微球在牙體組織再生領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展

張 祎，趙 彬，王 璐，姚 蔚，郝鳳翔，楊怡天

牙齒脫落是一個全球性的健康問題，由于細(xì)菌入侵、創(chuàng)傷或先天畸形，牙體組織容易失去部分甚至全部結(jié)構(gòu)，不僅影響患者的咀嚼和美觀，更影響其心理健康[1]。牙體組織包括釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙髓、牙骨質(zhì)4種，在組織結(jié)構(gòu)和生理功能上既相互獨立，又彼此依存。由于酸蝕癥、齲病、磨損等各種原因，常造成釉質(zhì)、牙本質(zhì)的脫礦或缺損。隨著粘接技術(shù)和樹脂材料的進(jìn)步，美學(xué)樹脂充填修復(fù)得到了越來越多的青睞。但是樹脂充填存在樹脂變色和脫落的問題，如果缺損范圍過大無法進(jìn)行充填治療則需要行冠修復(fù)等牙體預(yù)備量更大的治療，粘接面邊緣容易發(fā)生微滲漏或者繼發(fā)齲等，最終導(dǎo)致修復(fù)體的失敗[2]。當(dāng)齲壞進(jìn)展到牙髓炎、根尖周炎時則需進(jìn)行根管治療，但治療后的牙齒脆性增加，容易劈裂[3]。再生牙科作為一個新興學(xué)科，研究基礎(chǔ)是牙齒發(fā)育的潛在機(jī)制以及愈合修復(fù)的生物學(xué)過程，利用其自然愈合潛力，再生受損的組織結(jié)構(gòu)[4]。組織工程作為再生學(xué)科的重要組成部分，使牙體組織的再生成為可能。

組織工程技術(shù)三要素分別為干細(xì)胞、支架以及生長因子。微球作為組織工程常用的載體形式，一般是指由可生物降解或可再吸收的高分子聚合物材料制備而成的實心或空心的微納米級球形或類球形顆粒，屬于基質(zhì)-骨架型微粒[5]。有研究表明，與二維支架相比,在微球三維支架中培養(yǎng)的干細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的多向分化潛力[6-8]。微球根據(jù)制備時使用載體材料的不同可以分為天然有機(jī)高分子微球和合成有機(jī)高分子微球。微球的制備方法多樣,包括靜電噴霧法、乳化溶劑揮發(fā)法、相分離法等[9]。在生物學(xué)方面，微球制備所需的材料應(yīng)無毒，具有良好的生物相容性，不影響被載物的理化特性及生物活性，有一定支撐力及可塑能力，在體內(nèi)可完全降解等特性[10]。將具有長效緩釋和靶向作用的微球作為物質(zhì)載體，通過選擇微球基質(zhì)材料的種類，調(diào)控降解速度從而改變被載物釋放速率，有效減少了突釋并保護(hù)了被載物的生物活性[11]。因為牙體缺損通常較小且形狀不規(guī)則，采用局部可用的微球作為組織修復(fù)的可注射細(xì)胞載體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[12]。還可以將微球結(jié)合到可注射水凝膠中應(yīng)用于組織工程，微球的加入不僅可以作為藥物或生長因子的載體，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和組織再生，同時提高水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和孔隙率，有助于細(xì)胞粘附以及物質(zhì)交換[13]。

