結(jié)核分枝桿菌感染的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

賈紅彥 董靜 張宗德 潘麗萍

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)估算，全球約1/4的人口感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)[1]。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，MTB感染比例較高，約為20%[2-3]。WHO呼吁2035年消除結(jié)核病需要對(duì)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)進(jìn)行干預(yù)。然而，LTBI的診斷仍缺乏金標(biāo)準(zhǔn)，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是實(shí)現(xiàn)MTB感染診斷的主要方法。此外，結(jié)核病的確診需要依靠病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查，但并非所有結(jié)核病患者都能夠獲得病原學(xué)診斷依據(jù)。據(jù)2018年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)肺結(jié)核患者的病原學(xué)陽(yáng)性率不足40%，肺外結(jié)核病原學(xué)陽(yáng)性率更低[4]。根據(jù)最新的《肺結(jié)核診斷》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，依賴于免疫學(xué)檢測(cè)的MTB感染診斷結(jié)果已經(jīng)成為重要的結(jié)核病輔助診斷依據(jù)。

宿主免疫系統(tǒng)與MTB的相互作用決定了MTB感染機(jī)體的結(jié)局。MTB入侵宿主后引發(fā)的免疫病理反應(yīng)及抗結(jié)核免疫應(yīng)答反應(yīng)是開(kāi)發(fā)免疫學(xué)診斷技術(shù)的基礎(chǔ)，參與免疫應(yīng)答不同階段(天然免疫和適應(yīng)性免疫)的各類細(xì)胞亞型、細(xì)胞因子、趨化因子、抗體等，都是潛在的免疫學(xué)診斷靶標(biāo)。筆者主要對(duì)已經(jīng)應(yīng)用于臨床實(shí)踐的免疫學(xué)診斷技術(shù)原理、應(yīng)用現(xiàn)狀，以及處于研發(fā)和探索階段的免疫學(xué)診斷技術(shù)的預(yù)期應(yīng)用潛力進(jìn)行簡(jiǎn)要概述。

一、應(yīng)用于臨床的MTB感染檢測(cè)技術(shù)

1. 血清學(xué)診斷：血清學(xué)診斷是以宿主感染MTB后的體液免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)，檢測(cè)MTB抗原或抗體，主要基于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、酶聯(lián)免疫膠體金滲濾法、膠體金免疫層析法、蛋白芯片技術(shù)等。由于具有操作簡(jiǎn)單快速、實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求低、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，曾經(jīng)是我國(guó)結(jié)核病診斷的重要輔助手段。但是，2011年WHO對(duì)94項(xiàng)商業(yè)化結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，認(rèn)為血清學(xué)檢測(cè)試劑的敏感度(0%～100%)和特異度(31%～100%)變化巨大，存在大量假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，故不推薦使用[5]。WHO的上述建議直接影響血清學(xué)診斷在臨床中的應(yīng)用。血清學(xué)診斷不確定性的原因復(fù)雜，可能與抗原選擇及生產(chǎn)工藝差別有關(guān)。

目前，有多項(xiàng)研究提示結(jié)核抗原檢測(cè)對(duì)于結(jié)核病的診斷是有價(jià)值的，包括脂阿拉伯甘露聚糖抗原(lipoarabinomannan，LAM)、早期分泌抗原靶蛋白6(early secretory antigentic target 6，ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)、Ag85抗原復(fù)合物及MPT64抗原等[6]。國(guó)際研發(fā)的基于LAM抗原的側(cè)向流動(dòng)型尿液檢測(cè)，在HIV感染人群中診斷敏感度較高，而且隨著CD4+T細(xì)胞數(shù)量降低，診斷敏感度優(yōu)勢(shì)越發(fā)明顯[7]。WHO根據(jù)國(guó)際多中心研究數(shù)據(jù)分別于2015年和2019年制定和修訂了關(guān)于尿液LAM檢測(cè)的建議，推薦在HIV感染人群中使用。

WHO雖然在2011年否定了當(dāng)時(shí)商業(yè)化血清學(xué)診斷試劑盒的應(yīng)用，但并未限制結(jié)核新型抗原和新的診斷標(biāo)識(shí)物的研究，當(dāng)前的臨床診斷現(xiàn)狀也迫切需要發(fā)現(xiàn)新型抗原和分子標(biāo)識(shí)物。通過(guò)客觀準(zhǔn)確的鑒定和評(píng)價(jià)體系篩選合適的抗原或抗原組合是未來(lái)血清學(xué)檢測(cè)發(fā)展的方向和關(guān)鍵[8-9]。

