注射泵輔助微固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)大米中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留

張雋嫻， 鄭 程， 鄭 丹， 劉 麗， 彭西甜

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(武漢)，湖北武漢 430064)

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用非常廣泛，其大大提高了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，另一方面，農(nóng)藥殘留造成的食品安全問題也引起了政府和社會(huì)越來越多的關(guān)注[1,2]。有機(jī)磷農(nóng)藥是目前生產(chǎn)中常用的一類殺蟲劑，其主要作用機(jī)理是可以和昆蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酶結(jié)合，從而抑制昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿酶的活性，使害蟲死亡[3,4]。然而，大部分有機(jī)磷農(nóng)藥屬于高毒性農(nóng)藥，可引發(fā)急性毒性，損害肌體，引起機(jī)體痙攣、癱瘓等一系列神經(jīng)中毒癥狀、甚至死亡[5]。因此，建立食品和農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的快速、靈敏和高效的分析方法具有重要的意義。

在農(nóng)藥殘留分析中，樣品制備很關(guān)鍵。當(dāng)前，樣品制備技術(shù)越來越向微型化和綠色化的方向發(fā)展，即要求能夠提供快速、高效萃取的同時(shí)減少有機(jī)溶劑消耗[6]。微固相萃取(Micro-Solid Phase Extraction，μ-SPE)很好地滿足了這一要求[7]。金屬有機(jī)骨架材料(Metal-Organic Frameworks，MOFs)是由有機(jī)配位體和金屬離子或團(tuán)簇通過配位鍵自組裝形成的具有高發(fā)達(dá)分子內(nèi)孔隙的有機(jī)-無機(jī)雜化材料，近年來在氣體儲(chǔ)存、二氧化碳的捕獲、催化、吸附、生物成像、藥物分離等領(lǐng)域呈現(xiàn)出重要的價(jià)值[8 - 10]。MOFs具有孔隙率高、比表面積大和吸附位點(diǎn)多的特點(diǎn)，非常適合作為μ-SPE的吸附劑[7,9,11]。

目前，氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12 - 14]、氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器(GC-FPD)[15,16]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[17,18]等已經(jīng)被用于各種樣品中有機(jī)磷類農(nóng)藥的檢測(cè)。其中質(zhì)譜檢測(cè)器具有更好的選擇性和靈敏度，在食品安全分析中應(yīng)用越來越廣泛。在本文中，我們采用水熱法一步合成了一種氨基官能化的MOF材料MIL-101-NH2(Cr)，將其作為注射泵輔助的μ-SPE吸附劑，首次用于稻米樣品中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的快速萃取。吸附劑首先負(fù)載在有機(jī)濾頭上，樣品溶液在注射泵的推動(dòng)下經(jīng)過有機(jī)濾膜上的吸附劑完成萃取，萃取結(jié)束后直接解吸進(jìn)樣，避免了傳統(tǒng)分散μ-SPE過程中的離心步驟，大大提高了樣品分析的通量。結(jié)合GC-MS的分離檢測(cè)，建立了一種稻米中6種有機(jī)磷類農(nóng)藥的快速、高效分析方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

GCMS-TQ8030型氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本Shimadzu公司)；AOC-20S/20i自動(dòng)進(jìn)樣器(日本Shimadzu公司)；LSP04-1A恒流泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；METTLER TOLEDO電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)；IKA MS 3 basic型渦旋儀(德國(guó)IKA公司)；N-EVAP111氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)。

Cr(NO3)3·9H2O、2-氨基對(duì)苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司。NaCl、NaOH、HCl購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)。HPLC級(jí)的甲醇和丙酮購(gòu)買自T.Baker(Deventer,Netherlands)。試驗(yàn)用去離子水采用Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore)純化。

6種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品甲拌磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、對(duì)硫磷、倍硫磷、喹硫磷(1 000 μg/mL，丙酮)購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所(天津)，三苯基磷(0.25 g)購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。采用丙酮稀釋以上標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成5 μg/mL的有機(jī)磷混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在后續(xù)添加回收試驗(yàn)中，按照實(shí)驗(yàn)要求加入以上儲(chǔ)備液得到所需的濃度。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)藏在-20 ℃冰箱中避光保存。

