拉曼光譜在口腔診療中的研究進展

余 成，高 麗，李春明

疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷仍然是確保患者生存和生活質(zhì)量的最佳方法[1]。目前對口腔疾病早期的臨床評估主要通過術(shù)前X線、CT、MRI、B超及術(shù)者術(shù)中對病灶的觸診等，病變組織活檢仍作為口腔頜面部腫瘤診斷的金標準[2]。但這些常規(guī)方法特異性和敏感性較差，研究表明病理活檢假陰性率高達23%[3]。拉曼光譜技術(shù)具有無創(chuàng)性，能夠提供豐富的定性和定量信息，無需樣本的特殊處理[4-5]，近年來成為口腔醫(yī)學臨床早期診斷的研究熱點，本文就拉曼光譜在口腔醫(yī)學應用的研究進展作一綜述。

1 拉曼光譜的原理

光以一定頻率照射到物質(zhì)上，如果散射光的頻率和入射光一樣，沒有能量交換，這種散射被稱為瑞利散射。然而有一部分入射光光子的能量使處于振動基態(tài)的分子激發(fā)到較高的、不穩(wěn)定的狀態(tài)(虛態(tài))，當分子離開不穩(wěn)定狀態(tài)回到振動基態(tài)，向外釋放的這部分光子振動頻率與入射光不同，稱為拉曼散射。拉曼在1928年發(fā)現(xiàn)了拉曼散射效應[6]，該效應產(chǎn)生的光譜被稱為“拉曼光譜”。拉曼光譜可反映有關生物組織分子組成信息(如脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)和水的含量)[7]，通過分析譜帶的變化可獲取生物大分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，從中分析生物組織病理生理狀態(tài)，因此拉曼光譜又被稱為“分子指紋”[8]。

2 拉曼光譜在疾病診斷中的優(yōu)勢

細胞增殖、分化以及生物因子的分泌都會引起病變組織中相應分子(如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))成分、結(jié)構(gòu)和含量的改變。拉曼光譜可以在樣本發(fā)生形態(tài)學改變之前檢測出相關分子的變化，對口腔疾病早期診斷具有明顯優(yōu)勢[9]。相較于傳統(tǒng)病理學及影像學的繁瑣處理過程，拉曼光譜可以實時、快速、無創(chuàng)地進行診斷，減輕了患者診療過程中的痛苦，節(jié)省時間[10]。某些特殊解剖部位無法進行活檢時也可通過光纖拉曼光譜進行無創(chuàng)診斷檢測[11]。此外，皮下注射針頭內(nèi)光纖拉曼光譜技術(shù)無需特別制作樣本便可對機體深層組織進行檢測[12]，既保留了樣本的完整性，又具有損傷小、穿透度深、光譜分辨率高等優(yōu)點。拉曼光譜譜帶相對較窄，不易重疊，能夠提供更多的樣本信息，有利于分析[13]。目前，拉曼光譜技術(shù)尚處于研究階段，還需要大量的臨床試驗來建立足夠規(guī)模的數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)一疾病篩查診斷的標準，對拉曼光譜診斷的準確性進行分析。

3 拉曼光譜在口腔疾病中的應用

3.1 拉曼光譜在牙周黏膜疾病中的應用

尋常型天皰瘡(pectulus vulgaris，PV)是一種罕見的能威脅生命的自身免疫性疾病，會引起皮膚和口腔黏膜棘層松解及角質(zhì)形成細胞的粘附作用受到破壞[14]。病理學檢測是診斷PV的金標準，但傳統(tǒng)的病理活檢為有創(chuàng)操作，具有一定的手術(shù)風險。Camerlingo等[15]通過對不同階段(天皰瘡病變期、治療期及康復期)的天皰瘡患者口腔黏膜進行拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，天皰瘡病變黏膜光譜在1 250～1 400 cm-1區(qū)域中的光譜值呈下降趨勢，主要與病變組織中磷脂含量下降有關；而蛋白質(zhì)含量的增加，使病變組織光譜在1 500～1 650 cm-1區(qū)域中的光譜值急劇上升且出現(xiàn)多個尖銳譜峰。利用拉曼光譜無需手術(shù)即可診斷PV，減少了患者就診時的痛苦，提高了患者的就診滿意度。

