雙柱凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定豬肉中7種頭孢菌素殘留量

楊旺火， 陳銘洋， 林一敏， 黃海斌， 謝佳怡

(1.廈門泓益檢測有限公司 肉食品安全生產(chǎn)技術國家重點實驗室，福建廈門 361000； 2.廈門華廈學院環(huán)境與公共健康學院，福建廈門 361024)

頭孢菌素類抗生素是一類具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的半合成抗生素，目前已經(jīng)發(fā)展到第五代。由于其具有抗菌譜廣、毒副作用小、過敏反應少等特點，被廣泛應用于人和動物的疾病治療[1]。在家畜的飼養(yǎng)過程中，倘若頭孢菌素被濫用，容易在動物體內(nèi)積蓄而引起殘留，通過食物鏈傳導后，會對人們的健康造成危害，同時頭孢抗生素的濫用有可能造成“超級細菌”的產(chǎn)生，導致藥物治療失效[2 - 4]。因此，頭孢類藥物在動物源性食品中的殘留問題已引起了各國重視，中國、日本、美國和歐盟等都已規(guī)定了動物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留的最大殘留限量。我國國家標準(GB 31650-2019)《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中對頭孢菌素藥物的限值也做了規(guī)定，其中頭孢氨芐在牛肉中最高殘留限量值為0.2 mg/kg，頭孢喹肟在豬、牛肉中限量值為0.05 mg/kg、頭孢噻呋為1.0 mg/kg。然而，該標準中只規(guī)定了三種頭孢藥物的限量值，其余項目均未進行規(guī)定，具有潛在的風險。因此，建立一種高效、準確、靈敏度高的豬肉中多種頭孢菌素的檢測方法具有重要的意義。

目前，頭孢菌素的檢測方法主要有高效液相色譜法[5,6]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[7 - 13]、毛細管電泳法[14]、電化學法[15]和流動注射化學發(fā)光法[16 - 18]等，其中液相色譜-串聯(lián)質譜法以其高靈敏度、高通量以及高定性準確度而被廣泛采用。已有的文獻報道[7 - 13]和標準方法[19 - 23]主要集中在牛奶、牛肉、水產(chǎn)品和蜂蜜等基質的樣品分析。崔風云等[9]建立了一種分散固相萃取結合液相色譜-串聯(lián)質譜測定牛肉中7種頭孢菌素殘留，金曉峰等[13]采用80%乙腈水溶液提取液肌肉中頭孢拉定，經(jīng)PRIME HLB柱凈化后液相色譜-串聯(lián)質譜測定，定量限為1 μg/kg。而目前現(xiàn)行國家標準方法涉及的檢測項目偏少，同時也存在檢測限偏高等不足[19 - 23]。本方法針對豬肉基質，采用雙固相萃取柱進行凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)對豬肉中7種頭孢菌素類藥物殘留進行檢測，該方法靈敏度高，回收率好，能有效去除基質效應，實現(xiàn)準確定量，可應用于實際豬肉樣品中頭孢菌素的分析檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate3000高效液相色譜-串聯(lián)TSQ QUANTUM ACCESS三重四極桿質譜儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LXJ-IIB離心機(上海安亭科學儀器廠)；BSA224S-CW分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；Unique-R10超純水機(銳思捷科學儀器有限公司)。

頭孢克肟(Cefixime，純度99.8%)、頭孢匹林(Cefapirin，純度92.2%)、頭孢唑林(Cefazolin，純度98.6%)、頭孢噻呋(Ceftiofur，純度96.7%)、頭孢氨芐(Cephalexin，純度99.7%)、頭孢洛寧(Cephalonium，純度98.2%)均購自北京墨壇質檢科技有限公司；頭孢喹肟(Cefquinome，純度95.2%)購自北京曼哈格生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，瑞典Oceanpak公司)。HLB、MAX固相萃取小柱，規(guī)格均為60 mg/3 mL，購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取適量的標準物質，其中頭孢克肟用50%甲醇水溶液溶解定容至10 mL，頭孢噻呋先用N,N-二甲基甲酰胺溶解后，用水定容至10 mL，其余標準物質均用50%乙腈水溶液溶解定容至10 mL，制得濃度約為1 mg/mL的標準儲備液，置于冰箱-18 ℃下保存，有效期6個月。分別準確移取適量上述標準儲備溶液于10 mL容量中混合，用50%乙腈水溶液定容至刻度，制成濃度均為1.0 μg/mL的混合標準中間液，置于冰箱2～8 ℃下保存，有效期3周。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取準確稱取2 g試樣，加入85%乙腈水溶液10 mL，渦旋混勻1 min，超聲提取30 min，然后在10 000 r/min下離心5 min。準確取上清液5 mL于刻度管中，加入3 mL乙腈飽和正己烷，渦旋混合 30 s，靜置分層后，棄去上層正己烷，下層溶液于45 ℃水浴中氮吹濃縮至約1 mL后，用3 mL純水復溶，充分混勻后，待凈化。

