DNA甲基化檢測研究進(jìn)展

唐文悅， 孫欣楠， 張麗瑤*，

(1.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,雜交水稻國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430072； 2.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072)

1 引言

DNA甲基化，一種重要的表觀遺傳修飾，指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，甲基供體(S-腺苷甲硫氨酸)的甲基基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到DNA胞嘧啶或腺嘌呤上的過程。DNA甲基化已被發(fā)現(xiàn)在基因表達(dá)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和染色體穩(wěn)定性維持等關(guān)鍵生物學(xué)過程中起重要作用[1]。在原核生物中，DNA甲基化可發(fā)生在胞嘧啶或腺嘌呤上，DNA甲基化不僅參與染色質(zhì)復(fù)制和修復(fù)等過程，還保護(hù)宿主自身的DNA不被自身限制性修飾系統(tǒng)中限制性內(nèi)切酶切割，而同時(shí)使入侵的噬菌體DNA被切割降解[2]。在真核生物中，DNA甲基化僅僅發(fā)生在胞嘧啶的五位碳上，形成5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine，5mC)，植物中，胞嘧啶的甲基化不僅發(fā)生在CG對稱位點(diǎn)，也發(fā)生在CHG和CHH位點(diǎn)(其中H為A、T或C)，一般CG序列的甲基化概率最高，CHG序列次之，CHH序列最低，且不同植物中甲基化程度各不相同。擬南芥基因組中，約24%CG、6.7% CHG 和1.7%CHH位點(diǎn)被甲基化，而水稻對應(yīng)的甲基化占比分別是54.7%、37.3%和12%，明顯高于擬南芥中的值[3]。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化幾乎只發(fā)生在對稱的CG位點(diǎn)，約80%的體細(xì)胞基因組DNA CG位點(diǎn)均發(fā)生高度甲基化[4]。DNA的甲基化主要由兩類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶完成，即維持型甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)和從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3a和3b?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)DNMT1和DNMT3對于哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育是必須的[5]。在小鼠中，DNMT1單純合突變體或DNMT3a和3b雙純合突變體胚胎均不能存活，且DNMT3a和DNMT3b之間存在功能冗余[5]。甲基轉(zhuǎn)移酶對胚胎發(fā)育的重要性不局限于哺乳動(dòng)物中。如擬南芥中，MET1(DNMT1同源基因)突變體中也存在胚胎致死現(xiàn)象[6]。已發(fā)現(xiàn)人類多種疾病的發(fā)生如癌癥[7.8]、心血管疾病[9]、帕金森病[10]等與DNA甲基化密切相關(guān)。如通過將整體降低小鼠基因組甲基化水平可導(dǎo)致T-細(xì)胞淋巴癌的發(fā)生[8]。在多種癌組織中存在異常的甲基化現(xiàn)象，通常表現(xiàn)為整體基因組的低甲基化和特異啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化，DNA甲基化圖譜分析正成為臨床癌癥診斷的方法之一[11]。

