腦膠質(zhì)瘤患者血清黑色素瘤相關(guān)抗原-A 3特異性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)水平及臨床意義

李俊，孫繼程，杜國(guó)新

遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)鐵煤總醫(yī)院神經(jīng)外一科，遼寧 鐵嶺 112700

腦膠質(zhì)瘤是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，現(xiàn)有的治療手段包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療、免疫治療等，整體效果都不太理想，患者5年生存率不足20%[1]。近幾年，新的免疫治療方法在腦膠質(zhì)瘤領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注，例如使用重組腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）負(fù)載樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）治療被認(rèn)為是最有前途的免疫治療手段之一[2]，涉及的腫瘤領(lǐng)域也相對(duì)較多。黑色素瘤相關(guān)抗原（melanoma-associated antigen，MAGE）家族成員是其中重要的免疫治療靶標(biāo)之一[3]，由MAGE編碼的抗原肽經(jīng)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類（major histocompatibility complexⅠ，MHC-Ⅰ）呈遞給細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），發(fā)揮抗腫瘤活性[4]。目前關(guān)于MAGE-A3在腦膠質(zhì)瘤中的研究較少，對(duì)于MAGE-A3在腦膠質(zhì)瘤組織中是否具有表達(dá)特異性以及是否符合腫瘤免疫治療對(duì)抗原分子表達(dá)的要求尚存在爭(zhēng)議?；诖?，本研究首先應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation specific polymerase chain reaction，MSP-PCR）技術(shù)檢測(cè)MAGE-A3在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，并采用Gultured酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzyme-linked immunosorbent spot assay，ELISPOT）檢測(cè)患者M(jìn)AGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)，明確兩者之間的關(guān)系以及臨床意義，為MAGE-A3負(fù)載DC疫苗用于腦膠質(zhì)瘤治療提供一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1月至2019年8月在遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)鐵煤總醫(yī)院神經(jīng)外一科首次接受手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)鐵煤總醫(yī)院病理科副主任醫(yī)師復(fù)核病理組織切片；②首次確診，術(shù)前未經(jīng)放療、化療、免疫治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染、嚴(yán)重肝腎功能障礙。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入56例腦膠質(zhì)瘤患者，男性35例，女性21例；年齡20～68歲，平均（47.41±12.59）歲；低分期（Ⅰ～Ⅱ）腦膠質(zhì)瘤33例，高分期（Ⅲ～Ⅳ）腦膠質(zhì)瘤23例；術(shù)后經(jīng)病理確診為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤28例，星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤11例，間變性星形細(xì)胞瘤15例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤2例。另選取15例腦外傷患者作為對(duì)照，男性11例，女性4例；年齡23～62歲，平均（44.80±11.98）歲。兩組患者年齡、性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。取56例腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織標(biāo)本和外周血標(biāo)本及15例腦外傷患者經(jīng)內(nèi)減壓后收集的腦組織標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2 主要試劑和儀器

MAGE-A3抗體、TIANamp FFPE DNA提取試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，SYBR Green PCR master Mix購(gòu)自日本Takara公司，全細(xì)胞亞硫酸鹽DNA甲基化修飾試劑盒購(gòu)自美國(guó)ZYMO RESEARCH公司，F(xiàn)icoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京Solarbio科技有限公司，ELISPOT試劑盒購(gòu)自澳大利亞MABTECH公司。MAGE-A3全基因組特異性多肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司根據(jù)MAGE-A3多肽庫(kù)的序列圖合成。

1.3 研究方法

1.3.1 Westernblot法檢測(cè)MAGE-A 3蛋白表達(dá)情況 取100 mg腦組織，置于預(yù)冷的研缽中，用眼科剪剪碎，研磨，加入蛋白酶裂解液消化，取上清置于2 ml EP管中，反復(fù)洗滌離心，提取組織總蛋白，分裝-80℃保存。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）垂直電泳，切取目標(biāo)蛋白條帶所在區(qū)域的凝膠，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用脫脂牛奶封閉后，加入MAGE-A3一抗孵育過(guò)夜。洗滌，二抗孵育，洗滌后顯色。用圖像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶的灰度值，采用GAPDH作為內(nèi)參。

