唾液外泌體中口腔鱗癌相關(guān)生物標志物研究進展

張芮初, 賈凌飛

(1．北京大學口腔醫(yī)學院，北京 100191； 2. 北京大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科，北京 100081)

外泌體始于質(zhì)膜內(nèi)陷形成的內(nèi)吞囊泡，由內(nèi)體膜向內(nèi)出芽構(gòu)成多泡體，在多泡體與質(zhì)膜融合期間經(jīng)胞吐作用被分泌到細胞外環(huán)境中。外泌體可由多種類型的細胞產(chǎn)生，廣泛存在于多種體液中，例如血液、尿液、唾液、乳汁、羊水等[1]。外泌體中內(nèi)容物的變化可以作為診斷及判斷疾病預(yù)后的生物標志物[2]。與血液相比，唾液有易采集、不易凝結(jié)等優(yōu)點，而且唾液中的大部分成分來自于血液，受身體生理和病理變化的影響，全新的無創(chuàng)唾液診斷正在興起[3]。本文僅就唾液外泌體作為口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)及口腔潛在惡性疾病(oral potentially malignant disorder, OPMD)相關(guān)潛在生物標志物的研究進行綜述。

1 唾液外泌體的成分與特性

唾液外泌體為平均直徑30～100 nm的杯狀囊性小泡，具有完整的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，以保護和運載其中的脂質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)和微小RNA(micro RNA，miRNA)等[2]。

通常唾液外泌體的膜蛋白標志物有四跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81等)、水通道蛋白(AQP5)、主要組織相容復(fù)合物Ⅰ類和Ⅱ類蛋白等；其磷脂雙分子層內(nèi)包含了各種細胞質(zhì)蛋白，如酶、熱休克蛋白、細胞骨架蛋白、內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體相關(guān)蛋白，免疫球蛋白IgA和聚合免疫球蛋白受體以及來自親代細胞的膜融合/轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白等[1-2]。唾液外泌體中也發(fā)現(xiàn)與細胞中Wnt5B/β-catenin信號通路、Delta樣配體4/Notch信號通路以及泛化素通路等相關(guān)的蛋白[4]。

除蛋白質(zhì)外，唾液外泌體還攜帶大量生物活性物質(zhì)，如mRNA、miRNA以及細胞因子等。近年來，人們越來越關(guān)注miRNA作為潛在的生物標志物，用于診斷、預(yù)后和評估多種疾病的治療效果。miRNA是小的、非編碼RNA，長度約為19～23個核苷酸。miRNA通過3’UTR與mRNA結(jié)合，參與轉(zhuǎn)錄和翻譯后的基因表達調(diào)控。miRNA參與多種細胞過程，如細胞凋亡、增殖和分化等。研究[5]發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達與越來越多的疾病狀態(tài)有關(guān)，包括惡性腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)退化和自身免疫性疾病等。

2 唾液外泌體的分離

2.1 傳統(tǒng)的外泌體分離方法傳統(tǒng)的外泌體分離方法主要有差速超速離心法、超濾法、尺寸排除色譜法、聚合物沉淀法和免疫分離法。

差速超速離心法利用外泌體在高速旋轉(zhuǎn)時沉降系數(shù)不同來分離唾液外泌體。該方法產(chǎn)量高，操作簡單，不受分離試劑的污染，是目前應(yīng)用最廣泛的提取外泌體的方法；其缺點是工藝復(fù)雜、操作時間長、要使用專用的設(shè)備。另外，超高速離心容易引起外泌體破裂，導(dǎo)致收集到的唾液外泌體量變小[6]。

超濾法使用基于不同截留相對分子質(zhì)量的超細納米膜來選擇性分離樣品，得到外泌體。雖然超濾速度快，不需要任何特殊設(shè)備，但附著在濾過膜上可能會對唾液外泌體膜造成損害，從而影響其生物活性[7]。尺寸排除色譜法基于凝膠孔徑與樣品分子相對大小的溶質(zhì)分離，可以去除非外泌體結(jié)合的可溶性蛋白和其他污染物，還可將小囊泡與大囊泡分開，但是無法區(qū)分相同大小的外泌體和微泡。這種方法提取的外泌體純度和完整性較好，但是樣品產(chǎn)量少[8]。

聚合物沉淀法是一種最簡單的外泌體分離方法。樣品經(jīng)低速離心預(yù)處理去除細胞碎片，然后加入聚乙二醇等聚合物與樣品共孵育。該方法可以提取大量的外泌體，但非外泌體顆粒可能與產(chǎn)物共同分離出來，會影響制備的純度[9]。