1 微球與釉質(zhì)再生

1.1 微球在釉質(zhì)仿生再礦化中的應(yīng)用

釉質(zhì)的仿生再礦化是模仿釉質(zhì)生物礦化的原理，在脫礦釉質(zhì)晶體上實現(xiàn)類釉質(zhì)晶體沉積，使釉質(zhì)病損自愈性修復(fù)，達(dá)到與天然釉質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)及功能[14]。在釉質(zhì)齲發(fā)生的早期階段加強(qiáng)再礦化是阻止病變進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。目前的研究主要集中在凝膠環(huán)境下誘導(dǎo)牙釉質(zhì)再生用于臨床再礦化。如Simeonov等[15]在殼聚糖水凝膠中加入了磷酸鈣微球，研究殼聚糖/磷酸鈣復(fù)合凝膠對脫礦牙釉質(zhì)的再礦化作用效果，磷酸鈣微球作為鈣離子和磷酸鹽離子的“儲蓄庫”，可以為脫礦釉質(zhì)的仿生礦化提供充足的礦化離子。但用于釉質(zhì)仿生再礦化的實驗周期長，操作繁瑣，通過再礦化再生的晶體有些是疏松多孔的，不能耐受咀嚼功能活動，限制了其廣泛應(yīng)用。此外，將天然釉質(zhì)發(fā)生過程中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及其衍生物或合成聚合物包裹于微球，加入水凝膠中，利用其與釉質(zhì)發(fā)生過程中微環(huán)境相似的原理，誘導(dǎo)釉質(zhì)再生，可以模擬釉質(zhì)在體內(nèi)的發(fā)生[16]。如Xiao等[17]利用嵌合肽介導(dǎo)羧甲基殼聚糖/無定形磷酸鈣納米復(fù)合物(CMC/ACP)模擬釉質(zhì)生物礦化中釉原蛋白引導(dǎo)ACP定向組裝，此實驗研究表明嵌合肽可以引導(dǎo)降解的CMC/ACP納米顆粒粒子與脫礦的牙釉質(zhì)表面特異性結(jié)合，完成釉質(zhì)樣晶體的快速形成和仿生再礦化，在體外模擬體內(nèi)礦化的過程，結(jié)果表明新形成的釉質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)整齊且有良好的機(jī)械性能。

1.2 微球在釉質(zhì)組織工程中的應(yīng)用

到目前為止,還沒有基于活細(xì)胞的釉質(zhì)組織工程[18]，據(jù)報道，傳代培養(yǎng)的Malassez上皮細(xì)胞在牙冠形成階段可以分化為成釉細(xì)胞樣細(xì)胞，并與牙髓細(xì)胞結(jié)合形成釉質(zhì)樣組織[19]。非牙源性人類上皮來源的細(xì)胞，如人表皮干細(xì)胞(human keratinocyte stem cells，HKSCs)、牙齦上皮細(xì)胞和多能干細(xì)胞等，與人或鼠胚胎牙間充質(zhì)重組時，也可以分化為成釉細(xì)胞從而形成牙體組織[20]。成纖維細(xì)胞生長因子8(fibroblast growth factor 8，F(xiàn)GF8)和Shh(sonic hedgehog)蛋白已被證明可以支持牙齒形成和促進(jìn)成釉細(xì)胞向分化。Hu等[21]將HKSCs與FGF8和Shh蛋白進(jìn)行預(yù)處理后，與小鼠牙間充質(zhì)細(xì)胞重組，形成嵌合牙胚，與載有FGF8和Shh的瓊脂微球一同植入重組牙胚，在裸鼠腎被膜內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，研究結(jié)果表明用FGF8和Shh處理HKSCs，可以有效地誘導(dǎo)干細(xì)胞向成釉細(xì)胞分化，并快速生成釉質(zhì)，再生的牙釉質(zhì)結(jié)構(gòu)與正常釉質(zhì)相似。這些結(jié)果為微球在釉質(zhì)再生中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

2 微球與牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生

牙體組織中的唯一軟組織——牙髓，與硬組織牙本質(zhì)在發(fā)育上同源，結(jié)構(gòu)上緊密相連，功能上相互依存，共同構(gòu)成牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)。牙髓良好的血液供應(yīng)是牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體發(fā)揮生理功能的基礎(chǔ)。由于牙髓血運只能從根端運輸，根尖孔閉合后，血管入口很小(<1 mm)，根管狹窄且形態(tài)多變不規(guī)則嚴(yán)重限制了營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散和血管的生長[22-23]。當(dāng)受到外界刺激后，牙髓通過牙本質(zhì)小管內(nèi)的牙本質(zhì)液感受刺激并作出相應(yīng)反應(yīng)，同時形成第三期牙本質(zhì)即反應(yīng)性牙本質(zhì)，保護(hù)牙髓免受外界刺激和微生物的攻擊，從而使牙髓組織長期存活，但是新形成的第三期牙本質(zhì)中牙本質(zhì)小管數(shù)量少且明顯彎曲，與原有牙本質(zhì)小管不相通[24-25]?；谘浪?牙本質(zhì)復(fù)合體特殊的解剖生理特點，微球載體更適合于牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的再生。

2.1 微球作為細(xì)胞載體在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生中的應(yīng)用