在真核生物中，不僅存在DNA甲基化，還存在DNA去甲基化。哺乳動(dòng)物中，DNA去甲基化由10/11易位(Ten-Eleven-Translocation，TET)家族蛋白完成。TET蛋白可催化5mC生成5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)，5hmC再被TET蛋白催化生成5-醛基胞嘧啶(5-Formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-Carboxylcytosine，5caC)，5fC和5caC被胸腺嘧啶DNA糖苷酶(Thymine DNA glycosylase，TDG)識(shí)別切除，形成無嘧啶位點(diǎn)，隨后該位點(diǎn)被堿基切除修復(fù)途徑中酶修復(fù)，生成胞嘧啶，完成DNA去甲基化過程[12,13](圖1)。5hmC是一種穩(wěn)定的DNA修飾[14]，存在于動(dòng)物細(xì)胞和組織中。癌細(xì)胞基因組中存在整體的5hmC缺失，低量的5hmC已經(jīng)成為癌癥治療預(yù)后差的一個(gè)標(biāo)志[15]。綜上所述，建立高靈敏度和可靠的甲基化檢測方法對研究疾病發(fā)生機(jī)理，建立有效的診斷和治療策略具有重要意義。目前，DNA甲基化分析與研究技術(shù)不僅可以在特定基因水平上分析DNA甲基化，還可以分析基因組特定區(qū)域以及全基因組中的DNA甲基化變化。按照研究技術(shù)原理不同，DNA甲基化分析與研究方法可分為基于堿基分離的分析技術(shù)、基于甲基化敏感限制性內(nèi)切酶處理的技術(shù)、基于亞硫酸氫鹽處理的技術(shù)、基于親和富集處理的技術(shù)等。本文根據(jù)檢測技術(shù)原理不同介紹了DNA甲基化分析和檢測方法的研究進(jìn)展，為未來深入研究DNA甲基化提供參考。

圖1 DNA甲基化和去甲基化動(dòng)態(tài)過程[13]Fig.1 Dynamic regulation of DNA methylation and demethylation[13]

2 DNA甲基化分析和檢測技術(shù)

2.1 基于堿基分離的分析技術(shù)

高效液相色譜法(HPLC)可將DNA水解成單個(gè)脫氧核糖核苷，分離并檢測脫氧胞苷和5-甲基脫氧胞苷從而計(jì)算出基因組中5mC含量[16]。1980年，Kuo等首次利用高效液相色譜紫外檢測法分析基因組中5mC的含量[17]。隨著質(zhì)譜(MS)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[16]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)[18]使得5mC檢測的選擇性和靈敏度明顯增強(qiáng)。由于具有高的準(zhǔn)確度和靈敏度，HPLC-MS是檢測全基因組5mC含量的金標(biāo)準(zhǔn)方法。

2000年，F(xiàn)raga等提出一種新的甲基化胞嘧啶分離檢測技術(shù)，即高效毛細(xì)管電泳法(High performance capillary electrophoresis，HPCE)[19]。與HPLC相比，HPCE具有進(jìn)樣量更低、成本低、分析速度快等特點(diǎn)，已被用于檢測人全血中5mC的含量，12 min內(nèi)完成分離與檢測[20]。但HPLC與HPCE方法均不能了解5mC的具體位置信息，即無法得知基因組序列信息。

2.2 基于甲基化敏感限制性內(nèi)切酶處理的分析技術(shù)

甲基化敏感限制性內(nèi)切酶(Methylation Sensitive Restriction Enzymes，MSRE)是一類對其識(shí)別位點(diǎn)含有甲基化堿基敏感的限制性內(nèi)切酶，利用消化處理可以特異性識(shí)別甲基化序列，這類酶一般只能識(shí)別一個(gè)甲基化堿基位點(diǎn)。甲基化敏感性內(nèi)切酶消化后擴(kuò)增方法操作簡便、應(yīng)用范圍廣，但只能定性或半定量的檢測目的片段的某一位點(diǎn)甲基化狀態(tài)，不能定量，若酶消化不完全則會(huì)影響結(jié)果。甲基化敏感性內(nèi)切酶消化聯(lián)合Southern雜交技術(shù)還可以獲得染色質(zhì)重復(fù)序列的甲基化狀態(tài)[21]。Southern雜交是對基因組DNA特定序列進(jìn)行定位的分析方法，通過標(biāo)記探針與膜上DNA進(jìn)行雜交可檢測目標(biāo)DNA片段中是否存在與探針同源的序列。Southern雜交不僅可用于DNA圖譜分析，轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)檢測等方面，還可用于DNA甲基化分析。采用HpaⅡ或MspⅠ酶切基因組結(jié)合Southern雜交可分析擬南芥著絲粒180bp重復(fù)序列的甲基化[21]。在眾多的甲基化敏感性內(nèi)切酶中，值得一提的是McrBC，一種GTP依賴的DNA內(nèi)切酶，該酶作用原理和上述HpaⅡ和MspⅠ相反，對高甲基化DNA有強(qiáng)切割活性，而對非甲基化DNA活性低，利用McrBC消化基因組后PCR可知基因組某一片段的甲基化水平[22]。

