TGF-β及其信號通路在肝臟疾病中的研究進(jìn)展

葉 森，王宏賓，付 永

(1.青海大學(xué) 研究生院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 普通外科，青海 西寧 810000；3.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

肝功能受損可影響機(jī)體的各個(gè)系統(tǒng)，肝臟疾病比任何導(dǎo)致機(jī)體功能失調(diào)的疾病都具威脅性。病毒性肝炎、寄生蟲、酒精、藥物等造成的肝纖維化、肝硬化、肝癌等是最常見的死亡原因之一，嚴(yán)重影響患者日常生活及預(yù)后[1-2]。近年來隨著臨床研究的不斷深入，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，如干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-2等在肝臟疾病病理、生理過程中的作用逐漸明確，并被證實(shí)參與了諸多免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮主導(dǎo)作用。因此，了解TGF-β及其信號通路在肝臟疾病中的具體作用機(jī)制，對肝臟疾病的進(jìn)一步研究及治療具有重大臨床意義。

1 TGF-β及其信號通路

1.1TGF-β組成 根據(jù)序列相似性和信號特異性，可將TGF-β超家族進(jìn)一步分為TGF-β、激活素、抑制素、Nodal、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morpho-genetic protein, BMP)、生長分化因子(growth differentiation factor, GDF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cellderived neurotrophic factor, GDNF)和繆勒氏管抑制物(mullerian in-hibitor substance, MIS)等。TGF-β在胚胎發(fā)育過程中組織細(xì)胞形成及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[3]。TGF-β在機(jī)體大多數(shù)細(xì)胞中均可表達(dá)，在機(jī)體正常生長、發(fā)育和保持機(jī)體平衡中起主導(dǎo)作用。TGF-β的主要配體有3種：TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，三者具有相似的生物活性，通過旁分泌和自分泌途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，在機(jī)體細(xì)胞增殖、凋亡、分化及類固醇生成等過程中起重要作用。TGF-β還有3種相對應(yīng)的TGF-β受體(transforming growth factor-β receptor, TβR)：TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ和TβR-Ⅲ[4]。Smads蛋白作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，活化后在TGF-β信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠?qū)GF-β信號從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，進(jìn)而發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。根據(jù)各自特有的結(jié)構(gòu)和功能，Smads蛋白可分為3種不同的亞型：受體活化型或通路限制性Smad(R-Smads)、共同通路型Smad(co-Smads)和抑制性Smad(I-Smads)。R-Smads為Ⅰ型受體Smads激酶的底物，活化TGF-β信號通路的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8，其中Smad2、Smad3被TGF-β磷酸化，BMP受體使Smad1、Smad5、Smad8磷酸化，故TGF-β信號通路的重要參與者為Smad2及Smad3，而Smad1、Smad5、Smad8則參與了BMP信號的傳遞過程[5-6]。Co-Smads包括Smad4，主要起輔助TGF-β/Smads信號通路進(jìn)行胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。I-Smads包括Smad6及Smad7，具有保守的羧基端MH2結(jié)構(gòu)域，但與R-Smad、co-Smad比較，氨基酸末端區(qū)域高度分化。Smad6優(yōu)先抑制BMP I型受體ALK-3和ALK-6啟動(dòng)的Smads信號，而Smad7則抑制TGF-β和BMP誘導(dǎo)的Smads信號傳導(dǎo)，此外，I-Smads還調(diào)節(jié)一些非Smads信號通路。研究表明，I-Smads功能的發(fā)揮受各種酶的調(diào)節(jié)，包括泛素連接酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶、脫乙酰酶和甲基轉(zhuǎn)移酶等，但這些酶的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究[7-8]。

1.2TGF-β信號通路

1.2.1經(jīng)典的TGF-β/Smads信號通路 正常情況下，TGF-β存在于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，完全處于靜止?fàn)顟B(tài)。信號開始傳遞的標(biāo)志是TGF-β的一個(gè)配體首先與TβR-Ⅱ結(jié)合，將TβR-Ⅰ、TβR-Ⅲ匯聚，然后TβR-Ⅰ發(fā)生磷酸化，TGF-β/Smads信號就發(fā)生了。磷酸化后的TβR-Ⅰ繼續(xù)在其羧基末端的絲氨酸殘基(pSmad2/3C)上將Smad2及Smad3相繼磷酸化，進(jìn)而招募Smad4并與之形成復(fù)合體，實(shí)現(xiàn)信號從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)控相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[9-10]。

