不同稻米基質(zhì)發(fā)酵叢毛紅曲菌MS-1代謝產(chǎn)物分析

劉 姣, 李妍依, 王 婧, 丁 華, 張 珣, 周有祥, 楊 潔

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所1，武漢 430064) (農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，武漢 430064)

紅曲菌(Monascusspp.)是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的重要生產(chǎn)菌株，廣泛應(yīng)用于香腸、腐乳、紅曲酒、紅曲醋和肉制品的加工[1]。自1984年首個(gè)紅曲菌被發(fā)現(xiàn)并命名以來[2]，目前已有至少19種紅曲菌被發(fā)現(xiàn)并保藏[3, 4]，主要包括叢毛紅曲菌(M.pilosus)、紫色紅曲菌(M.purpureus)和紅色紅曲菌(M.ruber)等[5]。紅曲菌可產(chǎn)生紅曲色素(Monascuspigments, MPs)、莫納可林 K(Monacolin K, MK)、γ-氨基丁酸等多種具有抗氧化、降血脂等功能的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在食品著色劑、發(fā)酵劑和替代藥物等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[6]。

紅曲，又稱紅曲米(Red kojic rice)、丹曲，是紅曲菌經(jīng)過大米等淀粉原料發(fā)酵而成的傳統(tǒng)的藥食同源生物制品[7]。數(shù)據(jù)表明我國(guó)紅曲產(chǎn)品年產(chǎn)量近萬(wàn)噸，相關(guān)產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值達(dá)千億元[8]。然而，部分紅曲菌還可產(chǎn)生一種腎毒性真菌毒素——桔霉素(Citrinin，CIT)，限制了紅曲產(chǎn)品的應(yīng)用[9]。選用不產(chǎn)或低產(chǎn)CIT的紅曲菌菌株進(jìn)行紅曲產(chǎn)品研發(fā)和功能成分挖掘是促進(jìn)紅曲產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要手段[10, 11]。因此，不產(chǎn)CIT且不具有CIT合成相關(guān)基因的叢毛紅曲菌(M.pilosus) MS-1被廣泛用于紅曲米發(fā)酵[12, 13]。發(fā)酵基質(zhì)對(duì)紅曲菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生具有重要影響[14, 15]。秈稻因其米飯具有疏松、黏性低、通氣性好、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，一直是生產(chǎn)紅曲米的重要原料[16, 17]。我國(guó)稻米資源豐富，占世界水稻資源的19.05%，也是世界上最大的水稻生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)[18]。然而我國(guó)稻谷主要用于口糧，加工產(chǎn)品消費(fèi)比例較低，稻谷資源合理化開發(fā)和高附加值利用問題日益突出[19]。

本研究將叢毛紅曲菌(M.pilosus) MS-接種于不同秈稻米培養(yǎng)基中制作紅曲米，分析比較紅曲米中主要次級(jí)代謝產(chǎn)物含量差異，探究不同稻米基質(zhì)品質(zhì)差異對(duì)叢毛紅曲菌MS-1代謝產(chǎn)物的影響，以期為安全高效紅曲產(chǎn)品的開發(fā)和秈稻的高附加值利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

叢毛紅曲菌(M.pilosus) MS-1為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

甲醇、無水乙醇、鹽酸 (36%)、氫氧化鈉，均為分析純；甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純；Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品 (C24H36O5，CAS號(hào)75330-75-5，純度98%)。

土豆葡萄糖培養(yǎng)基 (Potatodextrose agar medium, PDA)：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，添加蒸餾水至1 L，用于活化紅曲菌株。

米飯培養(yǎng)基：將大米浸泡3 h后晾干，稱取15 g分裝于100 mL三角瓶中用于紅曲米的制備。所用6個(gè)品種為華占-Ⅰ、華占-Ⅲ、P7-1、HN19BX5、民豐B、5210S，對(duì)應(yīng)編號(hào)為R1、R2、R3、R4、R5、R6。發(fā)酵后紅曲米對(duì)應(yīng)編號(hào)為MR1、MR2、MR3、MR4、MR5、MR6。所用培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