2.3 基于亞硫酸氫鹽處理的測序技術(shù)

2.3.1 經(jīng)典亞硫酸氫鹽測序亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite sequencing，BS-seq)是目前研究DNA甲基化最重要的方法。其原理是利用亞硫酸氫鹽對非甲基胞嘧啶的高效脫氨作用，生成尿嘧啶(轉(zhuǎn)化原理和過程見圖2)，在隨后的測序中被讀成胸腺嘧啶T，而5mC和5hmC均對亞硫酸氫鹽不敏感，通過PCR產(chǎn)物直接測序或挑克隆測序可判斷DNA的甲基化[23,24]。該方法精確度高，可知目的片段每一個(gè)CG、CHG、CHH位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，被認(rèn)為是DNA甲基化檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但缺點(diǎn)如下：(1)不能區(qū)分5mC和5hmC；(2)出現(xiàn)轉(zhuǎn)化不完全的情況；(3)耗時(shí)長；(4)通過克隆拷貝數(shù)計(jì)算甲基化程度有一定誤差。

圖2 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化胞嘧啶生成尿嘧啶的過程[24]Fig.2 The mechanism of nucleotide conversion from cytosine to uracil with bisulfite treatment [24]

2.3.2 甲基化特異性PCR甲基化特異性PCR(Methlation specific PCR，MSP)法是一種分析CpG島DNA甲基化模式的方法[25]。首先亞硫酸氫鹽對DNA轉(zhuǎn)化處理，然后PCR擴(kuò)增，為了區(qū)分甲基化或非甲基化DNA，需兩對引物，一對引物對甲基化DNA有特異性，另一對引物對甲基化DNA沒有特異性。如果DNA在引物覆蓋位點(diǎn)內(nèi)不含甲基化，則發(fā)生非甲基化引物對擴(kuò)增，反之亦然。MSP可快速評估CpG島的甲基化，不需要克隆或甲基化敏感的內(nèi)切酶，可對少量DNA及石蠟包埋樣本進(jìn)行分析[25],該方法中引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵[26]。

Eads等[27]將MSP與熒光定量PCR結(jié)合，開發(fā)出甲基化定量PCR技術(shù)(命名為MethyLight)。MethyLight特異性好、敏感性強(qiáng)，特別適合在非甲基化DNA高背景下檢測低頻甲基化DNA區(qū)域[27]。將MethyLight與數(shù)字PCR(Digital PCR)相結(jié)合可明顯提高DNA檢測靈敏度[28]。MethyLight檢測結(jié)腸癌基因組上相關(guān)位點(diǎn)的甲基化可預(yù)測臨床上癌治療效果，高甲基化病人預(yù)后差于低高甲基化病人[29]。

2.3.3 亞硫酸氫鹽焦磷酸測序焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種利用酶偶聯(lián)反應(yīng)和生物發(fā)光實(shí)時(shí)監(jiān)測伴隨核苷酸摻入的焦磷酸鹽釋放過程的DNA測序技術(shù)[30]。亞硫酸氫鹽焦磷酸測序是指首先亞硫酸氫鹽處理基因組，再用焦磷酸測序技術(shù)測定目標(biāo)位點(diǎn)中C/T的比率，以此判斷目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度。該技術(shù)成本效益高，快速、且能準(zhǔn)確定量，但最大的限制是讀取片段短，可分析的CG位點(diǎn)少，通過連續(xù)測序可提高分析范圍[31]。目前，亞硫酸氫鹽焦磷酸測序已被用于多種疾病標(biāo)志基因的啟動(dòng)子甲基化分析，如PCDH10[32]和KEAP[33]等。