1.2.2非經(jīng)典的TGF-β信號通路 除了Smads介導(dǎo)的經(jīng)典TGF-β信號通路外，TβR還能通過各種化學(xué)方式，如磷酸化或者直接作用等，來激活細(xì)胞內(nèi)的其他信號通路，如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)、絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinases, MAPK)及RhoA/ Rho激酶(RhoA/Rho kinase, RhoA/Rock)信號通路等，稱之為非經(jīng)典的TGF-β信號通路[11]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β激活后可以依次活化ERK、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase, p38MAPK)/JNK及Rock等信號通路，參與調(diào)控細(xì)胞的正常生長、遷移、免疫抑制及內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換[12]。

2 TGF-β及其信號通路與肝臟疾病

肝臟疾病影響著全世界數(shù)以百萬計(jì)的人。由于全球現(xiàn)代肝臟疾病學(xué)的預(yù)防、診斷和治療的不斷進(jìn)步，在大多數(shù)發(fā)達(dá)國家慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)的發(fā)病率正在急劇下降[13]。乙型病毒性肝炎抗病毒系統(tǒng)綜合免疫治療方案的不斷擴(kuò)大，大大減少了包括中國在內(nèi)的許多國家的新感染病例數(shù)。但是，CHB仍然是嚴(yán)重威脅我國居民身體健康的慢性傳染疾病之一。此外，由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、細(xì)菌、寄生蟲感染及飲酒、飲食等原因引起的肝纖維化、肝硬化及肝癌仍引起社會(huì)各界密切關(guān)注[14-15]。以下分別闡述TGF-β及其信號通路在CHB、肝纖維化、肝癌、肝棘球蚴病中的研究進(jìn)展。

2.1TGF-β及其信號通路與CHB 研究表明，CHB可引起單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞、T細(xì)胞的天然免疫和適應(yīng)性免疫功能障礙[16]。TGF-β1影響機(jī)體免疫細(xì)胞的發(fā)育和成熟，維持機(jī)體免疫耐受和平衡，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的各個(gè)方面，在CHB發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。輔助性T細(xì)胞17 (T helper cell 17, Th17)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)在CHB的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，Treg主要通過細(xì)胞膜表面的分子與細(xì)胞直接接觸的方式發(fā)揮作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-10和TGF-β發(fā)揮作用。Th17源于原始的輔助性T細(xì)胞，與Treg作用相反，正常情況下兩者保持平衡，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)定。有研究表明，CHB患者外周血中Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1及Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-23的表達(dá)顯著升高，充分證實(shí)Th17/Treg平衡參與CHB的發(fā)生、發(fā)展，而TGF-β1作為Treg代表性細(xì)胞因子通過影響Th17/Treg平衡間接參與CHB的發(fā)生、發(fā)展[18]。

研究還發(fā)現(xiàn)，機(jī)體健康肝細(xì)胞表達(dá)TGF-β1較少，但隨著HBV的感染，肝細(xì)胞相繼發(fā)生變性、壞死、纖維化，共同作用于Kupffer細(xì)胞，刺激其合成、分泌大量的TGF-β1[19]。同時(shí)相關(guān)研究也證實(shí)CHB患者外周血TGF-β1水平明顯高于健康對照組，與HBV-DNA荷載量呈明顯的正相關(guān)[20]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1與CHB抗病毒藥物治療的實(shí)際療效相關(guān)，目前臨床常用的抗病毒藥物，如阿德福韋酯及恩替卡韋等，均可引起HBV-DNA滴度明顯下降，進(jìn)而使TGF-β1水平顯著降低[21]，充分證實(shí)了TGF-β1水平可作為反映CHB患者抗病毒治療效果以及機(jī)體炎癥因子平衡狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。Li等[22]為探討炎癥細(xì)胞因子與CHB發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，選取HBV包膜抗原(HBeAg)陽性患者250例進(jìn)行研究，測定患者入院時(shí)的血清學(xué)指標(biāo)和TGF-β水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β是CHB的獨(dú)立影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)可以通過與Smad4的直接作用激活TGF-β途徑[23]，而Smad7在抗病毒治療成功后炎癥消退的過程中被表達(dá)上調(diào)[24]。后續(xù)仍需進(jìn)一步的研究闡明TGF-β參與CHB發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制。