1.2 儀器條件

色譜條件：Rtx-50(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱(購(gòu)自RESTEK公司)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持4 min，以25 ℃/min的速度升至125 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至30 ℃保持5 min；載氣：高純度氦氣(99.999%)；進(jìn)樣體積：1.0 μL；不分流模式進(jìn)樣，色譜柱流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離源(EI)；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；連接口傳輸線溫度：250 ℃；碰撞氣：高純度氬氣(99.999%)；溶劑延遲切斷時(shí)間：3.5 min；數(shù)據(jù)采集模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。

1.3 材料合成

MIL-101(Cr)參照文獻(xiàn)的方法合成[19]。

氨基化的MIL-101(Cr)合成參照文獻(xiàn)方法[20]。Cr(NO3)3·9H2O(3.2 g，8 mmol)，2-氨基對(duì)苯二甲酸(1.45 g，8 mmol)和NaOH(0.8 g，20 mmol)加入60 mL去離子水中，室溫?cái)嚢? min。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)至200 mL聚四氟乙烯高壓釜中，并150 ℃水熱反應(yīng)12 h。產(chǎn)物冷卻至室溫后，離心收集綠色沉淀物，用DMF洗滌數(shù)次，然后在100 ℃下用熱酒精洗滌24 h，除去產(chǎn)品孔隙中未反應(yīng)的2-氨基對(duì)苯二甲酸。最后產(chǎn)物在80 ℃真空干燥備用。

1.4 樣品采集

所有稻米樣品購(gòu)買于武漢市場(chǎng)，用高速粉碎機(jī)研磨成粉，4 ℃密封保存，備用。

1.5 樣品分析過程

稱取5.0 g勻質(zhì)后的稻米樣品至50 mL離心管中，加入10.0 mL水浸潤(rùn)30 min。加入20 mL乙腈，超聲提取30 min后，加入5.0 g NaCl，渦旋30 s后以4 200 r/min離心5 min，取上清液10 mL，氮?dú)獯蹈桑尤? mL的5% NaCl溶液，渦旋溶解后，進(jìn)行下一步的注射泵輔助的微固相萃取。

注射泵輔助的微固相萃取按以下步驟開展。取5 mg的MIL-101(Cr)-NH2放入孔徑為0.45 μm的微孔濾膜中，將材料均勻地負(fù)載在濾膜表面，用3 mL的5% NaCl溶液對(duì)材料進(jìn)行活化。隨后，將上樣液在注射泵的作用下以0.7 mL/min的流速通過萃取濾膜完成有機(jī)磷的萃取，最后用5 mL丙酮以0.7 mL/min的流速解吸材料上的有機(jī)磷農(nóng)藥，解吸液在40 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?0 μL的1 mg/L的三苯基磷內(nèi)標(biāo)溶液，丙酮定容至1 mL，GC-MS/MS進(jìn)行分析檢測(cè)。樣品分析全部過程如圖1所示。

圖1 稻米樣品分析過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of rice sample analysis process

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇了常用的6種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行方法學(xué)的研究考察。為了達(dá)到更好的分析靈敏度和選擇性，對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)條件如碰撞能量、前體離子、產(chǎn)物離子等進(jìn)行了優(yōu)化，在全掃描模式下選擇強(qiáng)度較高的離子作為母離子，通過優(yōu)化不同的碰撞電壓，得到強(qiáng)度較高的子離子，對(duì)每種農(nóng)藥選擇兩個(gè)離子對(duì)，分別為定量離子對(duì)和定性離子對(duì)。6種農(nóng)藥以及內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間、碰撞電壓以及定量定性的離子對(duì)參數(shù)如表1所示，優(yōu)化條件下分析物的MRM色譜圖如圖2所示。

表1 6種有機(jī)磷農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)三苯基磷的保留時(shí)間和質(zhì)譜定性、定量參數(shù)Table 1 The retention time and MS parameters of 6 OPPs and triphenyl phosphine for quantification and confirmation

