在第7、14和21天，而不是美國(guó)ThermoFisher公司目前推薦的第10天和第21天的組合，因考慮到如果周末無(wú)法判讀結(jié)果，原定的第10天讀板可能會(huì)因?yàn)檠舆t影響結(jié)果的判讀。選擇最早時(shí)間點(diǎn)讀板是為了盡量減小理論上設(shè)定的1%比例和實(shí)際視覺(jué)臨界比例的差異引起的MIC偏移的樣本比例。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的表型藥敏試驗(yàn)都是從包含多個(gè)菌落的具有異質(zhì)性的陽(yáng)性培養(yǎng)物而不是從純化的單一的菌落中進(jìn)行的。

二、微孔板微量肉湯稀釋法藥敏試驗(yàn)在我國(guó)應(yīng)用現(xiàn)狀及建議

該文件認(rèn)為除吡嗪酰胺外，所有關(guān)鍵的抗結(jié)核藥物都可以排列在一個(gè)96孔板上，同時(shí)滿(mǎn)足必要的質(zhì)控要求。但還存在一系列懸而未決的問(wèn)題，包括替代藥物檢測(cè)的準(zhǔn)確性等。技術(shù)專(zhuān)家組認(rèn)為按照目前的共識(shí)而設(shè)計(jì)的微孔板法并經(jīng)過(guò)持續(xù)的驗(yàn)證后，與其他方法一樣基于對(duì)所有可用證據(jù)的全面綜合和評(píng)估，證明該方法能夠有效檢測(cè)出最重要的抗結(jié)核藥物與臨床顯著相關(guān)的耐藥性后，微孔板法可以得到WHO的認(rèn)可。

雖然目前微孔板法并未經(jīng)WHO推薦，但微孔板法已在包括我國(guó)在內(nèi)的許多地區(qū)使用。目前我國(guó)應(yīng)用的MTB耐藥性檢測(cè)商品化產(chǎn)品主要來(lái)自于4個(gè)廠(chǎng)商，除了MYCOTB板是進(jìn)口商品外，其余3種均為國(guó)內(nèi)產(chǎn)品。通過(guò)查閱分析其操作說(shuō)明，4種商品包含藥物種類(lèi)差異很大，濃度范圍設(shè)置更是不盡相同，操作方法包括讀板及結(jié)果報(bào)告也都不同。結(jié)合2021年我國(guó)表型藥敏試驗(yàn)熟練度測(cè)試中使用微孔板法的實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用不同的微孔板產(chǎn)品在熟練度測(cè)試的藥物顯示了較好的結(jié)果，即耐藥/敏感檢出結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的一致率較高。但是考慮到熟練度測(cè)試的菌株選取的是MIC值低的敏感株和MIC值高的耐藥菌株，不存在MIC的重疊，因此，在檢測(cè)臨床分離菌株，尤其是某些臨界突變導(dǎo)致耐藥的菌株時(shí)，可能會(huì)發(fā)生漏檢或誤判。其次，熟練度測(cè)試菌株中對(duì)于新藥的耐藥菌株非常少，高一致率可能掩蓋由于濃度范圍不適宜引起的潛在問(wèn)題。

鑒于目前我國(guó)仍缺乏微孔板法標(biāo)準(zhǔn)化的方法，因此，建議我國(guó)首先對(duì)現(xiàn)有商品化產(chǎn)品進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估，并且評(píng)估時(shí)應(yīng)選取有代表性的菌株和病例進(jìn)行多中心評(píng)估。其次，建立國(guó)內(nèi)的微孔板法標(biāo)準(zhǔn)化指南或者共識(shí)，參與制定人員應(yīng)包含實(shí)驗(yàn)室及臨床方面的專(zhuān)家。再次，廠(chǎng)商進(jìn)行產(chǎn)品設(shè)計(jì)時(shí)宜參考WHO優(yōu)化原則，同時(shí)也要參考我國(guó)臨床需要，并根據(jù)治療藥物的更新，對(duì)商品的上市后使用情況進(jìn)行隨訪(fǎng)評(píng)估。最后，更重要的是我國(guó)科研及醫(yī)療工作者和廠(chǎng)商應(yīng)積極協(xié)作產(chǎn)出自主的產(chǎn)品，并為全球提供科學(xué)、系統(tǒng)的中國(guó)證據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)夏輝：直接參與(醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn))、文章撰寫(xiě)(起草文章、對(duì)文章的知識(shí)性?xún)?nèi)容作批評(píng)性審閱)、工作支持(指導(dǎo))；鄭揚(yáng)：文章撰寫(xiě)(起草文章)、工作支持(支持性貢獻(xiàn))；宋媛媛：工作支持(行政、技術(shù)或材料支持)