微球作為干細(xì)胞輸送載體在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注，已有很多研究通過將干細(xì)胞負(fù)載在微球中成功地再生了牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體。目前用于牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生的干細(xì)胞主要有牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)、脫落乳牙干細(xì)胞(stem cell populations from human exfoliated deciduous teeth, SHEDs)、牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)、牙根尖乳頭干細(xì)胞(dental papilla stem cells, SCAPs)和牙囊前體細(xì)胞等[26-29]。

其中,來源于牙髓組織或牙髓前體的DPSCs、SHEDs和SCAPs可能是更適合牙髓再生的細(xì)胞來源[30]。Yang等[31]利用甲基丙烯酰明膠(gelatin-methacryloyl, GelMA)優(yōu)異的生物相容性和降解性，采用靜電噴霧法制備了平均直徑200 μm的DPSCs-GelMA的微球，DPSCs能在微球中增殖并且分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。此外，載細(xì)胞的GelMA微球系統(tǒng)能夠經(jīng)受住低溫保存。移植于裸鼠皮下后，載細(xì)胞的GelMA微球組與載細(xì)胞的GelMA塊狀組相比，形成了更多的血管化牙髓樣組織，并有著合適的降解速率。研究表明GelMA微球作為細(xì)胞載體在牙髓再生中顯示出優(yōu)異的性能和巨大的潛力。Zhang等[32]采用靜電微滴法制備了平均粒徑為350～450 μm的可注射RGD-海藻酸鹽/磷灰石水凝膠微球，其中包裹了DPSCs和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，細(xì)胞在微球中可形成細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。引入膨潤土的微球在力學(xué)性能和緩釋性能上都具有可調(diào)性，通過持續(xù)釋放VEGF，可促進(jìn)牙髓樣組織的再生。結(jié)果表明這種水凝膠微球系統(tǒng)在富含微血管的牙髓再生中是一種很有前途的干細(xì)胞支架。Garzón等[33]用聚L-乳酸(Poly(L-lactide)acid，PLLA)分別制備了纖維表面微球和光滑表面微球兩種可注射微球，將DPSCs分別與這兩種微球結(jié)合，形成具有生物活性的可注射聚合物，在體內(nèi)模型中檢測它們促進(jìn)牙髓再生的能力。研究結(jié)果表明，PLLA微球和DPSCs能夠在體外和體內(nèi)模型中促進(jìn)牙髓再生，目前，基于干細(xì)胞的牙髓再生組織工程技術(shù)已經(jīng)成為很有前途的根管治療替代策略[34]。

此外將微球作為細(xì)胞載體的組織工程技術(shù)為牙本質(zhì)的組織再生提供了新的思路。Kuang等[35]研發(fā)了一種新型可注射細(xì)胞載體用于牙本質(zhì)再生，研究結(jié)果表明這種具有互連孔和納米纖維的海綿微球，可以為牙髓干細(xì)胞的增殖分化和牙本質(zhì)組織再生提供有利的微環(huán)境。Wang等[36]研發(fā)了一種載有生長因子的可注射細(xì)胞載體用于牙本質(zhì)再生，通過將聚乳酸納米纖維微球作為細(xì)胞載體，與載有骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)的聚乳酸羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)微球聯(lián)合誘導(dǎo)SCAPs成牙分化，實驗中有成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞和牙本質(zhì)樣組織形成，但不具有典型的管狀牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，聚乳酸納米纖維微球結(jié)合BMP-2的控制釋放可以為SCAPs再生牙本質(zhì)組織提供良好的微環(huán)境。

2.2 微球作為物質(zhì)載體在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生中的應(yīng)用

微球還可以直接作為載體，利用其靶向性和緩釋控釋特性，來運輸各種生長因子、藥物及基因等到達(dá)特定區(qū)域，被載物從微球載體中出來后按一定的釋放速度緩慢釋放，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的再生。