圖2 稻米中添加50 μg/kg的6種有機(jī)磷農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of blank rice sample spiked at 50 μg/kg of 6 OPPs under optimal conditions

2.2 注射泵輔助μ-SPE的優(yōu)化

在空白稻米中添加50 μg/kg的有機(jī)磷農(nóng)藥，對(duì)注射泵輔助μ-SPE的條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 吸附劑用量考察了MIL-101(Cr)-NH2納米材料用量在1～20 mg范圍內(nèi)對(duì)各目標(biāo)分析物萃取效率的影響。如圖3所示，在1～5 mg范圍內(nèi)，6種有機(jī)磷農(nóng)藥萃取效率呈上升趨勢(shì)，并在5 mg時(shí)萃取效率最大；5 mg以上時(shí)，萃取效率逐漸降低，這可能是由于吸附劑用量太大時(shí)，分析物無法解吸完全，導(dǎo)致吸附效率降低。因此，選擇5 mg吸附劑用量。

圖3 材料用量對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥萃取效率的影響Fig.3 Effect of material consumption on extraction efficiency

2.2.2 解吸溶劑體積的優(yōu)化采用丙酮作為解吸溶劑，考察了解吸體積1～7 mL對(duì)目標(biāo)分析物的萃取效率的影響，其結(jié)果從圖4可以看出，丙酮用量從1 mL增加到7 mL時(shí)，解吸效率均呈增加趨勢(shì)，其中解吸體積從1 mL增加到5 mL，萃取效率增加較快，由5 mL增加到7 mL時(shí)，萃取效率變化不明顯。因此，在考慮回收率和溶劑消耗量的前提下，最終選擇5 mL的丙酮作為解吸液。

圖4 解吸液用量對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥萃取效率的影響Fig.4 Effect of desorbed liquid dosage on extraction efficiency

2.2.3 解吸速率的優(yōu)化在注射泵推動(dòng)樣品溶液完成萃取的過程中，流速對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的萃取有重要影響。利用恒流泵控制其解吸速率，分別將解吸速率控制在0.5～2.0 mL/min。如圖5所示，流速在0.5～0.7 mL/min時(shí)，萃取效率略有降低；0.7～2.0 mL/min，萃取效率呈現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)。這是由于隨著上樣流速的增加，有機(jī)磷農(nóng)藥與氨基官能化MIL-101(Cr)不能充分地作用，導(dǎo)致回收率降低。為獲得較高的回收率同時(shí)節(jié)約樣品萃取的時(shí)間，將上樣流速定為0.7 mL/min。

圖5 上樣流速對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥萃取效率的影響Fig.5 Effect of loading rate on extraction efficiency

2.2.4 鹽濃度的優(yōu)化離子強(qiáng)度的改變能夠影響待測(cè)物在溶液和萃取材料間的分配系數(shù)，一方面鹽濃度增加會(huì)產(chǎn)生鹽析效應(yīng)，提高目標(biāo)物在材料上的萃取效率；另一方面鹽濃度增加也會(huì)增加溶液的粘度，導(dǎo)致目標(biāo)物的傳質(zhì)減弱，降低目標(biāo)物的萃取效率。考察了NaCl質(zhì)量濃度在1%～30%時(shí)對(duì)萃取回收率的影響。如圖6所示，在NaCl質(zhì)量濃度為5%時(shí)有機(jī)磷類農(nóng)藥的萃取效率最高。因此，在樣品溶液中添加質(zhì)量濃度為5%的NaCl。

圖6 離子強(qiáng)度對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥萃取效率的影響Fig.6 Effect of ionic strength on extraction efficiency

2.2.5 待測(cè)水樣酸堿度的優(yōu)化環(huán)境水的pH會(huì)影響分析物的存在狀態(tài)和吸附劑的表面電荷，從而影響目標(biāo)物的萃取效率。由于有機(jī)磷在堿性環(huán)境中易分解，因此在保證待測(cè)物穩(wěn)定的前提下，研究了pH=3～8對(duì)萃取效率的影響，其結(jié)果如圖7。在待測(cè)水樣pH=3～7的范圍內(nèi)基本呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在pH=7處提取效率取得最大值。這可能是由于隨著pH的升高，氨基官能化的MIL-101(Cr)表面官能團(tuán)質(zhì)子化程度逐漸減弱，氨基逐漸釋放出來，其與OPPs農(nóng)藥的氫鍵作用增強(qiáng)，萃取效率逐漸提高。因此，選擇pH=7考察下一步的實(shí)驗(yàn)。