1.3.2 凈化取HLB和MAX固相萃取小柱進行串接，HLB柱在上，MAX柱在下，串接的小柱經(jīng)3 mL甲醇和3 mL水活化后，將上述復溶液上樣凈化。待樣液完全流出MAX柱后，用3 mL純水淋洗串接小柱，棄去流出液，放入刻度管，用3 mL甲醇洗脫串接小柱，接收流出液。待流出液完全流出HLB柱后，棄去HLB柱，再用3 mL 5%的酸化甲醇洗脫MAX柱，接收流出液，合并兩次的流出液。于45 ℃水浴中氮吹濃縮至近干后，殘渣用1 mL純水復溶，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾，進液-質聯(lián)用儀分析測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫條件：0～4.0 min，2%～70%B；4.0～4.5 min，70%B； 4.51～7.0 min，2%B。流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。

1.4.2 質譜條件采用電噴霧離子源電離正離子源(ESI+)；多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測；噴霧電壓：4 000 V；鞘氣流量：45 L/min；輔助氣流量：15 L/min；毛細管溫度：320 ℃；輔助氣加熱溫度350 ℃。7種頭孢菌素的質譜條件參數(shù)見表1。

表1 7種頭孢菌素的質譜檢測參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 7 cephalosporins

(續(xù)表1)

2 結果與討論

2.1 質譜條件優(yōu)化

首先，采用0.1%甲酸水-乙腈為50∶50的比例作為流動相，0.1 mL/min的流速條件下，將濃度為1.0 μg/mL的7種頭孢菌素混合標準工作溶液，采用針泵注射方式分別注入離子源進行參數(shù)優(yōu)化，選擇7種化合物的最佳質譜條件。在酸性條件下，各個化合物進入一級質譜后，均可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+離子，因此選則正離子模式進行電離，得到目標物的母離子質荷比；其次，采用產(chǎn)物離子掃描模式，得到目標物碎片離子豐度最大和次大的碎片離子作為定量離子對和定性離子對；最后，采用MRM模式，對所選取的兩對離子對進行源內(nèi)碎裂電壓和碰撞能量等條件進行優(yōu)化。最終得到各物質的質譜檢測條件如表1所示。

2.2 色譜條件優(yōu)化

通常液相色譜-串聯(lián)質譜在正離子分析模式下，為了提高目標物的離子化效率，改善峰形，在流動相中添加少量的揮發(fā)性酸，如甲酸，乙酸等。本實驗比較了0.1%甲酸水-乙腈、水-乙腈、和0.1%甲酸水-甲醇三種體系作為流動相，結果表明，當采用水-乙腈作為流動相時，頭孢克肟、頭孢喹肟兩種化合物的峰形和響應較差；當采用0.1%甲酸水-乙腈作為流動相時，頭孢克肟和頭孢喹肟兩者的峰形和響應得到較大改善，其余的化合物的峰面積響應值也均變大。說明在正離子模式下，甲酸的加入提高了化合物的離子化效率，且改善了峰形。同時比較了0.1%甲酸水-乙腈和0.1%甲酸水-甲醇兩者的分離效果和響應值，發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動相中有機相時，7種化合物的分離度和響應值均略好于用甲醇作為有機相，此外采用甲醇在梯度洗脫過程中需要更長的平衡時間和產(chǎn)生更大的系統(tǒng)壓力。為了提高分析效率和防止長期高壓導致液相系統(tǒng)泄漏，本實驗選擇用0.1%甲酸水-乙腈作為流動相。優(yōu)化后的7種頭孢菌素的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 7種頭孢菌素藥物的提取離子色譜圖Fig.1 Selected ion chromatograms of 7 cephalosporins