2.3.4 全基因組亞硫酸氫鹽測序全基因組亞硫酸氫鹽測序(Whole-genome bisulfite sequencing，WGBS)是將亞硫酸氫鹽處理過的DNA構(gòu)建文庫并與處理前的對照文庫比對測序，通過比對堿基差異判斷甲基化水平，可生成最全面、最高分辨率的DNA甲基化圖譜，適用于所有具有參考基因組的物種[34]。WGBS通常需要30×以上覆蓋范圍測序，因此對于那些具有較大甲基組的樣本而言(如人類和玉米)，價(jià)格昂貴。但由于所獲信息最全面，可靠性強(qiáng)，因此WGBS是目前國際上研究基因組甲基化項(xiàng)目的金標(biāo)準(zhǔn)[35]。當(dāng)前WGBS技術(shù)已成熟，詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟和最新的技術(shù)流程已被很好的總結(jié)比較[36]，并成功用于大型植物基因組(玉米和大豆)的甲基化測序[37]。

2.3.5 簡化代表性亞硫酸氫鹽測序由于WGBS費(fèi)用高，2005年，Meissner等[38]提出了簡化代表性亞硫酸氫鹽測序(Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)。該方法是首先利用特異性限制性核酸內(nèi)切酶(如MspI)消化基因組DNA，電泳并回收所需要大小的片段，隨后亞硫酸氫鹽測序。相較WGBS，RRBS僅對基因組1%的區(qū)域進(jìn)行測序，成本低，測序深度更大，數(shù)據(jù)利用率更高，但不能獲得完整的全基因組甲基化信息[39]。由于玉米基因組上沒有大量CG島，MspI酶切不合適，改用MseI酶切，RRBS被成功用于檢測玉米基因組的甲基化，盡管只有四分之一的基因組被覆蓋，但84%啟動(dòng)子區(qū)域可被檢測[40]。通過比對測序，RRBS可用于無參考基因組的不同物種之間的甲基化比較分析，為解析DNA甲基化分子機(jī)制提供工具[41],但對無參考基因組的物種來說，RRBS具有很大局限性[42]。

2.3.6 TET酶或化學(xué)試劑輔助亞硫酸氫鹽測序經(jīng)典亞硫酸氫鹽測序技術(shù)無法區(qū)分5mC和5hmC，針對于此，Booth等建立了氧化亞硫酸氫鹽測序(Oxidative bisulfite sequencing,oxBS-seq)[43,44]。該方法首先利用釕酸鉀(KRuO4)氧化基因組，將5hmC氧化成5fC，隨后亞硫酸氫鹽處理將未甲基化胞嘧啶和5fC均轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，可特異性檢測5mC，通過對比經(jīng)典亞硫酸氫鹽測序結(jié)果，還可獲得全基因組中5hmC的情況。自2012年以來，oxBS-seq技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種生物樣品的5mC和5hmC檢測，如癌組織和人胎盤等[45 - 47]。

TET輔助亞硫酸氫鹽測序(TET-assisted bisulfite sequencing，TAB-seq)方法是一種僅針對5hmC直接檢測的測序方法[48，49]。首先糖基化對5hmC進(jìn)行保護(hù)，然后利用TET酶將5mC和5fC完全氧化為5caC，亞硫酸氫鹽處理后5caC轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，PCR擴(kuò)增和測序后5mC和5fC為胸腺嘧啶T，而5hmC為胞嘧啶信號(hào)C。通過該方法檢測人和小鼠胚胎干細(xì)胞基因組中5hmC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5hmC幾乎僅存在CG上，其豐度明顯低于5mC，5hmC和5mC均富集于末端調(diào)控元件上，而少有富集在啟動(dòng)子和基因上[48]。

2.4 基于親和富集處理的測序技術(shù)