圖7 pH值有機(jī)磷類農(nóng)藥萃取效率的影響Fig.7 Effect of pH on extraction efficiency

2.2.6 萃取效率的比較實(shí)驗(yàn)比較了氨基官能化的MIL-101(Cr)和MIL-101(Cr)對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥的萃取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基官能化的MIL-101(Cr)對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥萃取效率更高，這可能是由于氨基的存在可以與有機(jī)磷類農(nóng)藥產(chǎn)生更強(qiáng)的氫鍵相互作用，提高了農(nóng)藥的萃取效率。

2.3 方法學(xué)考察

為了考察方法的線性，在空白稻米中添加5～200 μg/kg的有機(jī)磷農(nóng)藥，按照以上優(yōu)化程序?qū)悠愤M(jìn)行處理和分析，根據(jù)分析物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比和濃度比得到線性方程。檢出限和定量限分別按照3倍和10倍的信噪比得到。如表2所示，6種有機(jī)磷類農(nóng)藥在5～200 μg/kg范圍具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)的平方大于0.9964。方法的檢出限和定量限分別在0.6～1.8 μg/kg和2.5～5.0 μg/kg。依據(jù)GB 2763-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》稻米中甲拌磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、對(duì)硫磷、倍硫磷和喹硫磷的最大殘留限量分別為0.05、5.0、0.5、0.1、0.1和0.2 mg/kg，該方法的靈敏度高，可以滿足稻米中該類農(nóng)藥分析的要求。

表2 稻米樣品中6種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of 6 OPPs rice samples analyzed by MIL-101(Cr)-NH2 based μ-SPE/GC-FPD

進(jìn)一步對(duì)方法的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行了考察。準(zhǔn)確度采用回收率進(jìn)行評(píng)價(jià)，回收率是通過計(jì)算實(shí)測(cè)值(采用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算)和實(shí)際添加值的比值得到。如表3所示，在空白稻米中添加10、50和100 μg/kg濃度水平的方法相對(duì)回收率在83.0%～113.3%之間，日內(nèi)日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.5%，以上結(jié)果表明我們所建立的μ-SPE/GC-MS/MS方法分析稻米中的有機(jī)磷類農(nóng)藥具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可以用于實(shí)際稻米樣品的分析檢測(cè)。

表3 稻米樣品中6種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率和日內(nèi)日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery and inter-day and intra-day RSDs of six OPPs in rice samples analyzed by MIL-101(Cr)-NH2 based μ-SPE-GC-MS/MS

(續(xù)表3)

2.4 實(shí)際樣品的分析

將所建立的方法用于10個(gè)稻米樣品中6種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的分析，結(jié)果表明，在樣品中未檢出有機(jī)磷農(nóng)藥。

3 結(jié)論

本文將氨基官能化MIL-101(Cr)作為注射泵輔助的μ-SPE的吸附劑，結(jié)合GC-MS/MS的分離檢測(cè)，建立了稻米樣品中6種有機(jī)磷農(nóng)藥的快速靈敏的分離分析新方法。對(duì)影響有機(jī)磷農(nóng)藥萃取效率的材料用量、解吸溶劑的體積、解吸速率、有機(jī)磷農(nóng)藥的含鹽量與pH等因素進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化好的條件下，對(duì)方法學(xué)性能進(jìn)行了考察，并將其用于實(shí)際樣品的分析，取得了很好的效果。該方法前處理簡(jiǎn)單，相較于傳統(tǒng)分散μ-SPE，無需離心分離的步驟，樣品的富集凈化有效避免了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)方法性能的影響，為食品中有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供了一種有效的分離分析新方法。