2.3 前處理條件優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇頭孢菌素藥物一般以乙腈和水的混合溶液作為提取溶液，一方面由于大部分頭孢菌素類藥物易溶于水，而乙腈在提取過程中可以起到沉淀蛋白質的作用。本實驗以陰性豬肉樣品添加10 μg/kg的標準混合溶液，對比了80%乙腈水溶液、85%乙腈水溶液、90%乙腈水溶液、95%乙腈水溶液和純乙腈5種提取溶液的提取效果，結果如圖2所示。從圖中可以看出，5種提取液中頭孢喹肟和頭孢洛寧兩種化合物均存在基質增強效應，回收率均大于100%，而當采用乙腈作為提取溶液時，頭孢克肟和頭孢匹林二者無回收，隨著提取液中水相比例的不斷增大兩者的回收率也不斷增大，當水相比例達到15%時二者的回收率達到最大值，其余3種化合物的回收率則比較穩(wěn)定。因此本實驗采用85%乙腈水溶液作為提取溶液。

圖2 不同溶劑提取效果的比較(n=3)Fig.2 Comparison of extraction efficiencies of cephalosporins using different solvents(n=3)

2.3.2 凈化方式的選擇本實驗首先采用乙腈飽和正己烷對提取液進行液-液萃取初步除脂，然后考察了HLB、C18、WAX、MCX和MAX 5種固相萃取小柱對頭孢菌素的保留效果，結果如表2所示。從表中可以看出，C18以及MCX小柱對大部分的頭孢菌素保留均不理想，HLB除了頭孢克肟和頭孢匹林外，其余組分保留效果較好，與之互補的是WAX和MAX小柱，二者的頭孢克肟保留效果均較好，且MAX柱的頭孢匹林保留效果要好于WAX柱。綜合考慮，本實驗選擇采用HLB串聯(lián)MAX小柱的雙柱進行樣品溶液的凈化。

表2 5種固相萃取小柱的回收率(n=3)Table 2 Recoveries of 5 kinds of solid phase extraction columns(n=3)

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍與檢測限將配制好的質量濃度為2、5、10、20、50和100 ng/mL的系列標準工作溶液，在優(yōu)化條件下進行測定，以峰面積(Y)為縱坐標，對應的質量濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，各組分在2～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好，決定系數(shù)(r2)均大于0.99。以特征定量離子對色譜峰的信噪比(S/N)=3為檢出限，信噪比(S/N)=10為定量限，得到7種化合物的檢出限為0.08～0.2 μg/kg，定量限為0.2～0.6 μg/kg。具體結果見表3。

表3 7種頭孢類藥物的線性方程、線性范圍、線性相關系數(shù)、檢出限(LOD)及定量限(LOQs)Table 3 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 7 cephalosporins

2.4.2 回收率及精密度采用豬肉陰性樣品進行加標回收和精密度試驗。向豬肉陰性樣品中添加5、10、20 μg/kg共3個水平的混合標準工作溶液，進行加標回收試驗，每個水平平行測試6個樣本，結果見表4。在5～20 μg/kg添加范圍內(nèi)，平均回收率為80.7%～112%，相對標準偏差(RSD)為2.5%～8.6%。

表4 7種頭孢類藥物的平均加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 4 Average spiked recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 7 cephalosporins(n=6)

2.5 實際樣品的檢測

用本方法對市售的20份豬肉樣品進行檢測，同時作加標回收質控實驗。結果顯示，所有的樣品均未檢出上述7種頭孢菌素化合物，且質控樣品中7種頭孢菌素的回收率均大于80%，根據(jù)國家標準(GB/T 27404-2008)《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》附錄F.1中的規(guī)定，當被測組分含量小于0.1 mg/kg時，回收率應在60%～120%之間，本次質控回收率均能達到實驗室質控分析要求，結果準確可靠。

3 結論

本文建立了液相色譜-串聯(lián)質譜檢測豬肉中7種頭孢菌素類藥物殘留的方法。采用乙腈水溶液作為提取液，正己烷脫脂后，采用HLB和MAX雙固相萃取小柱對樣品進行凈化，方法的回收率和精密度均能滿足實驗要求，方法具有檢測限低，定量準確等特點，適用于豬肉中頭孢菌素類藥物的殘留檢測。