2.4.1 DNA甲基化免疫沉淀芯片檢測或測序在哺乳動(dòng)物中，5mC占所有堿基的約1%，豐度較低，富集含有5mC的片段有助于后續(xù)的DNA建庫測序，通過5mC抗體或與含5mC的DNA特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)可富集甲基化DNA。2005年，Weber等[50]提出了甲基化DNA免疫沉淀富集技術(shù)，該技術(shù)利用5mC單克隆抗體富集高度甲基化單鏈DNA片段。方法的基本步驟是將基因組DNA超聲斷裂成300～600 bp，隨后95度變性，再用5mC單克隆抗體溫育及蛋白A/G標(biāo)記的磁珠或瓊脂糖珠富集，提純后芯片分析或測序。由于高通量測序所獲信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DNA芯片，因此DNA甲基化免疫沉淀測序(Methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-seq)技術(shù)已成為人類疾病與健康中表觀遺傳學(xué)研究最重要的技術(shù)[51，52]。MeDIP-seq無需深度測序，成本低，富集后測序，靈敏度高(即DNA用量少，可低至50 ng[53])，近年來已成功用于外周血中游離DNA的甲基化分析，為尋找新的癌癥標(biāo)記物提供了良好工具[54，55]。但該方法的結(jié)果依賴于抗體質(zhì)量，高特異性的單克隆抗體是必須的。

2.4.2 甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白富集測序甲基化DNA特異性結(jié)合蛋白富集測序技術(shù)(Methyl-CpG binding domain protein-enriched genome sequencing，MBD-seq)原理與MeDIP-seq相似，都是基于特異蛋白對甲基化DNA的高親和性，將其富集。甲基化CpG結(jié)合(Methyl-CpG-binding domain，MBD)蛋白家族中的某些具有相似MBD結(jié)構(gòu)域蛋白能結(jié)合甲基化的雙鏈DNA。四種MBD蛋白(MBD1,MBD2,MeCP2,MBD4)可高特異性結(jié)合甲基化雙鏈DNA，被晶體結(jié)構(gòu)和核磁共振技術(shù)證實(shí)[56,57]。由于具有強(qiáng)親和性等優(yōu)點(diǎn)，MBD2常被用于MBD-seq[58,59]。甲基CpG結(jié)合域蛋白3-like-1(MBD3L1),一種MBD2結(jié)合蛋白，在實(shí)驗(yàn)中常作為輔助蛋白以增加MBD2對甲基化DNA的結(jié)合力，促進(jìn)甲基化DNA結(jié)合復(fù)合物的形成，提高富集效果[60，61]。同MeDIP-seq相比，MBD-seq實(shí)驗(yàn)中無需將DNA變性，且傾向于富集高密度的甲基化CG島[62]。方法經(jīng)濟(jì)有效，可用于大批量樣品的甲基化檢測[63]。同MeDIP-seq技術(shù)，MBD-seq具有靈敏度高，可用于檢測外周血中游離DNA的甲基化[64]。

和基于亞硫酸氫鹽處理的測序技術(shù)相比，基于親和富集處理的測序技術(shù)成本低，特異性高，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是不能定量，分辨率低(通常是150 bp左右,無法達(dá)到單堿基分辨率)，難以獲得低甲基化區(qū)域信息[57]。