2.2TGF-β及其信號通路與肝纖維化 肝纖維化是機(jī)體對各種致病因素導(dǎo)致肝細(xì)胞慢性損傷進(jìn)行功能修復(fù)時(shí)發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而引起的慢性肝臟疾病。多種致病因素，如HBV、寄生蟲、乙醇、藥物、脂肪肝、自身免疫性疾病等，均可直接引起肝纖維化，并進(jìn)一步形成肝硬化，甚至肝癌[25]。其中涉及的重要機(jī)制是，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)激活轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞(myofibroblast, MFB)，導(dǎo)致膠原蛋白合成增多，并過量聚積。多種信號通路參與了肝纖維化的發(fā)生，其中在正常肝組織中表達(dá)較低而在肝組織受損時(shí)被激活且表達(dá)增加的TGF-β被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因子。在正常肝臟中，HSCs以靜止的非增殖狀態(tài)存在。在急性和慢性肝損傷期間，ECM中的TGF-β被激活，并在各種細(xì)胞中表達(dá)和釋放。這種情況下，TGF-β的一個(gè)重要靶點(diǎn)是誘導(dǎo)激活并轉(zhuǎn)化為MFB的HSCs，具體機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)維生素A的丟失、成纖維細(xì)胞形狀的適應(yīng)以及收縮、增殖和遷移表型的形成等[26]。ECM主要來源于激活的HSCs、骨髓源性纖維細(xì)胞、發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition, EMT)的肝細(xì)胞和發(fā)生EMT的膽管細(xì)胞。正常肝臟中的ECM處于生成和降解平衡，當(dāng)發(fā)生肝損傷時(shí)，肝臟愈合反應(yīng)使ECM沉積過多而導(dǎo)致纖維瘢痕增生最終發(fā)生肝纖維化[27]。進(jìn)一步研究證明，TGF-β1可通過上調(diào)主要ECM蛋白(如纖維連接蛋白和膠原)、整合素、基底膜蛋白(如層黏連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白和巢蛋白)的表達(dá)使ECM增多；在調(diào)節(jié)ECM功能方面，TGF-β1可在傷口愈合反應(yīng)中誘導(dǎo)ECM中肌腱蛋白表達(dá)，該蛋白在正常肝組織中幾乎不表達(dá)，但在纖維化肝組織內(nèi)可促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖[28]。

下游分子Smad3被認(rèn)為是TGF-β活化HSCs導(dǎo)致纖維化的主要介質(zhì)。研究表明，Smad3和維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)存在關(guān)聯(lián)，TGF-β信號在HSCs的全基因組VDR結(jié)合位點(diǎn)(VDR順反子)中產(chǎn)生再分配，通過TGF-β介導(dǎo)的染色質(zhì)重塑，促進(jìn)VDR與Smad3依賴性靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而使纖維形成，基于這一機(jī)制，VDR配體可抑制TGF-β誘導(dǎo)的HSCs激活，并消除肝纖維化[29]。相關(guān)研究表明，Smad7對TGF-β負(fù)性調(diào)節(jié)作用機(jī)制為通過上調(diào)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)的表達(dá)介導(dǎo)對Smad7表觀遺傳的抑制，從而促進(jìn)TGF-β介導(dǎo)的纖維化[30]。肝纖維化時(shí)，Smad2、Smad3被強(qiáng)烈激活，并且Smad3是導(dǎo)致纖維化的關(guān)鍵因素。Smad4與Smad3相互作用并參與下游促纖維化靶基因的轉(zhuǎn)錄，而Smad7以兩種不同的方式負(fù)調(diào)控TGF-β/Smads信號。一種是Smad7與TβR-Ⅰ結(jié)合以阻止Smad2/3的磷酸化，另一種是Smad7將泛素連接酶E3、Smad泛素化調(diào)節(jié)因子招募到Smad2，TβR-Ⅰ泛素化并降解這兩種蛋白質(zhì)[31]。Smads正負(fù)信號之間的不平衡可能在肝纖維化的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