免疫分離法利用外泌體表達常見的靶蛋白，通過磁珠、酶聯(lián)免疫吸附劑測定、流式細胞術(shù)等捕獲外泌體。其中磁珠法比較常用，該方法是將磁珠涂上相應(yīng)抗原(如抗CD9、抗CD63等)，孵育后與樣品結(jié)合，從而吸附分離樣品中相關(guān)的靶蛋白[7]。該方法提取的外泌體特異性最高，但酸性和低滲溶液不利于外泌體的形態(tài)和生物活性的維持。價格也限制了其普及。

2.2 基于微流體的分離技術(shù)為了克服以上幾種傳統(tǒng)的外泌體分離技術(shù)的缺陷，微流體利用單個芯片分離和檢測外泌體，因其簡單、性價比高、易于自動化、能精確處理微尺度、分析時間短、樣品和試劑消耗量小而受到關(guān)注。尤其是無標記的方法在成本、時間、可重復(fù)性、減少潛在的樣品污染、保持外泌體天然特性方面更具優(yōu)勢[10]。最近Chen等[11]提出的EXODUS超快速外泌體分離系統(tǒng)，在納米多孔陽極氧化鋁雙膜過濾結(jié)構(gòu)中引入雙耦合諧波振蕩，橫波聲控流抑制了結(jié)垢效應(yīng)，避免了流速下降。實驗證明EXODUS在產(chǎn)量、速度和純度上優(yōu)于現(xiàn)有的外泌體分離技術(shù)。

3 唾液外泌體中OSCC的潛在生物標志物

OSCC占口腔癌的90%以上，可發(fā)生在上下頜牙齦、舌、頰部、口底、顎部等部位，5 a生存率只有50%左右，早發(fā)現(xiàn)和早治療對于患者至關(guān)重要[12]。因缺乏明顯的早期癥狀，導(dǎo)致大多數(shù)OSCC病例只能在晚期被診斷出來[13]。組織活檢手段并不適合日常篩查，臨床上非常需要唾液外泌體生物標志物這樣的成本效益高、簡單、非侵入性的即時檢測技術(shù)，從而更方便開展OSCC的早期診斷和預(yù)后跟蹤。

3.1 唾液外泌體中的OSCC相關(guān)標記蛋白Winck等[14]首次對OSCC患者和健康個體唾液外泌體的蛋白進行了質(zhì)譜分析。在檢測的381個蛋白中，有8個蛋白 (A2M、HPA、MUC5B、LGALS3BP、IGHA1、PIP、PKM1/M2、GAPDH)的表達在病例組和對照組之間有顯著差異，顯示一些免疫反應(yīng)的過程與OSCC有關(guān)，并提示對外泌體進行蛋白質(zhì)組學分析有助于輔助醫(yī)生對OSCC患者的早期診斷和預(yù)后判斷。

Zlotogorski-Hurvitz等[15]使用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡發(fā)現(xiàn)OSCC患者唾液外泌體的數(shù)量及體積相較健康個體有所增加，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗和蛋白質(zhì)印跡發(fā)現(xiàn)OSCC患者唾液外泌體中CD63的表達升高而CD9和CD81的表達顯著降低。這些結(jié)果表明，唾液外泌體的形態(tài)改變和表面標志物表達水平具有早期診斷OSCC及OSCC高危人群的潛力。

3.2 唾液外泌體中的OSCC相關(guān)標記miRNA唾液外泌體中miRNA作為OSCC生物標志物的研究開始得比較早，miR-125、miR-200a和miR-31是近些年比較受關(guān)注的幾種唾液外泌體miRNA，前兩者在OSCC患者的唾液中顯著降低，而miR-31則在OSCC患者唾液中過度表達，這3種miRNA被廣泛建議潛在用作診斷和監(jiān)測OSCC的發(fā)展[2]。

Gai等[16]對來自O(shè)SCC患者和健康對照者的唾液外泌體中的miRNA進行分析發(fā)現(xiàn)，OSCC組織中miR-512-3p和miR-412-3p相對于對照組顯著上調(diào)，具有較高的敏感度和特異性，而miR-302b-3p和miR-517b-3p僅在OSCC組織中表達，提示唾液外泌體中這4種miRNA有作為早期診斷OSCC生物標志物的可能。

He等[17]通過miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，OSCC患者唾液外泌體中miR-24-3p的表達顯著增加，且具有較高的敏感性和特異性；此外，miR-24-3p的過表達還促進了OSCC細胞的增殖并調(diào)節(jié)了細胞周期相關(guān)基因的表達。這提示miR-24-3p有作為OSCC早期診斷指標及靶向治療的靶點的潛力。

Mehterov等[18]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p在OSCC患者的唾液外泌體中相較健康個體顯著下調(diào)，具有較高的敏感性和特異性，表明其具有作為OSCC診斷標志物的價值；研究還發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p的靶基因中有31個參與p53和Wnt信號通路，并可以調(diào)控OSCC的生長、轉(zhuǎn)移和放療抗性。

