囊型棘球蚴病的免疫預(yù)防現(xiàn)狀

李文桂 李用國(guó)

包蟲(chóng)病又稱(chēng)棘球蚴病，常分為囊型棘球蚴病(CE)和泡型棘球蚴病(AE)。其中CE是由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Eg)的續(xù)絳期幼蟲(chóng)寄生在人體肝、肺等臟器引起的一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的人畜共患寄生蟲(chóng)病，是國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)規(guī)劃防治的重點(diǎn)寄生蟲(chóng)病之一。本病呈全球性分布，主要流行于牧區(qū)和半牧區(qū)。我國(guó)主要流行或散發(fā)在西北、華北、東北及西南廣大農(nóng)牧區(qū)的23個(gè)省、市和自治區(qū)，以新疆、甘肅、寧夏、青海、西藏、四川西北部和陜西多見(jiàn)。近年普查發(fā)現(xiàn)有100余萬(wàn)包蟲(chóng)病現(xiàn)癥患者，受威脅人口達(dá)數(shù)千萬(wàn)，包蟲(chóng)病畜超過(guò)4 000萬(wàn)頭，每年新發(fā)病畜達(dá)800余萬(wàn)頭，年經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億元。該病已經(jīng)成為西部牧區(qū)群眾因病致貧、因病返貧的主要原因。隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展及人口流動(dòng)的增加，寵物犬和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物狐貍的養(yǎng)殖數(shù)量日益增多，導(dǎo)致包蟲(chóng)病從我國(guó)西北部向東南部、由畜牧地區(qū)向農(nóng)業(yè)地區(qū)蔓延擴(kuò)散。因此，CE的防治已成為目前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

健康教育是預(yù)防CE的根本措施，外科手術(shù)是已發(fā)CE患者的首選治療方法，但對(duì)人體損傷較大，且手術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，可達(dá)7.0%～30.1%；對(duì)于早期小棘球蚴或難于手術(shù)的患者可采用化療藥物或中藥進(jìn)行治療。這些化療藥物包括阿苯噠唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑、噻苯咪唑、丙硫咪唑、硝唑尼特、甲氟喹、三苯氧胺、苯硫氨酯、吡喹酮或奧芬噠唑等。中藥包括白花杜鵑、菖蒲、姜黃、蛇麻子素、阿魏酸、青蒿素、大黃、藏紅花、砂生槐生物堿、石蒜、雄黃、肉桂、石榴皮、麝香草酚、香芹酚、野薔薇提取物、漢防己甲素、擯榔、紫堇、露蜂房、二十五味銅灰散、鐵筷子多糖、聚乙烯吡咯酮-碘、駱駝蓬、消包湯或復(fù)方消包片等。臨床發(fā)現(xiàn)這些藥物存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)，部分患者不能耐受，同時(shí)患者對(duì)某些化療藥物可產(chǎn)生耐藥性。因此，需要研究對(duì)CE更有效的防治措施。

Baron等[1]在1976年發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體可在體外殺傷Eg原頭蚴。Deplazes等[2]在1994年證實(shí)感染Eg的犬淋巴結(jié)細(xì)胞增殖，血免疫球蛋白(Ig)G、IgE和IgA水平均升高。Rigano等[3]在1997年發(fā)現(xiàn)CE患者外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素(IFN)-γ、白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、IL-6和IL-10水平均升高。上述資料均表明宿主在防御Eg的感染過(guò)程中不僅有非特異性反應(yīng)參與，而且有輔助性T細(xì)胞(TH)1、TH2和體液免疫應(yīng)答參與，這為研制Eg疫苗提供了理論依據(jù)。

Eg疫苗研究已有70余年歷史，大體上經(jīng)歷了滅活疫苗、分子疫苗、合成肽、DNA疫苗和載體介導(dǎo)的疫苗這幾個(gè)研究階段。病毒和細(xì)菌的減毒株是常見(jiàn)的疫苗載體，這些載體介導(dǎo)的疫苗具有滅活疫苗和活疫苗的優(yōu)勢(shì)，能主動(dòng)感染宿主細(xì)胞，協(xié)助外源基因有效進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，從而誘導(dǎo)長(zhǎng)期的免疫應(yīng)答。本研究擬概述CE免疫預(yù)防的研制現(xiàn)狀。