8200全自動(dòng)凱氏定氮儀，F(xiàn)iastar 5000流動(dòng)注射分析儀，ACQUITY HPLC液相色譜儀，ACQUITY UPLC高效液相色譜儀，7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，U3900紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 大米品質(zhì)分析

參照標(biāo)準(zhǔn)NY/T 83—2017[20]、NY/T 593—2021[21]和GB 5009.5—2016[22]中描述的分析方法，分別測(cè)定6個(gè)品種稻米(R1～R6) 的出糙率、精米率、粒長(zhǎng)、堊白粒率、膠稠度、含水量、直鏈淀粉含量及蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

內(nèi)酯型Monacolin K (MKL)：稱取2.0 mg MK標(biāo)準(zhǔn)品，用75%乙醇溶液溶解并定容至10 mL，得到濃度為200 μg/mL的MKL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

酸型Monacolin K (MKA)：稱取2.0 mg MKL 標(biāo)準(zhǔn)品，用0.2 mol/L的NaOH溶液(75%乙醇溶液配制)溶解并定容至10 mL，50 ℃超聲1 h后于室溫靜置1 h，得到濃度為200 μg/mL的MKA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配制2、20、40、80、100 μg/mL梯度質(zhì)量濃度的MKL及MKA標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)HPLC分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 紅曲米的制備

將叢毛紅曲菌MS-1接種于PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)10 d，以 5 mL 無菌水洗滌活化菌株制備孢子懸液，經(jīng)3層擦鏡紙過濾去除菌絲，于顯微鏡下計(jì)數(shù)，并將孢子液稀釋至 106個(gè)/mL。接種2 mL孢子液于米飯培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)15 d后于45 ℃烘干，粉碎后裝入密閉袋，避光冷藏備用。

1.3.4 紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物分析

MPs分析：稱取0.05 g紅曲米粉于2 mL離心管中，加入1.5 mL甲醇溶液(80∶20)，高速渦旋1 min后，室溫超聲提取15 min，以12 000 r/min離心5 min，取出上清液，用紫外分光光度計(jì)分別于380、470、520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定紅曲黃色素、橙色素和紅色素色價(jià)。

MK分析：稱取0.1 g樣品于2 mL離心管中，加入1 mL乙醇溶液(75∶25)，高速渦旋1 min后，室溫超聲提取30 min，以12 000 r/min離心5 min，取出上清液，過 0.22 μm有機(jī)濾膜，濾液用于HPLC分析。HPLC分析條件列出如下：

色譜柱：TSKgel ODS-80Tm C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；洗脫程序：0.1%甲酸水∶乙腈∶純水(3∶ 60∶37) 等度洗脫20 min。

風(fēng)味物質(zhì)分析：稱取1 g紅曲米粉于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入2.5 g NaCl及5 mL蒸餾水，60 ℃條件下攪拌平衡15 min后用Supelco 50/30 um DVB萃取頭萃取10 min，然后將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口解吸7 min。按下述質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，色譜柱升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2.0 min，再以5 ℃/min升至120 ℃，保持時(shí)間3 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。頂空色譜條件：取樣針120 ℃，載氣15 psi，傳輸線150 ℃，恒溫60 ℃，捕集阱Hi280 ℃，Lo 40 ℃；干吹5 min，捕集阱保持5 min，解析1.6 min。測(cè)得風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：X為風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%；AX為紅曲米中測(cè)得的風(fēng)味物質(zhì)X的峰面積；A0為稻米中測(cè)得的風(fēng)味物質(zhì)X的峰面積；AS為紅曲米中測(cè)得的所有物質(zhì)峰面積之和。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定 3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用SPSS 16.0 進(jìn)行Duncan’s多重比較和相關(guān)性分析，所得數(shù)據(jù)經(jīng)Z-score標(biāo)準(zhǔn)化后使用SIMCA 13.0 進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻米品質(zhì)比較分析