大多抗纖維化藥物通過TGF-β/Smads信號通路發(fā)揮作用，例如，在肝纖維化大鼠模型中，厚樸酚可抑制TGF-β/Smads信號通路的活化，有效逆轉(zhuǎn)肝損傷；強(qiáng)效精準(zhǔn)的第二代酪氨酸激酶抑制劑尼洛替尼可降低TGF-β1水平，抑制炎性因子的釋放，抑制四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化，發(fā)揮潛在的抗纖維化作用[32-33]。此外，在人源及鼠源纖維化肝組織中，存在10-11易位蛋白3(ten-eleven translocation 3, Tet3)表達(dá)，Tet蛋白屬于一種新的DNA脫甲基酶，在癌癥的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，但對其在肝纖維化中作用和機(jī)制知之甚少。Xu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Tet3和TGF-β1在肝細(xì)胞中存在正反饋，Tet3表達(dá)增加，促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)HSCs分化為MFB，抑制Tet3/TGF-β1信號通路可以減輕小鼠肝纖維化，證明Tet3和TGF-β1是肝纖維化的重要決定因素。因此，深入研究TGF-β/Smads信號通路上下游的調(diào)控機(jī)制有助于更好地研發(fā)靶向抗肝纖維化藥物。但由于TGF-β的生物學(xué)功能廣泛，目前發(fā)現(xiàn)的靶向藥物不良反應(yīng)顯著，已超出了治療獲益， TGF-β及其信號通路在肝纖維化中的作用仍需更進(jìn)一步深入研究。

2.3TGF-β及其信號通路與肝癌 TGF-β作為人體免疫系統(tǒng)的多功能調(diào)節(jié)者，可控制細(xì)胞和組織分化，并維持機(jī)體平衡，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[35]。肝癌的演變過程是一個(gè)多步驟進(jìn)展的過程，大多數(shù)肝癌都發(fā)生在CHB或者肝硬化后。TGF-β及其信號通路在肝癌發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段均發(fā)揮關(guān)鍵作用，在肝癌細(xì)胞和周圍腫瘤基質(zhì)之間發(fā)揮直接介導(dǎo)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在肝癌組織中過表達(dá)[36]，與宋培軍等[37]研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究表明，TGF-β1水平與肝癌進(jìn)展和不良治療結(jié)果直接密切相關(guān)[38]。在肝癌發(fā)生早期，TGF-β可以對肝細(xì)胞的增殖、分化產(chǎn)生明顯抑制作用；在肝癌后期則顯著促進(jìn)ECM的形成、EMT及腫瘤的惡性浸潤，TGF-β信號通路通過各種方式，如充當(dāng)自分泌或旁分泌生長因子，誘導(dǎo)機(jī)體微環(huán)境發(fā)生改變，使之朝促進(jìn)肝癌發(fā)展的方向進(jìn)展[39]。TGF-β也會(huì)引起腫瘤細(xì)胞可塑性的改變，從而賦予移行性腫瘤起始細(xì)胞(tumor-initiating cell, TIC)的特性，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌的發(fā)展[40-41]。TGF-β信號通過多種通路影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展，其中最重要的信號通路是Smads通路。研究證實(shí)，在肝癌發(fā)生、發(fā)展的過程中，TGF-β在病程早期發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展作用，而到病程后期則轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤的作用，并由Smads通路介導(dǎo)[42]。

TGF-β生物學(xué)作用廣泛，其在肝癌中的生物學(xué)作用卻并不常見。要想有效利用肝組織中的TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，需要更好地理解其在肝組織中的復(fù)雜作用，包括對不同類型肝細(xì)胞的多種作用。盡管TGF-β及其信號通路的作用尚未完全明確，但控制TGF-β及其信號通路仍被認(rèn)為是一種延緩肝癌進(jìn)展的好方法[43-44]。進(jìn)一步深入研究TGF-β/Smads通路在肝癌治療中的作用及機(jī)制可為有效防治肝癌的早期發(fā)生及提高后續(xù)治療效果提供理論基礎(chǔ)。