一、滅活疫苗

Turner等[4](1936年)、Movsesijan等[5](1968年)、Herd等[6](1975年)和Heath等[7](1979年)用Eg蟲(chóng)卵、六鉤蚴或原頭蚴的分泌物及其勻漿接種綿羊或小鼠后再用Eg蟲(chóng)卵口服攻擊，發(fā)現(xiàn)這些動(dòng)物均可產(chǎn)生不同程度的保護(hù)力，但抗原大批量供應(yīng)限制了其廣泛應(yīng)用。

二、重組抗原疫苗

常見(jiàn)的重組抗原包括Eg95、EgA31、Eg14-3-3、EgM123、EgG1Y162、Egferr、P29、EgHSP20、EgM4、EgM9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶、親肌蛋白和原肌球蛋白等，它們均為已經(jīng)報(bào)道的疫苗分子。

1.Eg95抗原

Eg95抗原的疫苗種類(lèi)包括重組蛋白、合成肽和DNA疫苗等[8]，將它們分別接種于BALB/c鼠、山羊和綿羊均可產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答。Lightowlers等[9]采用Eg天然六鉤蚴抗原(23～25 kDa)的抗血清掃篩Eg六鉤蚴cDNA文庫(kù)得到1個(gè)克隆，命名為Eg95；將其亞克隆至pGEX-3構(gòu)建pGEX-Eg95，轉(zhuǎn)染大腸埃希菌后可表達(dá)為Eg95-GST融合蛋白；將其皮下注射6月齡綿羊，Eg蟲(chóng)卵口服攻擊可產(chǎn)生96%～98%的減蚴率。劉丹等[10]將348 bp的Eg95編碼基因經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)連接為3Eg95串聯(lián)基因，插入pET32α得pET32α-3Eg95，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE顯示重組菌可表達(dá)56 kDa的3Eg95-His融合蛋白。賈紅等[11]將3Eg95-His融合蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，在免疫后2周和4周加強(qiáng)2次，在免疫后6周發(fā)現(xiàn)血清IgG和IFN-γ水平均升高。李玉嬌等[12]采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)Eg95抗原存在7個(gè)T/B細(xì)胞的抗原表位。蘭希等[13]將Eg95-1(1-70aa)、Eg95-2(51-106aa)和Eg95-3(89-153aa)合成肽混合，將混合肽加弗氏佐劑皮下注射綿羊，在初次免疫后2、4和6周重復(fù)3次，初次免疫后10周提示血清IgG水平升高，脾臟細(xì)胞增殖。林仁勇等[14]將Eg95基因插入pCDNA3.1得pCD-Eg95；將100 μg的pCD-Eg95皮下注射BALB/c鼠，在初次免疫后2、4、6和8周重復(fù)4次，初次免疫后2～10周顯示鼠血清IgG和IgG2a水平均升高，初次免疫后10周顯現(xiàn)脾臟細(xì)胞明顯增殖。

2.EgA31抗原

Fu等[15]采用Eg感染的犬血清掃篩Eg六鉤蚴cDNA文庫(kù)得到一個(gè)克隆，命名為EgA31；將50 μg的EgA31-GST融合蛋白皮下注射8月齡犬可誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。李玉嬌等[16]推測(cè)EgA31存在4個(gè)T/B細(xì)胞表位。而趙驍?shù)萚17]推測(cè)EgA31存在4個(gè)T淋巴細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)T細(xì)胞)表位、6個(gè)B細(xì)胞表位和1個(gè)T/B細(xì)胞聯(lián)合表位。張杰等[18]將1 362 bp的EgA31-EgY162融合基因插入pET30α后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE分析顯示可表達(dá)58 kDa的EgA31-EgY162融合蛋白。

