紅鰭東方鲀B-FABP 基因SNPs 篩選及其與生長性狀關(guān)聯(lián)分析

楊 曉，馬文超，楊 金，茍盼盼，包玉龍，王秀利，劉圣聰，仇雪梅

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連天正實業(yè)有限公司，遼寧 大連 1 160116）

腦型脂肪酸結(jié)合蛋白（Brain-like fatty acid binding proteins，B-FABP）最初是在腦組織中發(fā)現(xiàn)，主要功能是結(jié)合以及運輸多不飽和脂肪酸PUFAs，這些脂肪酸在生長早期的細(xì)胞分化、突觸活化以及光感受器膜的生物合成中必不可少[1-3]。在對北京油雞進(jìn)行全基因組分析中發(fā)現(xiàn)，B-FABP基因與北京油雞的體質(zhì)量、屠體性狀有顯著相關(guān)性[4]，由此分析B-FABP基因可以作為影響生長性狀的候選基因。對斑馬魚（Danio rerio）進(jìn)行原位雜交研究發(fā)現(xiàn)，B-FABP在斑馬魚早期發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)[5]。但目前尚未見B-FABP基因?qū)︳~類生長調(diào)控作用的研究報道。

全基因組重測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于遺傳變異檢測、性狀基因定位等方面研究[6]。Li 等[7]對48 份家豬樣本進(jìn)行全基因組重測序，與55 個歐亞野豬和家豬基因組數(shù)據(jù)對比分析，發(fā)現(xiàn)了低氧適應(yīng)、能量代謝等268 個基因位點，揭示了藏豬高原低氧適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)；朱文[8]對“金鱗一號”皇姑魚（Nibea albiflora）的體質(zhì)量、體長、體高、體厚四個生長性狀進(jìn)行了基因組關(guān)聯(lián)分析，篩選出了13 個與生長性狀有關(guān)的候選基因。

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）是一種肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富的重要經(jīng)濟魚類，在我國多分布于中部和北部海域，是我國重要的出口水產(chǎn)品之一。近年來海洋環(huán)境污染嚴(yán)重，致使紅鰭東方鲀自然種群資源不斷衰減，但其人工養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，因此選育具有優(yōu)良生長性狀的紅鰭東方鲀?nèi)后w有實際經(jīng)濟意義。本研究以紅鰭東方鲀?yōu)椴牧希萌蚪M重測序技術(shù)篩選B-FABP基因上的SNPs 位點，并對突變位點進(jìn)行基因型分型，利用SPSS 軟件分析B-FABP基因的SNPs 與紅鰭東方鲀生長性狀之間的關(guān)系，以期為探究B-FABP對紅鰭東方鲀生長性狀的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用魚均取自河北省唐山市牧海水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的紅鰭東方鲀?nèi)后w，共308 尾。養(yǎng)殖周期為1 a，分別在6 月齡和12 月齡時進(jìn)行生長性狀測量和樣品采集，其中6 月齡的體質(zhì)量范圍為69.5～458.6 g，12 月齡的體質(zhì)量范圍為162.8～ 630.3 g。

1.2 方法

1）取樣及生長性狀測定：體質(zhì)量用電子天平稱量，精確到0.1 g；形態(tài)性狀的測量方法參照王新安等[9]的方法，11 個形態(tài)性狀分別為體質(zhì)量、體長、體全長、尾柄長、體高、頭長、頭軀長、尾長、尾柄高、尾柄寬以及體寬，測量時利用手機支架固定手機進(jìn)行拍照，盡量保證拍照時樣本位置基本一致，測量參數(shù)結(jié)果精確到0.001 cm。

2）基因組提?。翰杉~鰭用于基因組提取。使用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）對采取的樣品進(jìn)行基因組制備，將提取的基因組DNA 放于-20 ℃保存。

3）基因組重測序：將提取得到的基因組送至北京生工生物工程股份有限公司進(jìn)行文庫構(gòu)建。

4）原始數(shù)據(jù)質(zhì)控和過濾：原始測序數(shù)據(jù)利用Fastp（v0.11.5）進(jìn)行質(zhì)控，對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，得到質(zhì)量較好的數(shù)據(jù)。

5）SNPs 位點的檢測和標(biāo)記：用紅鰭東方鲀參考序列與獲得的測序序列進(jìn)行比對，并進(jìn)行變異位點的篩選。

6）紅鰭東方鲀生長性狀及其與SNP 的生物統(tǒng)計分析：采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，建立生物統(tǒng)計模型式為：Yij=μ+Gi+eij，其中Yij表示某個性狀第i基因型的第j個個體的生長觀測值；μ是實驗觀測值所有樣本的均值；Gi是基因型i的有效生物學(xué)價值；eij表示隨機誤差對觀測值的影響。將B-FABP基因上的SNP 位點不同基因型與紅鰭東方鲀的體質(zhì)量（BWH）、體長（BL）、體全長（TL）、尾柄長（CPL）、體高（BD）、頭長（HL）、頭軀長（HL+TR）、尾長（TA）、尾柄高（CPD）、尾柄寬（CPB）、體寬（BW）共11 個形態(tài)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，計算結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，P＜0.05 表示顯著相關(guān)，P＜0.01 表示極顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 月齡和12 月齡紅鰭東方鲀生長性狀關(guān)聯(lián)分析