2. 皮膚試驗(yàn)：結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin test，TST)基于遲發(fā)型超敏反應(yīng)，已沿用上百年。在未出現(xiàn)更先進(jìn)的免疫學(xué)診斷技術(shù)前，TST檢測(cè)是檢測(cè)MTB感染的重要工具，也是結(jié)核病的重要輔助診斷工具。但是，由于傳統(tǒng)的結(jié)核菌素使用結(jié)核菌素純蛋白衍生物，因此容易與卡介苗或非結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致特異度低。研究提示，在未接種卡介苗的人群中，TST檢測(cè)的特異度可以達(dá)到97%，但在接種卡介苗的人群中，TST檢測(cè)的特異度僅為59%，臨床應(yīng)用受限[10]。

目前，國(guó)內(nèi)外都在研發(fā)新型皮膚變態(tài)反應(yīng)原。一項(xiàng)在南非開(kāi)展的臨床試驗(yàn)提示，新型C-Tb皮膚試驗(yàn)，使用ESAT-6和CFP-10抗原混合物，在結(jié)核病患者中的診斷敏感度(73.9%)與γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)持平(75.1%)，在健康人群中的特異度(99.3%)明顯高于傳統(tǒng)TST(76.9%)，與IGRA檢測(cè)持平(100%)[11]。國(guó)內(nèi)也有類似研究，將ESAT-6和CFP-10融合蛋白(EC)作為變態(tài)反應(yīng)原，替代原來(lái)使用的結(jié)核菌素純蛋白衍生物。臨床試驗(yàn)提示，EC蛋白在診斷MTB感染中能夠排除卡介苗干擾，優(yōu)于傳統(tǒng)TST，與IGRA檢測(cè)結(jié)果有良好的一致性，已獲得國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用許可[12]。新型皮膚試驗(yàn)的研發(fā)為MTB感染診斷和結(jié)核病輔助診斷提供了新的方法。得益于其操作便利性和技術(shù)要求低等優(yōu)點(diǎn)，更適合在結(jié)核病基層防控機(jī)構(gòu)推廣實(shí)施。

3. IGRA：IGRA是以宿主感染MTB后的細(xì)胞免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)，通過(guò)檢測(cè)MTB特異抗原刺激后釋放 γ-干擾素(IFN-γ)的特異性淋巴細(xì)胞數(shù)量(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法，ELISPOT)或直接檢測(cè)IFN-γ水平(酶聯(lián)免疫吸附法，ELISA)來(lái)判斷機(jī)體是否感染MTB，是目前診斷MTB感染的有效工具，也是診斷結(jié)核病的重要輔助工具。IGRA技術(shù)于2001年獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)，延用至今，期間不斷有進(jìn)口試劑盒的更新?lián)Q代和各類國(guó)產(chǎn)試劑盒的問(wèn)世。

不同國(guó)家和地區(qū)也對(duì)該技術(shù)在各類人群中的診斷價(jià)值給予了較完善的評(píng)估。由于納入MTB特異抗原ESAT-6和CFP-10，該技術(shù)能夠排除卡介苗的干擾，對(duì)于MTB感染的診斷效果較好[13]。基于IGRA檢測(cè)獲得的全球及我國(guó)LTBI率均明顯低于TST[2]。該技術(shù)在活動(dòng)性結(jié)核病患者中的診斷敏感度優(yōu)于TST檢測(cè)，陰性預(yù)測(cè)值較好，但由于無(wú)法與LTBI進(jìn)行鑒別，在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中的診斷特異度較低，常用于結(jié)核病患者的排除，而非納入。在結(jié)核病低負(fù)擔(dān)國(guó)家，該技術(shù)的診斷敏感度和特異度均優(yōu)于TST檢測(cè)，對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病的診斷幫助較大[14]。在結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)方面，盡管IGRA檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值略高于TST檢測(cè)，但依然無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)結(jié)核病發(fā)病[15]。在兒童群體中，薈萃分析提示IGRA檢測(cè)和TST檢測(cè)基本一致，并未表現(xiàn)出更好的診斷性能，因此并不推薦以IGRA替代TST用于兒童結(jié)核病的輔助診斷[16]。但是，IGRA檢測(cè)在HIV感染、自身免疫疾病和器官移植人群的診斷敏感度優(yōu)于TST，臨床實(shí)踐中建議單用IGRA檢測(cè)或者聯(lián)用TST檢測(cè)，優(yōu)先使用基于ELISPOT方法的檢測(cè)[13]。