3.Eg14-3-3抗原

李宗吉等[19]將10 μg的Eg14-3-3融合蛋白加弗氏佐劑皮下注射ICR鼠，在初次注射后2周和4周加強(qiáng)2次，初次注射后4～10周發(fā)現(xiàn)血清IgG、IgG1和IgG2a水平均升高；脾臟細(xì)胞增殖，分泌高水平IL-2和IFN-γ；此時(shí)腹腔注射1 500個(gè)Eg原頭蚴進(jìn)行攻擊，在攻擊后6個(gè)月表明Eg14-3-3免疫鼠的包囊抑制率可達(dá)84.47%。王強(qiáng)等[20]將10 μg融合蛋白加弗氏佐劑皮下注射ICR鼠，在初次接種后2周和4周加強(qiáng)2次，在初次接種后8周腹腔注射1 500個(gè)Eg原頭蚴進(jìn)行攻擊，在攻擊后6個(gè)月顯示免疫組的脾臟細(xì)胞增殖，脾臟CD4+T細(xì)胞的數(shù)目增加,包囊抑制率可達(dá)85.3%。

4.EgM123抗原

齊文靜等[21]將25 μg的EgM123-CTB蛋白皮下注射BALB/c鼠，在初次免疫后的2周和4周加強(qiáng)2次，初次免疫后的6周顯示血清IgG水平升高，滴度可達(dá)1∶320 000，腸黏液sIgA水平增多；然后將100 μg融合蛋白皮下注射比格犬，在初次注射后的2周和4周加強(qiáng)2次，初次注射后6周顯示血清IgG水平升高，滴度可達(dá)1∶64 000。

5.EgG1Y162抗原

趙商岐等[22]等發(fā)現(xiàn)EgG1Y162蛋白具有3個(gè)T細(xì)胞表位和2個(gè)B細(xì)胞表位。劉曉霞等[23]將50 μg的EgG1Y162蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，在初次免疫后2、4和6周加強(qiáng)3次，初次免疫后10周顯示血清IgG水平升高，滴度可達(dá)1∶25 600，脾臟細(xì)胞增殖，脾臟細(xì)胞的凋亡數(shù)目減少。

Zhang等[24]將50 μg的EgG1Y162-1/2蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，在初次注射后8周達(dá)較高水準(zhǔn)，滴度可達(dá)1∶5 120～1∶20 480；脾臟細(xì)胞增殖，脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)目增加，產(chǎn)生高水平的IFN-γ；脾臟細(xì)胞凋亡發(fā)生率降低；在初次注射后11周腹腔注射1 000～2 000個(gè)Eg原頭蚴進(jìn)行攻擊，在攻擊后19周表明免疫組的Eg包囊數(shù)目和重量降低，囊重抑制率為58.10%～64.10%，血清IgG水平升高，該血清可在體外殺傷Eg原頭蚴。

6.Egferr抗原

對(duì)于大多數(shù)生物而言，鐵是有機(jī)體內(nèi)酶促和生化反應(yīng)所必須的元素之一，它必須與鐵蛋白(Ferr)結(jié)合才能發(fā)揮運(yùn)輸氧和轉(zhuǎn)運(yùn)電子的功能。王婭娜等[25]將50 μg的Egferr-GST融合蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，在初次免疫后2周和4周加強(qiáng)2次，初次免疫后6周顯示血清IgG水平升高，此時(shí)腹腔注射3 000個(gè)Eg原頭蚴進(jìn)行攻擊，在攻擊后6個(gè)月表明免疫組的包囊抑制率可達(dá)86.5%。

三、病毒載體介導(dǎo)疫苗

病毒載體介導(dǎo)的疫苗種類(lèi)包括牛痘病毒疫苗(rMVA-Eg95)、羊口瘡病毒疫苗(rORFV-Eg95)、山羊痘病毒疫苗(rGPV-Eg95)和狂犬病毒疫苗(rRABV-Eg95)[8]，將它們免疫BALB/c鼠和綿羊均可對(duì)抗Eg蟲(chóng)卵或原頭節(jié)的攻擊感染。

高度減毒的牛痘病毒(MVA)對(duì)人體安全無(wú)毒，有多個(gè)非必需區(qū)，可插入外源基因，是一種疫苗載體。Marsland等[26]構(gòu)建了rMVA-Eg95疫苗；Dutton等[27]將108PFU重組病毒滴鼻接種BALB/c鼠和綿羊，在初次滴鼻后4周強(qiáng)化1次，在第1次滴鼻后6周出現(xiàn)血清IgG水平升高；體外實(shí)驗(yàn)顯示該血清可殺傷Eg原頭蚴，小鼠和綿羊血清的殺蚴滴度分別為1∶512和1∶64。