1.3.2 DNA抽提和MSP-PCR法檢測(cè)MAGE-A 3基因甲基化狀態(tài) 采用TIANamp FFPE DNA提取試劑盒提取組織DNA。取1.5 μg DNA樣本進(jìn)行亞硫酸鹽修飾和純化。取2 μg修飾后的DNA樣本，進(jìn)行甲基化特異性PCR。MAGE-A3甲基化引物序列：上游引物5'-ATTTAGGTAGGATTCGGTTTTC-3'，下 游 引 物 5'-AAACTAAAACGTCTTCCCGCG-3'；MAGE-A3非甲基化引物序列：上游引物5'-ATTTAGGTAGGATTTGGTTTTT-3'，下 游 引 物 5'-AAACTAAAACATCTTCCCACA-3'。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，循環(huán)35次，72℃再延伸5 min。將MSP產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.3 ELISPOT法[5]檢測(cè)MAGE-A 3特異性CTL免疫反應(yīng) 抽取肘靜脈血3 ml，EDTA抗凝，采用密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/ml。將PBMC加入至一抗包被硝酸纖維素膜的96孔板，加入MAGE-A3全基因組特異性多肽避光孵育過(guò)夜。分別用二抗、三抗孵育1 h，堿性磷酸酶系統(tǒng)顯色液顯色。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1 MAGE-A 3蛋白表達(dá)結(jié)果 蛋白條帶掃描灰度值＞中位值則為高表達(dá)組，否則為低表達(dá)組。

1.4.2 MSP凝膠電泳結(jié)果 ①完全甲基化：甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶，非甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶；②部分甲基化：甲基化引物和非甲基化引物均擴(kuò)增出目的條帶；③未甲基化：甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶，非甲基化引物擴(kuò)增出目的條帶。甲基化率=（完全甲基化+部分甲基化）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4.3 ELISPOT結(jié)果判斷 以斑點(diǎn)形成細(xì)胞（spot formation cell，SFC）/106PBMC表示反應(yīng)強(qiáng)度，SFC≥3倍陰性對(duì)照孔則視為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用Kappa值判斷一致性，Kappa值≥0.75表示一致性良好，0.75＞Kappa值≥0.40表示一致性一般，Kappa值＜0.40表示一致性較差；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAGE-A 3蛋白表達(dá)量的比較

經(jīng)Western blot法檢測(cè)，56例腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量為（2.26±1.09），明顯高于15例正常腦組織中的（0.44±0.18），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.411，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blot檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中MAGE-A 3蛋白表達(dá)情況

2.2 MAGE-A 3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的比較

經(jīng)MSP-PCR法檢測(cè)，腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3基因啟動(dòng)子甲基化率為55.36%（31/56），明顯低于正常腦組織的100%（15/15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=29.032，P＜0.01）。（圖2）

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中MAGE-A 3甲基化分析

2.3 腦膠質(zhì)瘤患者血清中MAGE-A 3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率及強(qiáng)度

經(jīng)ELISPOT法檢測(cè)，腦膠質(zhì)瘤患者血清MAGE-A3特異性CTL免疫應(yīng)答陽(yáng)性率為33.93%（19/56），平均反應(yīng)強(qiáng)度為（2301.70±560.33）SFC/106PBMC。

2.4 腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A 3蛋白表達(dá)量與基因甲基化狀態(tài)的關(guān)系

56例腦膠質(zhì)瘤組織中，MAGE-A3蛋白高表達(dá)28例，低表達(dá)28例。MAGE-A3基因啟動(dòng)子甲基化表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量為（1.71±0.63），明顯低于未甲基化表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤組織的（2.95±1.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.067，P＜0.01）。經(jīng) McNemarχ2檢驗(yàn)，腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與MAGE-A3蛋白高表達(dá)結(jié)果一致（P=0.629）；經(jīng)Kappa一致性分析，同一患者腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與MAGE-A3蛋白高表達(dá)結(jié)果一致性一般（Kappa=0.679，P＜0.01）。