IGRA檢測(cè)主要適用于外周血檢測(cè)，但也有研究探索了該技術(shù)在不同體液中的應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)基于ELISPOT方法的IGRA檢測(cè)的診斷性能優(yōu)于基于ELISA方法的IGRA檢測(cè)[13,17]。近年來(lái)，有研究提出可應(yīng)用IGRA檢測(cè)中結(jié)核特異抗原免疫應(yīng)答與陽(yáng)性抗原免疫應(yīng)答的比值(TBAg/PHA ratio)作為鑒別活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的指標(biāo)，但仍需要基于前瞻性大樣本隊(duì)列對(duì)該比值進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)[18-19]。在臨床實(shí)踐中，存在一定比例(5%～20%)的確診結(jié)核病患者的IGRA檢測(cè)結(jié)果為陰性，原因比較復(fù)雜，包括高齡、HIV感染、免疫抑制狀態(tài)、疾病進(jìn)程、外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量低、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和人類白細(xì)胞抗原(HLA)分型等，其中外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量低主要影響基于ELISA方法的IGRA檢測(cè)結(jié)果[20]。

當(dāng)前也有一些研究試圖通過(guò)改變IGRA檢測(cè)中的特異性抗原，獲得更好的診斷性能[21]。最近的一項(xiàng)研究在聯(lián)用原有ESAT-6和CFP-10基礎(chǔ)上，依次加入新抗原Rv3615c和Rv3879c，雖然敏感度較結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)有所提升，但特異度也相應(yīng)下降，并沒(méi)有表現(xiàn)出更好的診斷性能[22]。QuantiFERON-TB Gold plus診斷試劑納入了針對(duì)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗原，希望提升診斷敏感度，實(shí)現(xiàn)不同感染狀態(tài)的鑒別診斷。但基于目前對(duì)其價(jià)值評(píng)估的薈萃分析數(shù)據(jù)，并沒(méi)有體現(xiàn)出鑒別診斷結(jié)核病和LTBI的能力，但其診斷結(jié)核病和MTB感染的敏感度略高于其他QuantiFERON-TB診斷試劑[23-24]。對(duì)于改良型IGRA檢測(cè)的研究，未來(lái)可能需要嘗試更多的新型抗原。

4. 干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(interferon gamma-induced protein 10，IP-10)：在活動(dòng)性結(jié)核病早期診斷標(biāo)識(shí)物的研究中，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者外周血中存在一種高表達(dá)的細(xì)胞因子，即IP-10。IP-10主要來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，是IFN-γ免疫應(yīng)答通路中一個(gè)高表達(dá)的CXC家族趨化因子，與IFN-γ受到同一信號(hào)通路的調(diào)控[25]。

有研究證實(shí)，將QuantiFERON-TB Gold試劑盒(IGRA的一種)中的檢測(cè)靶標(biāo)替換成IP-10蛋白，也適合于MTB特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)[26]。薈萃分析提示，靶向IP-10蛋白檢測(cè)用于診斷結(jié)核病的敏感度和特異度可達(dá)到86%(95%CI：80%～90%)和88%(95%CI：82%～92%)，對(duì)LTBI的診斷敏感度和特異度分別為85%(95%CI：80%～88%)和89%(95%CI：84%～92%)[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核特異抗原刺激后2.5～8 h內(nèi)，IP-10 mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)明顯高于IFN-γ，而且能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定的高表達(dá)。因此，IP-10 mRNA可能更適合作為MTB特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)的靶標(biāo)[29]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于IP-10 mRNA檢測(cè)用于MTB感染診斷或結(jié)核病輔助診斷的研究有限。國(guó)外一項(xiàng)研究平行比較了IGRA檢測(cè)、IP-10蛋白檢測(cè)和IP-10 mRNA檢測(cè)在MTB感染中的診斷價(jià)值，發(fā)現(xiàn)結(jié)核特異抗原刺激后的IP-10 mRNA檢測(cè)的診斷特異度與IGRA檢測(cè)和IP-10蛋白檢測(cè)基本一致，但是敏感度略低于其他兩個(gè)靶標(biāo)[30]，這可能與結(jié)核抗原刺激時(shí)間的選擇以及RNA提取方案有關(guān)。通常情況下，mRNA轉(zhuǎn)錄窗口期較短，較長(zhǎng)時(shí)間的抗原刺激后可能已進(jìn)入IP-10蛋白累積階段，mRNA含量下降。因此，鎖定恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)核抗原刺激時(shí)間，捕獲處于高表達(dá)狀態(tài)的mRNA對(duì)于提高檢測(cè)性能至關(guān)重要。國(guó)內(nèi)也有研究分析了IP-10 mRNA 的檢測(cè)性能，以結(jié)核特異抗原刺激后4 h作為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，IP-10 mRNA檢測(cè)與IGRA檢測(cè)在診斷MTB感染中獲得了基本一致的敏感度和特異度，在HIV與MTB雙重感染者中表現(xiàn)出更高的診斷敏感度和更低的不確定結(jié)果獲得率[25,31]。