目前用于牙髓再生的生長因子有轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、表皮生長因子和其他血管生成因子等[37-38]。牙髓的活力依賴于血運循環(huán)，微循環(huán)保證了牙髓組織的正常生理功能，同時也是牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體發(fā)育和再生的基礎(chǔ)，通過狹窄的根尖孔建立有效血液循環(huán)是研究者面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。VEGF作為促血管生成最有效的生長因子，在牙髓再生中的應(yīng)用引起了很多研究學(xué)者的關(guān)注。為了評價載VEGF微球促進(jìn)牙髓再生的作用，Li等[39]通過將VEGF與肝素結(jié)合，包裹在肝素偶聯(lián)的明膠納米微球中，這些納米微球進(jìn)一步固定在可注射的PLLA微球的納米纖維中，作為一種層次化生長因子負(fù)載納米纖維微球支架系統(tǒng)，不僅保護(hù)了VEGF不會變性和降解，而且提供了良好的緩釋控釋。此外，這種微球可以有效地容納DPSCs并支持牙髓組織的形成?；铙w研究表明，大量的血管在整個根管中再生，首次證明了一端封閉的全長根管內(nèi)牙髓組織再生的可行性。李祥偉等[40]將DPSCs與載VEGF微球經(jīng)根尖孔注入根管腔,植入裸鼠背部皮下,9周后進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察,空白根管作為空白對照組。結(jié)果表明DPSCs可在載VEGF微球上生長和增殖；DPSCs和載VEGF微球組可在體內(nèi)形成富含微血管的牙髓樣組織，充滿根管全長并達(dá)冠1/3,且伴成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化。

目前被證實可用來促進(jìn)牙本質(zhì)再生的細(xì)胞因子有轉(zhuǎn)化生長因子β超家族(transforming growth factor-β,TGF-β)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子-2、胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-2、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等[41-42]。有學(xué)者研制了一種含有轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的殼聚糖納米微球的羧甲基殼聚糖支架，通過釋放在牙本質(zhì)基質(zhì)形成中起重要作用的TGF-β1,誘導(dǎo)成牙本質(zhì)前體細(xì)胞分化[43]。Toledano等[44]將多西環(huán)素、鈣離子及鋅離子載于聚甲基丙烯酸甲酯納米微球，并將其制備成凝膠用于治療侵蝕性頸部牙本質(zhì)損傷，研究結(jié)果表明載鋅納米微球凝膠可以促進(jìn)牙本質(zhì)礦化，為侵蝕的頸部牙本質(zhì)再生和牙本質(zhì)過敏癥的有效治療提供新的策略。Zhang等[45]通過合成地塞米松空心羥基磷灰石微球，建立了緩釋體系。這種微球具有中空的核心和多孔的殼層結(jié)構(gòu)，能以控釋和緩釋的方式釋放活性物質(zhì)，并可促進(jìn)體外培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，表現(xiàn)為堿性磷酸酶活性和牙源性分化相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，鈣沉積增加。該實驗研究表明地塞米松空心羥基磷灰石微球有望成為治療深齲的潛在生物材料。

2.3 微球作為組織支架在牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生中的應(yīng)用

微球直接作為組織支架，不僅可以為細(xì)胞提供足夠的附著部位，更好地促進(jìn)了細(xì)胞的粘附，細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)的保存還能夠提高移植細(xì)胞的存活率[46]。通過注射生物活性支架，降解后被天然細(xì)胞外基質(zhì)取代，可以促進(jìn)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的再生[47-48]。如Zou 等[49]采用復(fù)乳溶劑萃取法制備PLGA微球支架，進(jìn)行Ⅰ型膠原表面修飾后，與分離出的DPSCs共培養(yǎng)，8周后發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞粘附于微球表面并增殖分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，與基質(zhì)礦化形成了三維復(fù)合體，研究結(jié)果表明這種可注射的PLGA微球支架可能適合牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的再生。張璇等[50]通過乳化交聯(lián)法制備了適宜牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)微球支架，將牙髓干細(xì)胞負(fù)載于HA微球表面進(jìn)行牙髓再生，研究表明這種方法可以解決支架材料降解周期過長而占據(jù)根管空間阻礙再生牙髓組織進(jìn)一步生長的問題，這種微球支架可作為種子細(xì)胞支架促進(jìn)DPSCs的增殖和分化。Qian等[51]采用復(fù)乳法和溶劑揮發(fā)法制備了二氧化硅/β-磷酸三鈣/聚乳酸-羥基乙酸共聚微球，將這種微球與DPSCs共同培養(yǎng)，實驗結(jié)果證實該微球能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長，且具有良好的生物相容性。微球支架結(jié)構(gòu)和二氧化硅共同促進(jìn)了牙髓干細(xì)胞的遷移分化、血管形成和膠原纖維的形成，有望用于牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的再生工程。王冠華等[52]將DPSCs接種于可注射PLGA微球支架上，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可在微球支架上良好生長，體外培養(yǎng)8周后，微球支架上有基質(zhì)樣物質(zhì)的沉積和部分支架降解，研究結(jié)果表明該微球支架可用于牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生。