2.5 不依賴于亞硫酸氫鹽的DNA甲基化測序

經(jīng)典的亞硫酸氫鹽處理基因組DNA會(huì)導(dǎo)致基因組的大量降解，限制了少量樣品的分析[65]。針對于此，2019年，Liu等[66]人建立了TET輔助吡啶硼烷測序法(TET-assisted pyridine borane sequencing，TAPS)，避免了基因組的大量降解。首先利用TET酶將5mC和5hmC氧化成5caC/5fC，隨后5caC/5fC被吡啶硼烷還原形成二氫尿嘧啶(dihydrouracil，DHU，圖3)，PCR擴(kuò)增測序后被識(shí)別為胸腺嘧啶T，未甲基化胞嘧啶保留為胞嘧啶，從而可檢測基因組中5mC和5hmC(圖4)，同亞硫酸氫鹽測序相同，TAPS不能區(qū)分5mC和5hmC。若將5hmC利用糖基化進(jìn)行保護(hù)，隨后TET氧化和吡啶硼烷還原，則可特異性檢測5mC，5hmC保護(hù)酶為β-糖基轉(zhuǎn)移酶(β-glucosyltransferase)，方法命名為TET輔助吡啶硼烷測序法β(TET-assisted pyridine borane sequencing withβ-glucosyltransferase，TAPSβ)[66]。若將TET酶用氧化劑釕酸鉀(KRuO4)代替，特異性氧化5hmC成5fC，再吡啶硼烷還原將5fC轉(zhuǎn)化成二氫尿嘧啶，則可特異性檢測5hmC，方法命名為化學(xué)輔助吡啶硼烷測序(chemical-assisted pyridine borane sequencing,CAPS)[66]。TAPSβ和CAPS方法已被證實(shí)可分別用于全基因組的5mC特異檢測和5hmC特異檢測[67]。TAPS方法靈敏度高，10 ng DNA(1～3 mL血漿)[68]即可分析外周血游離DNA的甲基化。

圖3 TET氧化5mC和5hmC及吡啶硼烷還原5caC生成二氫尿嘧啶的過程[66]Fig.3 The mechanism of nucleotide conversion from 5mC and 5hmC to dihydrouracil with TET and pyridine borane treatment [66]

圖4 TET輔助吡啶硼烷測序原理Fig.4 The sequencing principle for DNA methylation with TET and pyridine borane

同樣針對亞硫酸氫鹽處理的大量DNA降解問題，2021年，Sun等[69，70]建立了不依賴于亞硫酸氫鹽的酶促甲基化測序技術(shù)(Enzymatic methyl-seq，EM-seq)。該方法利用TET酶和β-糖基轉(zhuǎn)移酶氧化和保護(hù)5mC和5hmC，生成5caC或糖基化的羥甲基胞嘧啶，隨后利用胞嘧啶脫氨酶(APOBEC)催化脫氨，未甲基化的胞嘧啶脫氨轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，PCR測序讀為胸腺嘧啶T，而5caC或糖基化的羥甲基胞嘧啶不被脫氨，PCR測序讀為胞嘧啶C，從而可檢測基因組中的5mC和5hmC(圖5)。若利用β-糖基轉(zhuǎn)移酶保護(hù)5hmC，隨后胞嘧啶脫氨酶脫氨，可特異性檢測5hmC，即為APOBEC酶耦合的表觀測序(APOBEC-coupled epigenetic sequencing，ACE-Seq)[71]。同TAPS技術(shù)，EM-seq中DNA基本不降解，所需DNA量少(100 pg DNA即可)，基因組覆蓋度好，數(shù)據(jù)分析速度快等優(yōu)點(diǎn)[70]，表1總結(jié)了以上各種甲基化測序技術(shù)中胞嘧啶C、5mC和5hmC的測序結(jié)果。

圖5 酶促甲基化測序技術(shù)原理Fig.5 The sequencing principle for DNA methylation by enzymatic deamination method

表1 幾種測序方法中5mC和5hmC的測序比較Table 1 Comparison of different methods for 5mC and 5hmC sequencing

2.6 第三代測序技術(shù)