本研究驗共篩選到3 個SNP 位點，其基因型和紅鰭東方鲀個體數(shù)統(tǒng)計見表1。6 月齡和12 月齡紅鰭東方鲀?nèi)后w中各SNPs 位點與生長性狀相關(guān)性結(jié)果見表2、3。

表1 紅鰭東方鲀B-FABP 基因SNPs 位點基因型分型Table 1 Genotyping map of the SNPs locus of the B-FABP gene of Takifugu rubripes

從表2 可以看出，6 月齡紅鰭東方鲀個體中，C442T 位點的多態(tài)性與生長性狀均無顯著相關(guān)（P＞0.05），CC 基因型個體顯著高于TT 基因型個體（P＜0.05），其他性狀均沒有達(dá)到顯著水平；G676A和C731A 位點的多態(tài)性與大多數(shù)生長性狀都存在顯著關(guān)聯(lián)性（P＜0.05）。其中，G676A 位點的GA基因型個體的體質(zhì)量、體高、尾柄寬均顯著高于AA 基因型個體（P＜0.05），GG 基因型的頭長顯著高于GA 基因型（P＜0.05）；C731A 位點的AA基因型個體的體質(zhì)量、體長、體全長、尾柄長、體高、頭長、尾長、尾柄高均顯著高于CC 基因型（P＜0.05），并且在體長、體全長、尾柄長、頭長、尾長和尾柄高上達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），AA基因型的個體在體長、體全長、尾柄長、尾長均顯著高于AC 基因型個體（P＜0.05），CC 基因型個體的尾柄長、頭長、尾長均顯著高于AC 基因型（P＜0.05），其中在頭長性狀上達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

表2 B-FABP 基因SNP 位點基因型與6 月齡紅鰭東方鲀生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 2 Correlation analysis between the SNP genotype of B-FABP gene and the growth traits of 6-month-old Takifugu rubripes

表3 可以看出，在12 月齡紅鰭東方鲀個體中，各突變位點與6 月齡個體一致。其中C442T 位點與生長性狀沒有顯著相關(guān)（P＞ 0.05）；G676A 位點與大多數(shù)生長性狀都存在顯著關(guān)聯(lián)，GA 基因型個體的體全長、體高、頭長、頭軀長、尾柄寬、體寬均顯著高于GG 基因型個體（P＜0.05），并且在體全長、體高、頭長、頭軀長、體寬上達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），GG 基因型個體體長與尾長極顯著高于GA 基因型個體（P＜0.01），GA 基因型個體的體寬性狀顯著高于AA 基因型個體（P＜0.05）；C731A 位點只與體寬性狀有顯著相關(guān)，AA 基因型個體的體寬顯著高于CC 基因型個體（P＜0.05），CC 基因型個體的體寬顯著高于AC 基因型個體（P＜0.05），其他性狀均沒有達(dá)到顯著水平（P＞ 0.05）。

表3 B-FABP 基因SNP 位點基因型與12 月齡紅鰭東方鲀生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 3 Correlation analysis between the SNP genotype of B-FABP gene and the growth traits of 12-month-old Takifugu rubripes

2.2 6 月齡和12 月齡紅鰭東方鲀表型性狀關(guān)聯(lián)分析

為了解不同生長階段紅鰭東方鲀各主要性狀之間的關(guān)系及影響，對不同月齡的紅鰭東方鲀表型形狀進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果見表4、5。6 月齡紅鰭東方鲀各表型之間為正相關(guān)，其中體質(zhì)量和體長、體高相關(guān)性均較大，與體全長較次之；12 月齡紅鰭東方鲀各表型之間為正相關(guān)，其中體質(zhì)量、體長和體全長均與體高相關(guān)性較大。

表4 6 月齡紅鰭東方鲀的表型相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of phenotype of redfin pufferfish at 6 months old

2.3 不同SNPs 位點的遺傳連鎖分析

通過對檢測到的3 個SNPs 位點進(jìn)行遺傳連鎖分析。圖中白色和灰度圖中的數(shù)字表示相關(guān)系數(shù)R2×100 的值，該值≥80 時表示兩個位點之間有連鎖反應(yīng)，由此可以得出這三個位點之間沒有連鎖關(guān)系，為獨立遺傳（圖1）。

圖1 SNPs 位點遺傳連鎖圖Fig.1 SNPs genetic linkage map

表5 12 月齡紅鰭東方鲀的表型相關(guān)分析Table 5 Correlation analysis of phenotype of redfin pufferfish at 12 months old