2.5 腦膠質(zhì)瘤患者血清中MAGE-A 3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率及強(qiáng)度與組織中MAGE-A 3蛋白表達(dá)量的關(guān)系

血清MAGE-A3特異性CTL免疫應(yīng)答陽(yáng)性患者腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量為（3.20±1.09），明顯高于陰性患者腦膠質(zhì)瘤組織中的（1.78±0.73），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.805，P＜0.01）。MAGE-A3蛋白高表達(dá)組織中CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)度為（2549.86±477.41）SFC/106PBMC，明顯高于低表達(dá)組織中的（2053.54±532.85）SFC/106PBMC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.671，P＜0.01）。

經(jīng)McNemarχ2檢驗(yàn)，腦膠質(zhì)瘤患者血清MAGE-A3特異性CTL免疫應(yīng)答陽(yáng)性與組織中MAGE-A3蛋白高表達(dá)結(jié)果存在一定的差異（χ2=3.215，P=0.035）；經(jīng)Kappa一致性分析，同一患者血清MAGE-A3特異性CTL免疫應(yīng)答陽(yáng)性與組織中MAGE-A3蛋白高表達(dá)結(jié)果一致性一般（Kappa=0.464，P＜0.01）。另外，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，腦膠質(zhì)瘤患者血清中MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)強(qiáng)度與組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.788，P＜0.01）。（表1）

表1 腦膠質(zhì)瘤患者血清MAGE-A 3特異性CTL免疫應(yīng)答與組織中MAGE-A 3蛋白表達(dá)情況

2.6 腦膠質(zhì)瘤患者血清中MAGE-A 3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率及強(qiáng)度與臨床特征的關(guān)系

不同性別、年齡、病理類型、腫瘤位置的腦膠質(zhì)瘤患者血清MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤大小及臨床分期的腦膠質(zhì)瘤患者血清MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.004、8.887，P＜0.01）。不同性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小、病理類型、腫瘤位置的腦膠質(zhì)瘤患者血清MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)強(qiáng)度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征的腦膠質(zhì)瘤患者血清中MAGE-A 3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率及強(qiáng)度（ n=56）

3 討論

近年來(lái)，MAGE-A基因亞家族成員在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、耐藥中的作用已得到普遍證實(shí)[6-8]，由MAGE-A編碼的抗原肽由MHC-Ⅰ呈遞誘發(fā)特異性CTL免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤活性。董丹寧等[9]發(fā)現(xiàn)，漢族人群鼻咽癌患者血清中MAGEA1、MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)強(qiáng)度高于維族人群，而且這種表達(dá)差異性與患者預(yù)后存在關(guān)聯(lián)，因而推測(cè)深入探究癌癥患者對(duì)腫瘤特異性抗原MAGE-A多肽產(chǎn)生的特異性CTL免疫反應(yīng)有望為腫瘤的免疫治療提供新的思路。但是隨后劉凱等[10]通過(guò)檢測(cè)51例食管癌初治患者血清MAGE-A3特異性CTL抗原表位肽刺激γ-干擾素的CTL免疫應(yīng)答頻率和強(qiáng)度，認(rèn)為其與患者臨床特征均無(wú)關(guān)，是否可作為食管癌免疫治療的靶點(diǎn)尚需確認(rèn)。