2.4TGF-β及其信號通路與肝棘球蚴病 隨著對各種寄生蟲治療方法的不斷改進(jìn)，華支睪吸蟲、肝片形吸蟲、肝毛細(xì)線蟲所引起的各種肝臟疾病的發(fā)病率已經(jīng)明顯下降，相關(guān)的醫(yī)學(xué)報(bào)道相對較少。但是，我國西部地區(qū)棘球蚴病發(fā)病率仍較高，應(yīng)引起關(guān)注。棘球蚴病多發(fā)于人的肝臟，其次為肺、腦、骨，未及時(shí)治療或長期治療不當(dāng)?shù)母闻菪图蝌驶颊?0～15年死亡率高達(dá)90%，肝囊型棘球蚴病死亡率為2%～4%[45]。棘球蚴侵入中間宿主后，在包囊及一些棘球蟲體的黏液和分泌物聯(lián)合作用下，使機(jī)體的免疫功能發(fā)生一系列變化，并對免疫系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害，逐漸形成一種病理性的免疫逃避機(jī)制。棘球蚴病的自體抗原既可含有感染蟲體、蟲體細(xì)胞表面的自身代謝抗原，也可含有少量來自于感染蟲體內(nèi)部分泌物、排泄物、囊液的自身代謝抗原。這些免疫抗原可直接誘導(dǎo)人體宿主細(xì)胞產(chǎn)生各種免疫應(yīng)答。

TGF-β在肝棘球蚴病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[46]。TGF-β在肝泡型棘球蚴病變組織和器官中明顯升高，特別是在纖維化區(qū)域，提示TGF-β可能引起肝泡型棘球蚴患者組織器官的纖維化和ECM的過度沉積[47]。Wang等[48]采用Westernblot、qRT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測肝泡型棘球蚴感染后第2～360天小鼠模型的TβR、下游Smads信號活化以及纖維化標(biāo)記物的表達(dá)，結(jié)果顯示，在泡球蚴小鼠中TGF-β、TβR及其下游Smads在肝周浸潤和肝細(xì)胞內(nèi)均有明顯表達(dá)，再次驗(yàn)證TGF-β及其信號通路在肝泡型棘球蚴病中起著重要的免疫耐受和肝纖維化作用。Zhang等[49]研究證明，TGF-β的持續(xù)表達(dá)可能導(dǎo)致人自然殺傷細(xì)胞家族2成員D(natural-killer group 2 member D, NKG2D)的調(diào)節(jié)，進(jìn)而抑制NKG2D依賴的細(xì)胞毒性。這種信號系統(tǒng)的異常可能是導(dǎo)致寄生蟲逃避宿主免疫的機(jī)制之一。肝囊型棘球蚴病發(fā)生于中間宿主，但通過抑制TGF-β信號減輕肝囊型棘球蚴病變相關(guān)肝損傷的作用仍有待于進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用TGF-β信號抑制劑和吡非尼酮可降低TGF-β信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和膠原的生成[50]。說明TGF-β在減輕肝細(xì)胞衰老和恢復(fù)肝功能方面具有較高的潛力。目前關(guān)于肝棘球蚴病與TGF-β信號通路的研究不多，缺乏足夠的理論支持，進(jìn)一步研究TGF-β信號通路或能成為肝棘球蚴病相關(guān)性肝纖維化的治療靶點(diǎn)。

3 小結(jié)

綜上，TGF-β及其信號通路在肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。由于TGF-β的生物學(xué)作用廣泛，已研發(fā)的藥品不良反應(yīng)較大，進(jìn)一步明確TGF-β及其信號通路在肝臟疾病中的具體作用機(jī)制，可篩選出與肝臟疾病相關(guān)的治療靶點(diǎn)，為肝臟疾病的進(jìn)一步研究提供更多理論支持。