牙周探診附著喪失診斷牙周炎受操作者主觀影響大，需要操作者有豐富的臨床經(jīng)驗。Hernández-Cedillo等[16]利用表面增強拉曼光譜技術(shù)研究牙周炎患者的唾液酸水平，發(fā)現(xiàn)牙周炎患者唾液中糖蛋白和黏蛋白等物質(zhì)含量明顯增加，可用來鑒別診斷牙周炎患者與正常人群，減少了操作者的主觀性誤差，提高了診斷的準確性。

3.2 拉曼光譜在牙體硬組疾病中的應用

Alturki等[17]對齲壞牙齒的牙本質(zhì)組織進行拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，光譜中1 650 cm-1處的峰值代表酰胺Ⅰ；960 cm-1處的峰值代表磷酸鹽。進一步分析酰胺Ⅰ與磷酸鹽的峰值比發(fā)現(xiàn)，該比值在齲齒中較高，檢測還發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)硬度值降低，提示齲壞的牙本質(zhì)脫礦導致其磷酸鹽含量減少。研究表明拉曼光譜可以區(qū)分正常牙體組織與齲壞的牙體組織，具有診斷早期齲齒的潛力[18]。

3.3 拉曼光譜在矯治錯頜畸形中的應用

臨床醫(yī)師施加的正畸力合適與否對患者預后有較大影響。Jung等[19]比較牙齒正畸過程中齦溝液的拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)正畸力不同，齦溝液中礦物質(zhì)與基質(zhì)以及碳酸鹽磷灰石與羥基磷灰石的拉曼譜帶強度比值也不同，可用來評估正畸力的大小是否合適。Camerlingo等[20]研究正畸牙齦溝液的拉曼光譜發(fā)現(xiàn)在1 537 cm-1處有一個強烈的峰，這與齦溝液中降解的胡蘿卜素的增加有關。有文獻表明，與健康人群相比，齦溝液中的類胡蘿卜素濃度會隨著牙周組織炎癥嚴重程度的增加而增加[21]，可用來監(jiān)測矯治過程中牙周組織的狀況。

3.4 拉曼光譜在口腔腫瘤中的應用

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是全球第18大癌癥，2020年報告的新增病例為377 713例，死亡人數(shù)為177 757例，早期診斷與治療對OSCC的預后具有重要意義[22]。拉曼光譜具有實時、快速、無創(chuàng)等優(yōu)勢，越來越多地被應用于OSCC診斷的研究[23]。Matthies等[24]對正常黏膜、非惡性病變黏膜和OSCC黏膜的拉曼光譜進行了研究。發(fā)現(xiàn)正常組織與病變組織在1 448 cm-1、1 656 cm-1和1 750 cm-1處波數(shù)存在統(tǒng)計學差異。Matthies等還對光譜進行了主成分分析(PCA)和線性判別分析(LDA)，結(jié)果顯示正常黏膜與OSCC的鑒別精確度為89.8%。Barroso等[25]對OSCC患者的組織切片進行拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中水含量高于周圍健康組織，在腫瘤邊界到周圍健康組織約4～6 mm的距離中，水含量急劇下降，并伴隨著周圍健康組織中水含量值標準差增加，這些差異可以指導手術(shù)的切除范圍，減少術(shù)后復發(fā)的概率。Xue等[26]用血清表面增強拉曼光譜(SERS)檢測不同分期和組織學分級的OSCC，發(fā)現(xiàn)不同T分期在724 cm-1和748 cm-1處峰強度不同，表明DNA或RNA中堿基的含量不同。不同N分期在724和748 cm-1處峰強度與不同T分期的光譜相似，提示區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清中核酸水平高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者。通過PCA和LDA對不同組織學分級光譜進行分類和診斷，準確率達90%，這對判斷預后及疾病分期具有重要意義。