羊口瘡病毒(ORFV)是一種嗜皮膚的病毒，病毒粒子表面包繞多種表面蛋白，其中ORF104和ORF059蛋白的編碼基因存在多個(gè)非必需區(qū)，可插入靶基因，是一種疫苗載體。Tan等[28]將Eg95基因插入p699得到pVU700，將F1L基因插入pVU700得到pVU701，加入羊口瘡病毒的N22株轉(zhuǎn)染LTCs細(xì)胞株，篩選培養(yǎng)后經(jīng)免疫雜交表明Eg95抗體識(shí)別重組病毒表達(dá)33 kDa的Eg95-F1L融合蛋白；將108PFU重組病毒皮下注射綿羊，在初次注射后5周皮下注射重組Eg95蛋白加強(qiáng)1次，在第1次注射后7周顯現(xiàn)血清IgG水平升高，滴度可達(dá)1∶100 000。

山羊痘病毒(GPV)的基因組大小為150 kb，刪除胸腺激酶編碼基因的減毒株是一種理想的疫苗載體。Liu等[29]將Eg95基因插入pLSEG得到pLSEG-Eg95，加入羊痘病毒轉(zhuǎn)染LTCs細(xì)胞株，篩選培養(yǎng)經(jīng)免疫熒光提示重組病毒能夠呈現(xiàn)Eg95蛋白的分子。

狂犬病毒(RABV)的減毒株是一種有效的疫苗載體。許彤等[30-31]構(gòu)建了rRABV-Eg95疫苗；將1×106.5TCID50重組病毒肌肉注射BALB/c鼠，在注射后2周經(jīng)ELISPOT顯示脾臟IFN-γ+T細(xì)胞和IL-4+T細(xì)胞的數(shù)目增加；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示脾臟樹(shù)突狀(DC)細(xì)胞和B細(xì)胞的數(shù)目增多；在注射后4周顯現(xiàn)血清的中和抗體和IgG水平升高；在注射后8周肌肉注射100平均半數(shù)致死量(MLD50)的RABV有毒株進(jìn)行攻擊，在攻擊后3周提示免疫組和對(duì)照組的存活率分別為100%(8/8)和0%(0/8)。

四、細(xì)菌載體介導(dǎo)疫苗

細(xì)菌載體介導(dǎo)疫苗種類(lèi)包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌疫苗(rSt-Eg95/Eg95-Ferr/FABP)、卡介苗疫苗(rBCG-Eg95/EgM123/EgG1Y162)、根癌農(nóng)桿菌疫苗(rAt-Eg95-EgA31)和兩歧雙歧桿菌菌苗疫苗(rBb-Eg95-EgA31)[8]。

鼠傷寒沙門(mén)氏菌(St)是一種胞內(nèi)寄生菌，可有效表達(dá)插入的外源基因。Eg缺乏脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)，必須從宿主體內(nèi)攝取，對(duì)Eg的生存具有重要意義。Chabalgoity等[32]構(gòu)建了rSt-FABP疫苗；將106CFU疫苗尾靜脈注射或109CFU疫苗灌胃接種BALB/c鼠，在初次接種后4～6周發(fā)現(xiàn)灌胃接種組誘導(dǎo)的抗FABP抗體水平高于靜脈注射，血清IgG1、IgG2a和IgA水平均升高；脾臟細(xì)胞增殖，產(chǎn)生高水平的IL-2、IFN-γ和IL-5等。王志升等[33]構(gòu)建了rSt-Eg95-Ferr疫苗，將BALB/c鼠口服1010CFU疫苗，在初次口服后2周強(qiáng)化1次，在初次口服后6周出現(xiàn)血清IgG升高，脾臟細(xì)胞增殖。