高淀粉含量和蛋白質(zhì)豐富的發(fā)酵基質(zhì)有利于紅曲菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成[23, 24]，探究稻米品質(zhì)不同造成的發(fā)酵基質(zhì)差異對(duì)紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物的影響，對(duì)6個(gè)品種稻米的出糙率、精米率、粒長(zhǎng)、堊白粒率等外觀品質(zhì)和膠稠度、直鏈淀粉、蛋白質(zhì)等理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。由表1可知，6種稻米出糙率、精米率、粒長(zhǎng)和水分含量相近，但堊白粒率、膠稠度、直鏈淀粉及蛋白質(zhì)含量差別較大，變異系數(shù)均超過10%，說明6種稻米發(fā)酵基質(zhì)差異顯著。

表1 稻米品質(zhì)分析

2.2 紅曲米中代謝產(chǎn)物及風(fēng)味物質(zhì)分析

2.2.1 內(nèi)脂式及酸式Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析

將不同梯度質(zhì)量濃度MKL及MKA標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)行色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，MKL/MKA濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在0～100 μg/mL范圍內(nèi)，MKL及MKA的線性回歸方程分別為y=24 837x-2 211.9和y=33 792x-6 913.1，相關(guān)系數(shù)R2分別為1和0.999 9，線性良好。

2.2.2 紅曲米中MK及MPs含量分析

利用HPLC分析6種稻米基質(zhì)發(fā)酵叢毛紅曲菌MS-1所得紅曲米中MKL及MKA含量及紅曲黃色素、橙色素、紅色素色價(jià)(圖1)。由圖1a可知，所得6種紅曲米中MKA含量普遍高于MKL，圖1b表明各樣品中橙色素含量均低于黃色素和紅色素。紅曲米MR1中MKL和MKA的含量最高，紅曲米MR5中MPs含量最高但MK含量相對(duì)較低。結(jié)果表明同種發(fā)酵基質(zhì)發(fā)酵紅曲菌，不同次級(jí)代謝產(chǎn)物含量變化趨勢(shì)并不完全一致，這與前人研究結(jié)果一致[24, 25]。雖然高淀粉含量發(fā)酵基質(zhì)有助于紅曲菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，但MR4和MR6并未表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)MK和MPs的能力，原因還有待進(jìn)一步分析。

注：同種產(chǎn)物中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 不同紅曲米中MK及MPs含量分析

2.2.3 紅曲米中風(fēng)味物質(zhì)種類分析

將6個(gè)紅曲米樣品進(jìn)行頂空固相微萃取后分析紅曲米中風(fēng)味物質(zhì)。由表2可知，不同紅曲米中風(fēng)味物質(zhì)種類和質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，所有紅曲米樣品中共檢出14種風(fēng)味物質(zhì)，可分為酮類、醛類和酯類等多個(gè)類別，這與前人研究結(jié)果相似[26]。其中紅曲米MR3中風(fēng)味物質(zhì)種類最多，共檢出8種風(fēng)味物質(zhì)，主要成分為2-庚酮。紅曲米MR6中僅檢出1個(gè)風(fēng)味物質(zhì)，為棕櫚酸甲酯。紅曲菌在代謝過程中可產(chǎn)生多種酶類，因此廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的釀造[27]。本研究初步分析了不同稻米基質(zhì)發(fā)酵紅曲米中的風(fēng)味物質(zhì)差異，后續(xù)進(jìn)一步研究其代謝變化規(guī)律，可為探究紅曲菌在釀造過程中的作用機(jī)制和貢獻(xiàn)程度提供參考。

