基于線粒體控制區(qū)的中國東南沿海黃鰭棘鯛群體遺傳多樣性和遺傳分化

葉幼玲，黃張帆，徐安樂，汪 睛，黎中寶*

(1.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021；2.福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，福建 廈門 361021；3.福建省花鱸育種重點實驗室，福建 福鼎355200)

黃鰭棘鯛(Acanthopagruslatus)隸屬鱸形目(Perciformes)，鯛科(Sparid)，棘鯛屬(Acanthopagrus)，為淺海暖水性底層魚類，廣泛分布于日本南部、朝鮮、韓國、菲律賓、印度尼西亞、印度和中國東南沿岸海域，在中國的分布區(qū)域為浙江、福建、臺灣、廣東、海南以及廣西沿岸海域，其營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美，具有極高的經(jīng)濟價值，是中國重要的養(yǎng)殖、游釣及海洋捕撈物種[1]。隨著捕撈壓力的加大，近海生態(tài)環(huán)境的惡化等因素導致黃鰭棘鯛的棲息地缺失，其野生資源量明顯衰退[2-3]。遺傳多樣性是物種對不同環(huán)境的適應能力和所具備的進化潛力的反映，同時是物種保護和種質(zhì)資源開發(fā)利用的基礎[4]，探明野生黃鰭棘鯛的群體遺傳多樣性是實施保護的前提。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具有嚴格的母系遺傳、結(jié)構(gòu)簡單、無內(nèi)含子、幾乎不重組及進化速率較快等特點[5]。其中線粒體DNA控制區(qū)(mitochondrial DNA control region，CR)作為非編碼區(qū)，其突變和進化速率較其他線粒體編碼區(qū)序列更快，是一種理想的種內(nèi)遺傳學研究標記片段[6]。線粒體控制區(qū)分子標記手段已在帶魚(Trichiurusjaponicus)[7]、細條天竺鯛(Apogonlineatus)[8]、綠鰭魚(Chelidonichthyskumu)[9]、鯻(Therapontheraps)[10]、黃鯽(Setipinnatenuifilis)[11]、大彈涂魚(Boleophthalmuspetinirostris)[12]、日本鮐(Scomberjaponicus)[13]等海洋生物的群體遺傳學研究中得到廣泛的應用，表明采用該方法得出的海洋生物群體遺傳多樣性相關數(shù)據(jù)是翔實可靠的。

目前，我國黃鰭棘鯛的相關研究主要集中在育苗[14-15]、養(yǎng)殖[16-17]和生理[18-19]等方向；而有關群體遺傳方面研究較少，僅見于劉紅艷等(2004)[20]、龔金波(2006)[21]、Xia等(2008)[22]、何震晗等(2021)[23]和Liu等(2021)[24]的研究，但劉紅艷等[20]和龔金波[21]僅采集3個群體，Xia等[22]、何震晗等[23]和Liu等[24]樣品采集主要集中在北部灣、海南、東山等海域。本研究采用線粒體控制區(qū)DNA標記技術，對中國東南海域的7個野生黃鰭棘鯛群體進行群體遺傳學研究，系統(tǒng)分析其群體遺傳多樣性及遺傳分化，以期為中國東南沿海野生黃鰭棘鯛群體的種質(zhì)資源利用和保護提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究所用樣品于2015年12月至2016年10月分別采自中國東南沿海的寧德(ND)、廈門(XM)、漳浦(ZP)、南澳島(NAD)、湛江(ZJ)、?？?HK)、北海(BH)等7個地區(qū)共48個樣品，用于控制區(qū)序列研究，各個地區(qū)所用樣本數(shù)目見表1。所有樣品取背部新鮮肌肉置于95%的酒精中，并在-80 ℃條件下保存。

表1 采樣信息Tab.1 Sampling information

1.2 DNA提取

使用上海捷瑞生物工程有限公司的細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)對樣品基因組DNA進行提取，提取過程按照使用說明書進行嚴格操作?；蚪MDNA提取完成后，于分光光度計上進行DNA質(zhì)量檢測，之后選取質(zhì)量良好的基因組DNA稀釋至100 ng/μL，放置于4 ℃冰箱備用。