5. IFN-γ/白細(xì)胞介素(IL)-2雙因子檢測(cè)：IL-2是重要的Th1類細(xì)胞因子之一，既往研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核抗原刺激外周血淋巴細(xì)胞后，MTB感染者中IL-2表達(dá)量較未感染者明顯升高。薈萃分析提示，在IFN-γ基礎(chǔ)上增加IL-2檢測(cè)可以提高M(jìn)TB感染的檢出率[32]。Suzukawa等[33]發(fā)現(xiàn)，包括IFN-γ和IL-2在內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞因子均與結(jié)核病相關(guān)，且聯(lián)合檢測(cè)IFN-γ和IL-2的受試者工作特征曲線下面積(AUC)大于其他因子的聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果。這些研究均提示IFN-γ和IL-2 聯(lián)合檢測(cè)可以提高結(jié)核病的檢出率。

然而，關(guān)于IFN-γ和IL-2聯(lián)合用于活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI鑒別診斷的價(jià)值，一直存在爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為，IGRA檢測(cè)上清中IFN-γ/IL-2比值有助于鑒別診斷結(jié)核病和LTBI[34]，也有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間刺激后(72 h)增加IL-2檢測(cè)可幫助鑒別診斷結(jié)核病和LTBI[35]。也有一些不一致結(jié)果，顯示聯(lián)合檢測(cè)IFN-γ和IL-2并不能鑒別診斷結(jié)核病和LTBI[36]。國(guó)內(nèi)2020年上市的IFN-γ/IL-2雙因子檢測(cè)試劑盒，在常規(guī)IGRA檢測(cè)中增加IL-2檢測(cè)，臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)提示增加IL-2可提高M(jìn)TB感染的診斷敏感度，但未提及關(guān)于結(jié)核病和LTBI的鑒別診斷。因此，對(duì)于IFN-γ和IL-2聯(lián)用的價(jià)值，尚需要在前瞻性大樣本中做進(jìn)一步評(píng)估。此外，國(guó)外開(kāi)發(fā)的基于Ala-DH抗原刺激下的IL-2檢測(cè)試劑，在成人和兒童的活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI鑒別診斷中表現(xiàn)出較好的敏感度(100%)和特異度(96%和81%)，提示開(kāi)發(fā)基于新型結(jié)核抗原刺激下的多因子檢測(cè)，可能有希望實(shí)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的診斷[37-38]。