表2 不同紅曲米中的風(fēng)味物質(zhì)分析

2.3 稻米基質(zhì)對(duì)叢毛紅曲菌MS-1代謝產(chǎn)物的影響分析

2.3.1 相關(guān)性分析

為探究不同稻米基質(zhì)對(duì)叢毛紅曲菌MS-1次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，進(jìn)一步分析了稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與叢毛紅曲菌MS-1發(fā)酵產(chǎn)物的相關(guān)性。由表3可知，樣品中MK含量與稻米各品質(zhì)參數(shù)間相關(guān)性均不顯著且相關(guān)系數(shù)較低。MPs含量與堊白粒率的相關(guān)性不顯著但相關(guān)系數(shù)較高，說明大米堊白粒率可能影響MPs的合成。稻米堊白是由于稻谷灌漿不充分，導(dǎo)致胚乳中淀粉顆粒排列疏松、顆粒間存在間隙、淀粉顆粒排列不緊密造成的不透明部分[28]。從稻米基質(zhì)本身淀粉結(jié)構(gòu)及排列形式差異對(duì)紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)物的影響目前還鮮有研究，進(jìn)一步分析不同堊白粒率稻米結(jié)構(gòu)特性差異，有助于揭示稻米基質(zhì)結(jié)構(gòu)與紅曲菌代謝產(chǎn)物的關(guān)系。此外，堊白是衡量稻米品質(zhì)的重要性狀[29]，堊白粒率偏高是我國(guó)稻米品質(zhì)提升的主要限制因素之一。因此，以堊白粒率較高大米為紅曲菌發(fā)酵基質(zhì)，可為提高紅曲菌代謝產(chǎn)物含量和增加低品質(zhì)稻米附加值提供新思路。

表3 稻米品質(zhì)與紅曲米代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析

2.3.2 主成分分析

依據(jù)紅曲米主要代謝產(chǎn)物含量及稻米基質(zhì)品質(zhì)參數(shù)為變量進(jìn)行主成分分析。圖2顯示2個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)值達(dá)75.8%，可以反映6種紅曲米的主要特征。由圖2a可知，位于第4象限的紅曲米MR5在第一主成分上得分最高，與圖2b對(duì)應(yīng)，MPs和壬醛也在第四象限呈聚集性分布，既說明了MPs和壬醛間的相關(guān)性，也說明MR5中MPs含量顯著高于其他紅曲米。位于第1象限的MR1在第2主成分上得分最高，對(duì)應(yīng)載荷值較高的是MKA，表明MR1中MKA含量較高，同時(shí)也揭示了MKA和稻米膠稠度間的相關(guān)性。此外，載荷圖還顯示MPs、MKL、2-庚酮及壬醛含量均與稻米堊白粒率呈正相關(guān)。紅曲米MR2、MR3、MR4和MR6聚集在一起，且距離MR1和MR5較遠(yuǎn)，說明這4個(gè)紅曲米成分較為接近。

圖2 主成分分析得分圖(a)和載荷圖(b)

主成分分析結(jié)果顯示6種紅曲米的主要代謝產(chǎn)物雖有明顯差異，但與稻米直鏈淀粉和蛋白質(zhì)含量并無直接相關(guān)性，這與前人研究結(jié)果相似[16]。可見，稻米基質(zhì)本身蛋白質(zhì)、直鏈淀粉等理化性質(zhì)的含量差異可能不是影響紅曲菌發(fā)酵的主要因素。前人研究表明，以碎米為發(fā)酵基質(zhì)時(shí)MPs產(chǎn)量較高[25]，堊白對(duì)米飯斷裂程度有顯著影響，堊白度越高的稻米在蒸煮過程中越容易斷裂。

3 結(jié)論

不同稻米基質(zhì)發(fā)酵所得紅曲米中代謝產(chǎn)物含量差異顯著。紅曲米MR1中MK含量最高約為340 μg/kg；紅曲米MR5中MPs含量最高，紅曲紅、橙、黃色素色價(jià)均高于40 U/g；所試6種紅曲米樣品中共檢出14種風(fēng)味物質(zhì)，紅曲米MR3中風(fēng)味物質(zhì)種類最多。相關(guān)性分析及主成分分析結(jié)果顯示稻米堊白粒率與紅曲米主要代謝產(chǎn)物含量正相關(guān)但不顯著。后續(xù)進(jìn)一步分析不同堊白粒率稻米發(fā)酵過程中米粒斷裂或蓬松程度、孔隙度和孔隙排列等結(jié)構(gòu)特性有助于揭示稻米基質(zhì)結(jié)構(gòu)與紅曲菌代謝產(chǎn)物的關(guān)系。