3 討論

使用脂肪酸結(jié)合蛋白基因作為腹脂率、腹脂重以及生長性狀的分子標(biāo)記候選基因，在豬[10]、雞和牛[11-12]等有報道，如仇雪梅、王啟貴等[13-15]對雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白（Ex-FABP）的單核苷酸位點的研究發(fā)現(xiàn)，Ex-FABP的SNP 位點對雞的屠體性狀有顯著關(guān)聯(lián)，并且腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP）基因上的SNPs 位點變化對肉雞體質(zhì)量性狀有顯著影響[16]；對北京鴨體尺以及胴體性狀與FABP2基因的SNPs 研究發(fā)現(xiàn)，該基因可以作為北京鴨體尺和屠體性狀標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記[17]；吳丹[4]在對北京油雞體質(zhì)量和屠體性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析時發(fā)現(xiàn)，B-FABP基因與其體質(zhì)量、屠體性狀有顯著相關(guān)性；在魚類中，夏正龍[18]通過對建鯉（Cyprinus carpiovar.Jian）脂肪酸結(jié)合蛋白基因進(jìn)行SNPs 的篩選，發(fā)現(xiàn)其突變位點與建鯉的增重有顯著相關(guān)。

本研究首次對B-FABP基因的遺傳突變與紅鰭東方鲀生長性狀的之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀B-FABP基因上發(fā)現(xiàn)3 個SNPs 位點，分別為C442T、G676A、A731C。其中，第二外顯子上一個（C442T），第三內(nèi)含子上兩個（G676A、A731C），并且通過遺傳連鎖分析發(fā)現(xiàn)，三個SNPs位點沒有連鎖現(xiàn)象。第二外顯子上的突變導(dǎo)致氨基酸的改變，原來的蘇氨酸（Thr）被替換為甲硫氨酸（Met）。筆者對此位點中的三種基因型和紅鰭東方鲀的生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)6 月齡的體質(zhì)量等相關(guān)性狀明顯CC 基因型的高于TT 基因型，但由于該多態(tài)性位點TT 基因型群體數(shù)量較少，并且不同個體之間標(biāo)準(zhǔn)差較小，導(dǎo)致數(shù)據(jù)離散程度較低，故使用SPSS 22 分析時其體質(zhì)量性狀雖平均值相差較大，但并沒有顯著差異，因此后續(xù)會加大檢測的群體數(shù)量，對結(jié)果進(jìn)行充分驗證；第三內(nèi)含子上的突變與6、12 月齡的紅鰭東方鲀個體的大多數(shù)生長性狀均有顯著關(guān)聯(lián)，其中G676A 位點中的GA基因型個體體全長、體高、頭長、頭軀長、尾柄寬、體寬等生長性狀顯著高于GG 基因型個體（P＜0.05）。

本研究發(fā)現(xiàn)SNPs 突變位點位于內(nèi)含子區(qū)域。雖然內(nèi)含子不具有編碼氨基酸的能力，但是已有較多研究結(jié)果證明發(fā)生在內(nèi)含子內(nèi)的突變也可對生物生長性狀產(chǎn)生影響，如對藏羊[19]（Ovis aries）MC4R基因的研究中發(fā)現(xiàn)，與其生長性狀密切相關(guān)的SNP 位點位于第一內(nèi)含子上；張世勇等[20]對斑點叉尾鮰（Ictalures punctatus）MSTN基因與生長性狀的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，與其體質(zhì)量、體長顯著相關(guān)SNP 標(biāo)記位于第二內(nèi)含子上；謝淑媚等[21]在縊蟶（Sinonovacula constricta）IGFBP基因第1 個內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)1 個與體質(zhì)量、殼長顯著相關(guān)的SNP 位點；王啟貴等[22]在雞L-FABP基因的5′側(cè)翼區(qū)檢測到2個SNPs 位點（G204A 和T205C），這兩個多態(tài)性位點與雞的腹脂質(zhì)量和腹脂率有顯著相關(guān)性；同時，徐松松等[16]研究發(fā)現(xiàn)，雞的F2 資源群體中在I-FABP基因的內(nèi)含子1 和內(nèi)含子2 中發(fā)現(xiàn)2 個SNPs，與雞的生長性狀也顯著相關(guān)。雖然內(nèi)含子上的突變不會影響編碼蛋白質(zhì)的合成，但是與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[23-25]，所以內(nèi)含子中SNPs 位點可能與基因組區(qū)域中相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因突變位點有連鎖反應(yīng)[26-27]。因此，在內(nèi)含子上的突變有可能對B-FABP基因的翻譯、結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響[28]。這些結(jié)果與本研究結(jié)果相吻合，證明B-FABP基因上的SNPs 對紅鰭東方鲀的生長性狀有一定影響，因此其可作為紅鰭東方鲀分子育種的候選分子標(biāo)記，也可以作為生長性狀的候選基因。