6. B細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)：B 細(xì)胞ELISPOT可用來(lái)直接計(jì)數(shù)抗體分泌細(xì)胞和長(zhǎng)期記憶B細(xì)胞，是分析抗體免疫反應(yīng)的有力工具，并且是僅有的少數(shù)能直接聚焦于抗體分泌細(xì)胞(antibody-secreting cell，ASC)的分析方法之一。B細(xì)胞ELISPOT能在10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)抗原特異性B細(xì)胞進(jìn)行定量檢測(cè)，因而具有極高的敏感度[39]。相對(duì)于常用的細(xì)胞流式檢測(cè)技術(shù)而言，B細(xì)胞ELISPOT技術(shù)能夠幫助研究人員識(shí)別樣品中的ASC，并測(cè)量其總數(shù)以及那些對(duì)特定抗原分泌抗體的細(xì)胞數(shù)量，目前主要用于檢測(cè)B細(xì)胞對(duì)感染的反應(yīng)和疫苗引發(fā)的反應(yīng)。研究表明，卡介苗接種人群中由卡介苗引發(fā)的MTB特異的記憶性B細(xì)胞比例明顯高于未接種者[40]。在MTB感染及結(jié)核病的診斷中，相對(duì)于T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫而言，對(duì)B細(xì)胞及其抗體在結(jié)核免疫中作用的研究相對(duì)較少。早期研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性結(jié)核病患者中存在功能缺陷的B細(xì)胞亞群，表現(xiàn)為增殖受限、抗體及細(xì)胞因子釋放受損等，提示B細(xì)胞在結(jié)核病免疫應(yīng)答中起著重要作用[41]。Gindeh等[42]利用B細(xì)胞ELISPOT技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者外周血中ESAT-6/CFP-10特異的漿母細(xì)胞比例明顯高于密切接觸者及LTBI者，而且在抗結(jié)核治療后明顯降低，提示B細(xì)胞ELISPOT技術(shù)用于診斷結(jié)核病的潛在價(jià)值。另一項(xiàng)研究也提示活動(dòng)性結(jié)核病患者中存在較高水平的卡介苗特異的IgG+漿母細(xì)胞，其與LTBI者和非結(jié)核病患者間的比例差異明顯，可作為活動(dòng)性結(jié)核病診斷的分子標(biāo)識(shí)[43]。但是由于目前關(guān)于B細(xì)胞各亞群在宿主抗結(jié)核免疫應(yīng)答中的作用并未完全闡明，因此目前B細(xì)胞ELISPOT檢測(cè)技術(shù)用于結(jié)核病診斷的價(jià)值研究仍然需要進(jìn)一步深入探討。

二、新型MTB感染檢測(cè)靶標(biāo)和技術(shù)的研發(fā)進(jìn)展

1. 細(xì)胞因子檢測(cè)：新的診斷技術(shù)需要新的靶標(biāo)，國(guó)內(nèi)外研究者一直致力于探尋除IFN-γ之外的其他因子，希望通過(guò)單獨(dú)或綜合檢測(cè)的方式來(lái)提高結(jié)核病或MTB感染的診斷能力。到目前為止，納入評(píng)估的細(xì)胞因子超過(guò)100種，包括白細(xì)胞介素類(IL1α/β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27等)、趨化因子類(CXCL家族、CXCR家族、MIP-1α/β、MCP、RANTES、I-309 等)，以及其他細(xì)胞因子(TNF-α、VEGF、GM-CSF、G-CSF、MMP-9、TGF-β等)。一項(xiàng)薈萃分析對(duì)56項(xiàng)研究進(jìn)行了綜合分析，其中研究最多的是IFN-γ、IL-2、TNF-α、IP-10、IL-10和IL-13。盡管多數(shù)研究認(rèn)為各類細(xì)胞因子具有鑒別診斷結(jié)核病和LTBI的潛質(zhì)，但各研究之間的異質(zhì)性很高，并沒(méi)有得到非常統(tǒng)一的結(jié)果[44]。分析原因，可能與各研究入組人群、研究設(shè)計(jì)、樣本性質(zhì)及檢測(cè)方法有關(guān)。未來(lái)針對(duì)結(jié)核抗原特異細(xì)胞因子的研究，應(yīng)該基于更加成熟的設(shè)計(jì)，分別在兒童和成人群體中單獨(dú)分析。

2. 多功能淋巴細(xì)胞亞型：細(xì)胞免疫應(yīng)答在MTB感染引起的宿主適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中起到重要作用。結(jié)核抗原刺激后的T淋巴細(xì)胞，因分泌多種細(xì)胞因子而被認(rèn)為是多功能細(xì)胞(poly-functional T cells)，表現(xiàn)為不同的細(xì)胞亞型和功能。在結(jié)核病研究中發(fā)現(xiàn)，分泌不同細(xì)胞因子的多功能T細(xì)胞亞型的數(shù)目和比例可能與不同的MTB感染狀態(tài)相關(guān)[45]。早在2011年，Harari等[46]發(fā)現(xiàn)，單分泌TNF-α的CD4+T細(xì)胞數(shù)目在LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病中的比例存在明顯差異，而且在治療后明顯降低，可能是鑒別診斷活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的標(biāo)識(shí)物。Rozot等[47]構(gòu)建了基于單分泌TNF-α的CD4+T細(xì)胞比例和結(jié)核抗原特異的CD8+T細(xì)胞數(shù)目的診斷模型，可用于活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的鑒別診斷。其后多項(xiàng)研究提示，針對(duì)釋放IFN-γ和TNF-α的多功能淋巴細(xì)胞檢測(cè)有助于活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的診斷和鑒別診斷[48-49]。也有研究發(fā)現(xiàn)，釋放IFN-γ并表達(dá)CD38、HLA-DR、Ki-67蛋白的CD4+T細(xì)胞能夠鑒別診斷活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI，而且可能作為監(jiān)測(cè)治療效果的標(biāo)識(shí)物[50]。目前看來(lái)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀或者多色免疫熒光技術(shù)檢測(cè)特異性抗原刺激后釋放多種細(xì)胞因子的淋巴細(xì)胞亞型，對(duì)于實(shí)現(xiàn)MTB感染的診斷，甚至是活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的鑒別診斷可能具有較好的意義，但至今尚無(wú)相關(guān)的診斷試劑用于臨床實(shí)踐[51]。