3.3 OSCC的唾液外泌體光譜特征Zlotogorski-Hurvitz等[19]利用傅里葉變換紅外光譜儀觀察到OSCC患者唾液外泌體的核酸內(nèi)磷酸鍵的吸收帶和膜脂帶強度低于健康個體，而糖原帶、核酸帶和amine Ⅱ膜蛋白強度高于健康個體，顯示出OSCC唾液外泌體的特定紅外光譜特征。這種方法區(qū)分OSCC和健康個體具有100%的敏感性和89%的特異性。這表明傅里葉變換紅外光譜儀有應(yīng)用于診斷早期OSCC并監(jiān)測OSCC前病變的風險人群的潛力。此外，因其在早期和晚期OSCC中的結(jié)果不同，也可用于OSCC患者隨訪。

4 唾液外泌體與OPMD

OPMD是一種重要的癌前病變，包括口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)、口腔白斑病(oral leukoplakia, OLK)、口腔紅斑病、口腔黏膜下纖維病變(oral submucous fibrosis, OSMF)等。據(jù)推測，OPMD患者罹患OSCC的風險是普通人的5～100倍[20]?？紤]到OPMD的惡性傾向，OPMD患者應(yīng)當定期跟蹤病情的進展乃至進行終生隨訪。相比組織病理活檢和血液檢查，唾液外泌體檢查的非侵入性就體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。

4.1 OLP的唾液外泌體標記OLP是以T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)異常激活的慢性炎癥，表現(xiàn)為基底角質(zhì)細胞液化變性以及淋巴細胞的帶狀上皮下浸潤，臨床上可能呈現(xiàn)角化、紅斑和潰瘍性病變等癥狀。目前，WHO已將其定義為癌前病變[21]。據(jù)報道，相較于健康個體，OLP患者及OSCC患者的唾液外泌體中miR-21水平升高、miR-125a水平降低，說明這2種改變可能預(yù)示著預(yù)后不良。相反，與健康個體相比，發(fā)育不良OLP和OSCC患者的miR-31和miR-200a水平顯著增加，但在來自非發(fā)育不良OLP患者的樣本中沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象；相較健康個體及OLP患者，僅OSCC患者的顯著降低，此結(jié)果提示miR-31和miR-200a水平無顯著變化可能表明病情沒有惡性轉(zhuǎn)化[22]。

4.2 其他OPMD中的外泌體目前關(guān)于OLK、口腔紅斑病、OSMF等唾液外泌體生物標志物的獨立研究比較少見，但是已經(jīng)有關(guān)于OPMD唾液外泌體的復(fù)合研究。Al Rawi等[23]通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)唾液外泌體中的miR-375具有作為OSCC等OPMD的臨床診斷與預(yù)后評估生物標志物的潛在應(yīng)用價值。

Uma Maheswari等[24]在一項36例OPMD患者(OLK、OLP和OSMF)參與的唾液miR-21和miR-31評估中，發(fā)現(xiàn)miR-21 和 miR-31 的上調(diào)在OLK和OLP中顯著，在OSMF和具有OLK的OSMF中最小。OPMD嚴重發(fā)育不良與對照組相比，唾液miR-21增加了3.6倍，miR-31增加了2.5倍。說明miR-21與嚴重發(fā)育不良之間存在著明顯關(guān)系，因此在評估OPMD的極早期惡性變化方面，唾液外泌體中的miR-21比miR-31的潛力更大。

最近有學者使用定量酶聯(lián)免疫吸附試驗研究了口腔癌前病變患者及健康個體唾液中可能來自唾液外泌體的IL-6及其mRNA的水平。Scholtz等[25]發(fā)現(xiàn)，與健康個體相比，在癌前病變組中檢測到IL-6 mRNA水平升高，表明唾液IL-6 mRNA水平升高可能與口腔中的腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)。

5 結(jié)語與展望

唾液外泌體已經(jīng)體現(xiàn)出比其他液體活檢的顯著優(yōu)勢，不僅僅體現(xiàn)在采樣的方便、無創(chuàng)方面，而且相比傳統(tǒng)唾液診斷的限制，例如污染以及淀粉酶等蛋白質(zhì)的存在可能掩蓋其他低表達蛋白等，外泌體的高生物穩(wěn)定性、特異性和靈敏性大大增強了唾液外泌體的臨床適用性。唾液外泌體中含有大量的生物分子，這些分子表達水平的變化可用于疾病的早期篩查診斷、監(jiān)測臨床狀態(tài)、疾病進展和治療效果。同時，外泌體具有攜帶生物分子的功能，有潛力發(fā)展成為臨床藥物傳遞載體。到目前為止，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)唾液外泌體可能成為多種口腔惡性病變的生物標志物，但是這方面的研究仍然處于非常早期，還有許多空白需要突破。相信隨著唾液外泌體受重視程度的提高以及技術(shù)的成熟和研究的深入，將會發(fā)現(xiàn)更多特異性和敏感性較高的唾液外泌體生物標志物。