1.3 PCR擴增與產(chǎn)物測序

PCR擴增所用的控制區(qū)序列通用引物為:16086F:5′-TTAGTATGGTGACAATGCAT-3′和16621R:5′-GACACCATTAACTTATGCAA-3′[20]，引物由廈門鉑尚生物科技有限公司合成。PCR反應參照劉紅艷等的方法[20]，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送廈門鉑尚生物科技有限公司進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果使用軟件BioEdit 7.0進行序列的初步比對，人工去除兩端不可信序列并提交到BLAST中進行同源性分析。使用DNAstar的EditSeq軟件對7個群體控制區(qū)序列的核苷酸含量進行分析。使用DnaSP 5.10軟件對7個群體的多樣性指數(shù)進行分析[25]，包括：簡約信息位點、單一信息位點、變異位點數(shù)目、單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(k)。使用Arliquin 3.5軟件計算群體間的遺傳分化系數(shù)(FST)統(tǒng)計值，通過1 000次重抽樣法進行其顯著性的檢驗，并進行7個群體間的基因流(Nm)計算以及分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)，使用Wrights方程式得出基因流數(shù)值：Nm=[(1/FST)-1]/2。使用MEGA 7.0以Kimura距離法計算7個群體的遺傳距離[26]。利用DNAMAN軟件，基于Kimrua距離法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[27]。使用PopART 1.7軟件[28]構(gòu)建TCS network單倍型網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃鰭棘鯛群體的遺傳多樣性

研究得到48條黃鰭棘鯛的線粒體控制區(qū)序列長度為580 bp，存在1個堿基插入或缺失位點和70個變異位點，70個變異位點分為39個簡約信息位點和31個單一信息位點，變異比率為12.06%。44個單倍型中(單倍型命名為Hap1至Hap44)Hap10為寧德和漳浦群體的共享單倍型，Hap24為南澳島和漳浦群體的共享單倍型，其余單倍型為各群體所特有的單倍型。控制區(qū)序列的平均堿基含量為：A=34.20%，G=14.09%，T=31.54%，C=20.17%，A+T含量(65.74%)高于G+C含量(24.26%)，表現(xiàn)為明顯的反G偏倚，與劉紅艷等[20]的研究結(jié)果相一致。

群體的遺傳多樣性高低體現(xiàn)了物種對不同環(huán)境的適應潛力，通常采用單倍型多樣性和核苷酸多樣性來衡量群體的遺傳多樣性高低[29]。7個黃鰭棘鯛地理群體的Hd為0.893～1.000，Pi為0.010 02～0.021 35(表2)。根據(jù)Grant等(1998)提出的4種模式來進行劃分[30]，黃鰭棘鯛群體表現(xiàn)為高Hd與高Pi的模式，表明黃鰭棘鯛群體對于復雜多變的海洋環(huán)境的適應能力較強，未出現(xiàn)過瓶頸效應現(xiàn)象，是一個大而穩(wěn)定的群體。

表2 黃鰭棘鯛群體線粒體控制區(qū)序列遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters in mtDNA CR sequences among A. latus populations

與同樣基于線粒體控制區(qū)序列分析的其他海洋魚類相比較發(fā)現(xiàn)，黃鰭棘鯛群體遺傳多樣性高于密斑馬面鲀(Navodontessellatus)群體[31]、褐籃子魚(Siganusfuscescens)群體[32]、黑棘鯛(Acanthopagrusschlegelii)群體[33]、日本鮐(Scomberjaponicus)群體[13]，低于細鱗鯻(Teraponjarbua)群體[34]和真鯛(Pagrusmajor)群體[35](表3)，本研究的黃鰭棘鯛整體遺傳多樣性與Xia等[22]的研究相比有所下降，這一結(jié)果與何震晗等[23]的研究結(jié)果相近，表明我國黃鰭棘鯛整體遺傳多樣性仍處于較高水平。朱克誠等(2021)[36]對陽江海域的黃鰭棘鯛放流苗種進行遺傳質(zhì)量評估，放流苗種親本為陽江等海域野生個體，結(jié)果表明放流苗種與自然海域群體的遺傳多樣性水平相近，因此，推測物種增殖放流工作是黃鰭棘鯛群體遺傳多樣性維持在較高水平的原因之一。

表3 黃鰭棘鯛與其他海洋魚類的單倍型多樣性和核苷酸多樣性的比較Tab.3 Comparison of haplotype diversity and nucleotide diversity of A. latus with other marine fishes

2.2 黃鰭棘鯛群體的遺傳分化

遺傳距離的大小是衡量群體間遺傳關系遠近的重要指標，群體間的遺傳距離越大，親緣關系越遠；遺傳距離越小，親緣關系越近[37]。魚類在屬、種、群體三個水平中的判斷標準為0.90、0.30和0.05[38]，本研究中7個黃鰭棘鯛群體間的遺傳距離為0.010 28～0.029 87(表4)，平均值為0.018 45，遠小于0.05，北海群體與其他6個群體間遺傳距離最大，為0.023 06～0.029 87。遺傳分化系數(shù)是衡量群體間遺傳分化程度的重要指標[39]，群體間的FST值的范圍為-0.068 41～0.545 86(表4)，北海群體與其他6個群體間的FST值范圍為0.318 00～0.545 86，群體間的遺傳分化結(jié)果與遺傳距離結(jié)果相對應，均說明中國東南沿海的野生黃鰭棘鯛群體間存在地理區(qū)域性，北海群體與其他6個群體間表現(xiàn)出一定的分化特征。