細針穿刺活檢被認為是腮腺腫瘤的術(shù)前診斷操作之一，但它也存在一些缺陷和局限性，例如發(fā)生血腫和細菌感染[27]。Yan等[27]對Warthin瘤、腮腺多形性腺瘤、黏液表皮樣癌以及腮腺正常組織中收集到的血清進行表面增強拉曼光譜(SERS)研究發(fā)現(xiàn)，正常組織與病變組織血清的光譜峰強度不同，提示腮腺腫瘤患者血清中核酸和蛋白質(zhì)的含量改變。同時，不同腮腺腫瘤的譜峰存在統(tǒng)計學差異。將拉曼光譜與支持向量機結(jié)合對數(shù)據(jù)進行分析，成功鑒別出正常組織和腫瘤的準確度達86%。

3.5 拉曼光譜在口腔頜面部感染的應用

口腔頜面部感染病原菌的確定有賴于細菌培養(yǎng)技術(shù)。Arend等[28]分析中性粒細胞的拉曼光譜圖像發(fā)現(xiàn)，感染細胞中代表核酸、蛋白質(zhì)的光譜信號增加，代表脂質(zhì)的光譜信號減少，區(qū)分感染和未感染細胞的準確率達90%。Khalid等[29]使用拉曼光譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)感染金黃色葡萄球菌的骨組織中，膠原蛋白性質(zhì)、骨骼礦化量、礦物質(zhì)量以及結(jié)晶度都不同于正常骨組織。拉曼光譜技術(shù)無需細菌培養(yǎng)即可鑒別診斷，節(jié)省時間，減少了感染并發(fā)癥的可能。

3.6 拉曼光譜在頜骨骨折中的應用

對于發(fā)生在頜骨的損傷，拉曼光譜能夠進行早期診斷，不僅節(jié)省醫(yī)療成本，也減少并發(fā)癥的發(fā)生，改善患者的預后。Shah[30]利用拉曼光譜評估骨成分，分析不同拉曼光譜峰與譜帶的強度比和面積比，用來評估骨組織的成分。Ahmed等[31]對大鼠顱骨缺損愈合過程中骨成分的拉曼光譜進行研究，發(fā)現(xiàn)相比于正常骨組織，發(fā)生骨折的骨組織拉曼光譜中礦物/基質(zhì)比值降低，碳酸鹽/磷酸鹽比值升高，結(jié)晶度降低，表明拉曼光譜可以鑒別病變與正常骨組織。

4 拉曼光譜在口腔材料學中的應用

拉曼光譜可以對口腔材料進行早期監(jiān)測，有助于預防微滲漏的發(fā)生[32]。Soares等[33]將拉曼光譜和掃描電子顯微鏡結(jié)合研究飲料與漱口水對口腔材料化學性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在飲料和漱口水處理的樣本中，納米填充復合樹脂和玻璃離子體材料的拉曼光譜峰強度均增加，這與材料發(fā)生降解有關。Talungchit等[34]通過拉曼光譜定量分析混合層中粘接劑的濃度，發(fā)現(xiàn)使用乙醇濕粘接和添加氯己定的樣品中粘接劑濃度明顯高于常規(guī)濕粘接的樣品。因此，臨床上聯(lián)合使用乙醇濕粘接和氯己定，可以提高樹脂粘接的耐久性。Fraulob等[35]對種植體周圍新形成骨組織進行研究發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可以在納米級評估局部骨組織中的礦物(羥基磷灰石)和有機物，解決了影像學難以區(qū)分新生骨與骨材料的困擾。

5 總結(jié)與展望

拉曼光譜技術(shù)在口腔診療中的應用，不僅包括了上述對口腔黏膜等軟組織及牙體、頜骨等硬組織疾病的早期診斷與鑒別，還可以在手術(shù)中輔助確定惡性腫瘤的切除范圍、對移植皮瓣術(shù)后的微觀監(jiān)測以及評估化療藥物體內(nèi)局部的濃度等，拉曼光譜技術(shù)在口腔醫(yī)學領域中有較高的應用前景。未來可通過附加的收集纖維器提高收集效率研發(fā)出超高靈敏度光纖探頭以探測更深部組織；傅里葉拉曼光譜技術(shù)可以檢測口腔脫落細胞，有望實現(xiàn)疾病快速篩查；利用顯微拉曼光譜裝載拉曼光譜信號靶向藥實現(xiàn)精準給藥；皮下注射針頭內(nèi)光纖拉曼光譜因其探針小，將其裝載于機器人機械臂上，有望實現(xiàn)拉曼光譜引導下口腔精密手術(shù)。