卡介苗(BCG)是一種活的減毒結(jié)核菌株，是一種理想的疫苗載體。李文桂等[34-35]構(gòu)建了rBCG-Eg95疫苗；用rBCG疫苗接種BALB/C鼠8周后，再用100個(gè)活的細(xì)粒棘球蚴給每只鼠腹腔接種進(jìn)行感染，在攻擊感染半年后剖殺各組小鼠，發(fā)現(xiàn)各組減蚴率為18.20%～92.46%；在疫苗免疫后8周發(fā)現(xiàn)血清IgG、IgG2a和IgG2b水平均升高，IgG1、IgG3和IgE水平均降低；脾臟細(xì)胞CD4+亞群顯著增加，CD8+亞群輕微升高；脾臟細(xì)胞上清液IFN-γ和TNF-α水平均升高，IL-2無(wú)變化，IL-4水平降低；在疫苗免疫和棘球蚴攻擊后發(fā)現(xiàn)脾臟CD4+T細(xì)胞的凋亡降低，提示該疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一個(gè)Th1型保護(hù)性免疫應(yīng)答。

何黎等[36]以pET28α-EgM123為模板擴(kuò)增594bp的EgM123基因，插入pMV261得pMV261-EgM123，將其電穿孔轉(zhuǎn)化恥垢分支桿菌，篩選培養(yǎng)后經(jīng)免疫印跡表明患者血清識(shí)別30KDa的EgM123蛋白；將106CFU疫苗皮下注射BALB/c鼠，血清IgG在注射后2～8周升高，在8周達(dá)較高水平。

祖力皮也等[37]構(gòu)建了rBCG-EgG1Y162疫苗，李玉嬌等[38-39]將105CFU疫苗皮下或腹腔注射BALB/c鼠，在初次注射后8～10周發(fā)現(xiàn)血清IgE、IgG1、IgG2a和IgG2b水平均升高，此時(shí)腹腔注射1 000個(gè)Eg原頭蚴進(jìn)行攻擊,在攻擊后10～12周顯示免疫組囊重抑制率為78.1%；血清IgG、IgG2a和IgG2b水平均升高,但血清IgG1水平降低；血清Tim-3因子及其配體Galectin-9水平均下降；血清IL-2和IFN-γ水平均升高,但I(xiàn)L-4水平降低；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示外周血淋巴細(xì)胞Tim-3+和CD4+數(shù)目增加,但CD8+細(xì)胞的數(shù)目減少。

苜蓿(Medicago sativa)是一種優(yōu)良的豆科牧草，Deak等[40]和Shahin[41]分別通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將nptⅡ基因?qū)胲俎＃@得了可育抗性植株，這為研制轉(zhuǎn)基因苜蓿提供了可行性。周輝和李文桂[42]構(gòu)建了轉(zhuǎn)Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗；葉艷菊和李文桂[43]發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫及原頭節(jié)攻擊后口服轉(zhuǎn)基因苜蓿接種組小鼠檢獲包囊重量降低，囊重減少率為64.1%，脾臟細(xì)胞凋亡發(fā)生率降低，脾臟T細(xì)胞增殖水平、CD4+T細(xì)胞亞群百分比和CD4+/CD8+比值升高，血清IgG、IgG2b和IgE水平均升高，脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ、1L-12和TNF-α水平均升高，IL-10水平均降低，表明該疫苗口服接種可抑制脾臟細(xì)胞發(fā)生凋亡，誘導(dǎo)脾臟T細(xì)胞增殖，產(chǎn)生Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答以對(duì)抗Eg原頭節(jié)的攻擊感染，CD4+T細(xì)胞亞群、IgG、IgG2b和IgE在疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)力中起重要作用。

雙歧桿菌(Bb)的細(xì)胞壁厚且復(fù)雜，攝取外源DNA較為困難。Rossi等[44]用電穿孔方法進(jìn)行外源DNA轉(zhuǎn)化Bb試驗(yàn)，并摸索出了較好的轉(zhuǎn)化條件。周必英和李文桂等[45-46]構(gòu)建了rBb-Eg95-EgA31疫苗；在疫苗免疫及原頭節(jié)攻擊后發(fā)現(xiàn)皮下注射組、肌肉注射組、鼻腔黏膜接種組和口服免疫組的囊重減少率分別為45.33%、41.33%、70.67%和62.67%；血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgG1水平均升高，IgG3和IgE水平均降低；脾臟IFN-γ、IL-12和TNF-α水平均升高，IL-10水平降低；脾臟淋巴細(xì)胞增殖；脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞增加；脾臟細(xì)胞的凋亡發(fā)生率降低，表明該疫苗免疫可抑制脾臟細(xì)胞發(fā)生凋亡，誘導(dǎo)脾臟T細(xì)胞增殖，產(chǎn)生以Th1型為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