表4 黃鰭棘鯛群體間的遺傳距離和遺傳分化系數(shù)Tab.4 Relative genetic distance and FST between populations of A. latus

基于群體間的FST值進行群體間的基因流計算，并進行AMOVA分析。Nm的大小與群體間的基因交流水平高低成正比[40]，如表5所示，北海群體與其他6個群體間的Nm值均小于1(0.208～0.480)，基因交流相對較匱乏，寧德、?？凇⒛习膷u、廈門、湛江和漳浦群體間的Nm值均大于1(1.218～118.222)，基因交流較頻繁，推測與海洋地理環(huán)境相關的可能性較大。對7個地理群體的黃鰭棘鯛進行AMOVA分析(表6)：未進行分組時，大部分的遺傳變異存在于群體內(nèi)(83.34%)；按照瓊州海峽以南(北海群體)和以北(寧德、海口、南澳島、廈門、湛江和漳浦群體)分為兩個組群后，發(fā)現(xiàn)組群間的遺傳變異比例為42.66%，組內(nèi)群體間的遺傳分化程度較低(FST=0.008 12)，表明北海群體與其余群體間的遺傳變異程度較大，兩個組群間存在一定程度的遺傳分化現(xiàn)象。

表5 黃鰭棘鯛群體間的基因流Tab.5 Gene flow value between populations of A. latus

表6 黃鰭棘鯛群體間遺傳變異的AMOVA分析Tab.6 AMOVA analysis of genetic variation among A. latus populations

續(xù)表

以黑棘鯛(Acanthopagrusschlegelii×Pagrusmajor，GenBank登錄號NC_040957.1)作為外群，利用Kimrua距離法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可以更直觀地看出黃鰭棘鯛群體間的遺傳結(jié)構(gòu)(圖1)，北海群體聚為單獨一支，其他6個群體聚為一大支?；赥CS network構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡圖(圖2)為非典型的星狀構(gòu)圖，其直觀地反應了44個單倍型之間的關系。Hap21位于網(wǎng)絡進化圖的中心，推測可能為群體的祖先單倍型，各個群體中的單倍型并未按照水系格局和地理距離進行分布，而是混雜在一起，結(jié)果表明黃鰭棘鯛群體間并未形成多個單系群，可以看作一個進化顯著單位(evolutionary significant unit,ESU)。

本研究中黃鰭棘鯛群體的遺傳分化特征與龔金波[21]、Xia等[22]和何震晗等[23]的研究結(jié)果相近。一方面，如龔金波[21]的研究中所提到的，海洋屬于開放環(huán)境，其地理障礙較小，不同地理來源的黃鰭棘鯛的卵隨著洋流的流動進行擴散，導致不同群體之間進行基因交流，而北海群體因其與海南以北的群體隔著瓊州海峽，相對其他海域較封閉，這一特殊的地理位置以及復雜的沿岸流流向使得北海群體與其他6個群體間基因交流相對較匱乏，存在一定程度的遺傳分化。

3 結(jié)論

我國東南沿海黃鰭棘鯛群體的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.996和0.017 30，黃鰭棘鯛整體遺傳多樣性處于較高水平。單倍型網(wǎng)絡圖顯示我國黃鰭棘鯛群體間沒有形成多個單系群，可將中國東南沿海的黃鰭棘鯛群體看作一個進化顯著單位，組群間的AMOVA分析結(jié)果(FST=0.426 59)表明應將北海群體和其他6個群體間分為兩個管理單位。為了能夠更好地了解我國黃鰭棘鯛遺傳多樣性的現(xiàn)狀，今后應進一步采用能夠反映出雙親遺傳信息的核DNA分子標記技術如簡化基因組技術等，對中國東南沿海野生黃鰭棘鯛的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀進行深入研究，以期為其種質(zhì)資源的保護和發(fā)展提供重要的科學依據(jù)。

圖1 7個黃鰭棘鯛群體的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of seven A. latus populations

圖2 黃鰭棘鯛單倍型網(wǎng)絡圖Fig.2 TCS network of A. latus haplotypes