MAGE-A是MAGE家族成員之一，屬于癌-睪丸抗原[11-12]，在正常組織中表達(dá)量較低或不表達(dá)，但是卻廣泛表達(dá)于多種腫瘤組織和細(xì)胞中[13]。在本研究中，采用Western blot法檢測(cè)證實(shí)MAGE-A3蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，幾乎是正常腦組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量的5倍。而且之前王柏清等[14]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中MAGE-A3基因5'端CpG島存在不同的甲基化狀態(tài)以及特異性去甲基化位點(diǎn)，膀胱癌組織中MAGE-A3啟動(dòng)子區(qū)域DNA去甲基化率較高是導(dǎo)致腫瘤組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量升高的原因，也是膀胱癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[15]。因此本研究也進(jìn)一步通過(guò)MSP-PCR法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3基因甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3基因啟動(dòng)子甲基化率為55.36%（31/56），明顯低于正常腦組織的100%（15/15），而且MAGE-A3基因啟動(dòng)子甲基化表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量低于未甲基化表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤組織。經(jīng)配對(duì)McNemarχ2檢驗(yàn)，腦膠質(zhì)瘤組織MAGE-A3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與MAGE-A3蛋白高表達(dá)結(jié)果一致（P=0.629）；經(jīng)Kappa一致性分析，同一患者腦膠質(zhì)瘤組織MAGE-A3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與MAGE-A3蛋白高表達(dá)結(jié)果具有一致性，但是由于納入的樣本量偏少，也有可能因?yàn)榛颊卟±眍愋?、腫瘤分級(jí)存在差異等因素，二者的一致性一般（Kappa=0.679）。上述結(jié)果提示腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)水平降低與啟動(dòng)子區(qū)DNA去甲基化有關(guān)。

此外，MAGE-A3作為一類重要的腫瘤特異性抗原，已有文獻(xiàn)證實(shí)在多種癌癥患者抗腫瘤免疫治療中扮演著重要角色[16-18]。林知等[19]發(fā)現(xiàn)，負(fù)載乙肝核心抗原-MAGE-A3融合蛋白的外周血PBMC在體外對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有一定的殺傷作用。但是MAGE-A3疫苗尚未全面用于臨床推廣，主要是由于該嵌合MAGE-A3抗原受體T細(xì)胞免疫療法的適用人群尚不明確。王群和張嘉濤[20]曾將MAGE-A3抗原疫苗用于完全切除原發(fā)灶的ⅠB～ⅢA期MAGE-A3陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌患者，但是未得到明顯的臨床獲益，觀察組和對(duì)照組患者中位無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（58.0個(gè)月vs56.9個(gè)月，P＞0.05），上述結(jié)果也提示MAGE-A3疫苗的臨床療效和適用人群仍有待確認(rèn)。因而在本研究中，進(jìn)一步采用Gultured ELISPOT法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者血清中MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率及強(qiáng)度，結(jié)果顯示，血清MAGE-A3特異性CTL免疫應(yīng)答陽(yáng)性患者腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量高于陰性患者腦膠質(zhì)瘤組織，而且腦膠質(zhì)瘤患者血清中MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)強(qiáng)度與組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)性。雖然經(jīng)配對(duì)McNemarχ2檢驗(yàn)，腦膠質(zhì)瘤患者血清MAGE-A3特異性CTL免疫應(yīng)答陽(yáng)性與組織中MAGE-A3蛋白高表達(dá)結(jié)果存在一定的差異，且兩者Kappa一致性一般（Kappa=0.464＜0.75），但是不能否認(rèn)組織中MAGE-A3蛋白表達(dá)量升高是導(dǎo)致血清中MAGE-A3特異性CTL免疫反應(yīng)頻率和強(qiáng)度增加的重要原因之一，而且發(fā)現(xiàn)臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的表達(dá)頻率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，腫瘤直徑＞4 cm患者的表達(dá)頻率亦高于≤4 cm，說(shuō)明MAGE-A3有望成為腦膠質(zhì)瘤特異性免疫治療的潛在免疫原。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織中MAGE-A3基因啟動(dòng)子區(qū)DNA去甲基化導(dǎo)致MAGE-A3蛋白表達(dá)量升高，進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生MAGE-A3特異性CTL免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和惡性化程度。本研究為腦膠質(zhì)瘤免疫研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和線索，但仍需要從作用機(jī)制研究和擴(kuò)大臨床樣本量進(jìn)行臨床試驗(yàn)兩方面再深入綜合驗(yàn)證本研究的結(jié)論。