因價(jià)格便宜，實(shí)驗(yàn)流程成熟可靠，短讀大規(guī)模平行測序(Short read massive parallel sequencing)，又稱為第二代測序(Next-generation sequencing,NGS)已成為檢測DNA甲基化水平的標(biāo)準(zhǔn)工具，但短讀技術(shù)有其固有的局限性，如從頭組裝、單倍體定相和結(jié)構(gòu)差異檢測困難等[72]。第三代測序技術(shù)主要包括單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)(Single molecule real-time，SMRT)和單分子納米孔測序技術(shù)(Single-molecule nanopore DNA sequencing)。SMRT技術(shù)由太平洋生物科學(xué)公司(Pacific Biosciences，PacBio)研發(fā)而成[73,74]，測序過程無需PCR擴(kuò)增，可克服二代測序中的結(jié)構(gòu)差異檢測困難等缺點(diǎn)，具有可讀取長片段DNA或RNA序列，可直接檢測DNA的表觀遺傳修飾等優(yōu)點(diǎn)[72,75]。該技術(shù)是基于零模波導(dǎo)孔(Zero Mode Waveguide，ZMW)的單分子檢測技術(shù)發(fā)展而來的一種邊合成邊測序技術(shù)[73,74]。SMRT技術(shù)不僅可區(qū)分常規(guī)堿基，還可以檢測修飾后堿基，其檢測原理是根據(jù)不同的堿基有不同顏色的熒光以及有不同的熒光持續(xù)時(shí)間，如甲基化的腺嘌呤上的時(shí)間遠(yuǎn)長于未甲基化的腺嘌呤[76]。目前SMRT技術(shù)已經(jīng)成功用于DNA甲基化檢測[76,77]。

納米孔測序技術(shù)也是基于單分子檢測的測序技術(shù)，起源于20世紀(jì)80年代末期科學(xué)家提出了一種新型想法，即能否通過電泳將DNA通過納米小孔進(jìn)行測序，隨后大量科學(xué)家進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，獲得了一系列技術(shù)上的突破[78]。該技術(shù)的基本原理是DNA單鏈分子通過納米孔蛋白時(shí)，由于堿基不同導(dǎo)致產(chǎn)生的電流干擾不同，通過檢測電流的變化而區(qū)分堿基[78,79]。2014年，由牛津納米孔技術(shù)公司推出第一臺(tái)商品化的納米孔測序儀(MinION),已被用于甲基化檢測以及臨床上呼吸道的細(xì)菌感染等[80 - 82]。與其他長讀測序儀一樣，納米孔測序的主要缺點(diǎn)是錯(cuò)誤率較高(5%到20%之間)，具體取決于納米孔、文庫制備及數(shù)據(jù)處理方法，錯(cuò)誤包括替換、插入和刪除[83]。相對第二代測序技術(shù)，第三代測序技術(shù)的高錯(cuò)誤率和高費(fèi)用限制了其應(yīng)用。

3 總結(jié)與展望

DNA甲基化作為表觀遺傳最重要的一種修飾，在動(dòng)物與植物中廣泛存在，在多種關(guān)鍵生命過程中起重要作用。DNA甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了生命科學(xué)領(lǐng)域的研究。高效液相色譜法可檢測全基因組中5mC含量，準(zhǔn)確度高，但不能了解甲基化的位置信息；限制性酶切結(jié)合PCR或Southern雜交技術(shù)一次只能檢測單個(gè)位點(diǎn)或某些特異序列的甲基化；親和富集技術(shù)結(jié)合二代測序條件較溫和，靈敏度高，但不能提供單堿基分別率的DNA甲基化圖譜?；趤喠蛩釟潲}處理的測序技術(shù)存在DNA降解問題，導(dǎo)致比對率低。不依賴于亞硫酸氫鹽處理的測序技術(shù)需要利用重組酶，酶的效果是關(guān)鍵因素。第三代核酸測序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了不需PCR的長度測序，但準(zhǔn)確度不夠，費(fèi)用高。由于具有高準(zhǔn)確度和低費(fèi)用，亞硫酸氫鹽結(jié)合二代測序仍是目前甲基化檢測最主要的技術(shù)；改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)或?qū)⒉煌椒ńY(jié)合開發(fā)新的技術(shù)，獲得靈敏度高、特異性強(qiáng)、易操作、高通量的檢測方法仍是未來研究的重點(diǎn)。