3. 新型生物標(biāo)識(shí)物：通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)篩選活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的宿主免疫應(yīng)答標(biāo)識(shí)物，是開(kāi)發(fā)新型免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重要源動(dòng)力。2006年，Agranoff等[52]率先采用表面增強(qiáng)激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)篩選獲得了結(jié)核病血漿特異蛋白，并基于支持向量機(jī)數(shù)學(xué)模型構(gòu)建了由20個(gè)蛋白組成的結(jié)核病診斷模型。到目前為止，全球研究者開(kāi)展了至少20余項(xiàng)結(jié)核病高通量特異蛋白組研究，篩選獲得了上百種宿主蛋白，具有結(jié)核病診斷和鑒別診斷的潛在價(jià)值，近5年就有10余項(xiàng)研究(表1)。然而，早期的大多數(shù)研究止步于系統(tǒng)篩選階段，近年來(lái)的少數(shù)研究才開(kāi)展了診斷模型構(gòu)建和盲法驗(yàn)證，但仍無(wú)確定的生物標(biāo)識(shí)物達(dá)到臨床應(yīng)用階段。其中比較有代表性的包括：De Groote等[53]應(yīng)用不同數(shù)學(xué)模型在722個(gè)候選蛋白中獲得了一組蛋白診斷模型，在三組不同人群中分別獲得了較好的診斷價(jià)值(AUC為 0.89～0.94)；Yang等[54]開(kāi)展了一項(xiàng)基于蛋白芯片中640個(gè)蛋白的篩選和驗(yàn)證，最終獲得了一組由8個(gè)蛋白組成的、可有效區(qū)分結(jié)核病和LTBI，以及結(jié)核病和非結(jié)核肺部疾病的結(jié)核病診斷分子標(biāo)識(shí)組合；Sun等[55]建立了一組由3個(gè)蛋白組成的、可用于結(jié)核病和LTBI鑒別診斷的標(biāo)識(shí)組合。但是，所有這些數(shù)據(jù)在應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前，均需要更加嚴(yán)格的多中心、多人群獨(dú)立驗(yàn)證。

表1 結(jié)核病特異蛋白標(biāo)識(shí)的研究匯總

三、展望

近年來(lái)，結(jié)核病免疫診斷技術(shù)的研發(fā)取得了巨大進(jìn)展，特別是在IGRA技術(shù)之后，相繼出現(xiàn)了基于IP-10檢測(cè)和IL-2檢測(cè)的MTB感染診斷新技術(shù)，一方面提高了MTB感染的檢出率，另一方面在免疫低下等特殊人群中表現(xiàn)出較好的診斷價(jià)值。盡管這些新型的細(xì)胞免疫檢測(cè)技術(shù)仍然無(wú)法實(shí)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的鑒別診斷，但足以提示除IFN-γ外，必然存在其他細(xì)胞因子或標(biāo)識(shí)物能夠指示MTB的不同感染狀態(tài)。隨著對(duì)MTB感染后宿主免疫應(yīng)答機(jī)制的深入探討，必然能夠找到更理想的生物標(biāo)識(shí)物，以提高M(jìn)TB感染和結(jié)核病免疫學(xué)診斷的敏感度和特異度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)賈紅彥：文獻(xiàn)查閱、起草文章初稿；董靜：文獻(xiàn)查閱；張宗德：稿件審閱修改；潘麗萍：文獻(xiàn)審閱、初稿修改及審校