3 微球與牙骨質(zhì)再生

目前關(guān)于牙骨質(zhì)再生的研究主要集中在干細(xì)胞、合適的支架和生長因子的結(jié)合，以及不同類型的移植技術(shù)上，用于牙骨質(zhì)再生的干細(xì)胞有牙周膜干細(xì)胞、牙囊細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞等[53]。影響牙骨質(zhì)再生的生物因子有釉基質(zhì)衍生物、轉(zhuǎn)化生長因子β超家族、胰島素樣生長因子、牙骨質(zhì)蛋白1重組蛋白、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等[54-55]。

組織工程支架可以為牙骨質(zhì)再生提供合適的微環(huán)境，目前用于牙骨質(zhì)再生的支架結(jié)構(gòu)的最新進(jìn)展包括多相和三維打印支架和水凝膠[56]。例如Cho等[57]通過3D打印技術(shù)制備了聚己內(nèi)酯支架，并在支架中分別加入包裹結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、BMP-2或BMP-7的PLGA微球。將有牙周膜干細(xì)胞負(fù)載的支架放置在裸露的牙本質(zhì)表面。在成牙骨質(zhì)/成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周后，評價牙骨質(zhì)的形成和整合，研究結(jié)果表明與對照組相比，所有生長因子注射組均出現(xiàn)新形成的牙骨質(zhì)樣層，BMP-2和BMP-7組新生牙骨質(zhì)層的厚度大于所有其他組，而CTGF和BMP-7組牙本質(zhì)表面的整合度優(yōu)于其他組，且BMP-7處理后的新生礦化組織層表達(dá)出牙骨質(zhì)蛋白1。雖然本實驗成功再生了牙骨質(zhì)樣組織，但是新生的牙骨質(zhì)不具備功能特征而且缺乏與周圍組織的整合。牙骨質(zhì)作為平行于根部牙本質(zhì)表面的薄層片狀礦化組織，由于其中有牙周膜Sharpey纖維嵌入，再生過程中需要在不同的硬組織和軟組織界面上進(jìn)行一系列的協(xié)調(diào)反應(yīng)，因此牙骨質(zhì)的成功再生仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的課題。迄今為止，牙骨質(zhì)再生的組織工程研究仍處于初步階段。

4 前景與挑戰(zhàn)

組織工程技術(shù)主要策略是干細(xì)胞種子支架策略，即在體外將干細(xì)胞接種于支架上，然后將其移植到特定組織中。第二種策略稱為細(xì)胞歸巢策略，將負(fù)載信號分子的支架植入靶組織，將內(nèi)源性宿主干細(xì)胞招募到植入部位，誘導(dǎo)其進(jìn)行組織再生。第三種策略是直接將干細(xì)胞注射到損傷部位，啟動組織再生。用于牙體組織再生的微球，可以分別或聯(lián)合應(yīng)用以上策略再生出牙體組織，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中有廣闊的應(yīng)用前景。為了形成與天然牙完全相同的組織結(jié)構(gòu)，還可以將所需形狀的支架設(shè)計與計算機(jī)輔助設(shè)計和計算機(jī)輔助制造技術(shù)、3D打印等先進(jìn)數(shù)字技術(shù)相結(jié)合，這在不久的將來可能成為現(xiàn)實。

但是組織工程中的微球緩釋系統(tǒng)不適用于生物半衰期很短或很長、有效劑量較高或溶解度較低的藥物。對于微球在體內(nèi)以何種降解途徑降解，如何獲得微球可控制的降解速度使之與牙體組織再生速度相匹配，如何消除微球降解產(chǎn)物對局部微環(huán)境的影響等一系列問題仍需要進(jìn)一步繼續(xù)研究。此外，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，微球的制備技術(shù)也會越來越先進(jìn)，相信在不久的將來微球在牙體組織再生領(lǐng)域應(yīng)用會更加廣泛。