五、小結(jié)

盡管現(xiàn)有Eg疫苗均可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生一定的保護(hù)力，但它們誘導(dǎo)的保護(hù)力尚未達(dá)到人們所期望的水平，同時(shí)這些疫苗還存在下述缺點(diǎn)：由于很難成批供應(yīng)大量Eg蟲(chóng)卵或六鉤蚴，因而用其免疫接種在實(shí)際工作中受到限制；重組蛋白要經(jīng)過(guò)基因克隆、表達(dá)和蛋白純化等復(fù)雜過(guò)程，成本高，同時(shí)只能誘導(dǎo)體液免疫和Th細(xì)胞應(yīng)答，但不能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答(CTL)；盡管合成肽的化學(xué)成分明確，易于大量合成，性質(zhì)穩(wěn)定，但其免疫原性較弱，幾乎不能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答；DNA疫苗操作簡(jiǎn)單，能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫、Th細(xì)胞和CTL應(yīng)答，但DNA可能整合到宿主細(xì)胞的基因組中，有引起原癌基因活化和抑制基因失活的風(fēng)險(xiǎn)；病毒載體的自身蛋白及其雙鏈RNA具有免疫佐劑效應(yīng)，但病毒載體自身具有潛在致癌和致病性，人群普遍具有抗病毒抗體，影響其免疫效果；重組沙門(mén)氏菌苗的表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白存在差異，表達(dá)水平較低；重組BCG疫苗生長(zhǎng)緩慢，營(yíng)養(yǎng)要求高，培養(yǎng)一代需10多個(gè)小時(shí)；轉(zhuǎn)化效率低，外源基因的表達(dá)需特殊載體等；轉(zhuǎn)基因植物疫苗很少被公眾認(rèn)可和接受；重組Bb疫苗長(zhǎng)期低劑量口服有可能產(chǎn)生免疫耐受現(xiàn)象。因此，還需要開(kāi)發(fā)新的疫苗載體，把Eg疫苗的研究推向一個(gè)新的高度。

現(xiàn)有研究表明，單核增多性李斯特菌、枯草芽孢桿菌、乳球菌、牛皰疹病毒Ⅰ型、犬腺病毒2型、火雞皰疹病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病、水皰性口炎病毒、黃熱病毒、新城疫病毒、雞痘病毒、流感病毒、Semliki森林病毒等病原體都是有效的疫苗載體[47-60]，構(gòu)建這些載體介導(dǎo)的Eg疫苗用可能具有極為廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

隨著科技的進(jìn)步，人們將對(duì)Eg的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)等進(jìn)行深入探索，從而闡明Eg蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，篩選新的抗原分子，構(gòu)建多價(jià)高效的復(fù)合基因疫苗或含有基因佐劑的混合基因疫苗或多表位疫苗。Eg的生活史復(fù)雜，不同發(fā)育階段的免疫原性和抗原構(gòu)成有差異，各階段都有保護(hù)性抗原，不同種株的免疫原性不同，篩選具有種間交叉免疫保護(hù)的高度保守性共同抗原，對(duì)不同蟲(chóng)種不同階段的保護(hù)性抗原進(jìn)行鑒定和分離，篩選保護(hù)性強(qiáng)的抗原，將其聯(lián)合制成多價(jià)疫苗。關(guān)注Eg的蟲(chóng)株變異與宿主遺傳的關(guān)系，探索基于類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)的核酸酶(TALEN)或基于CRISPR/cas9的基因編輯技術(shù)用于疫苗研究，探究這些疫苗的免疫原性、轉(zhuǎn)化效率、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性以及能否長(zhǎng)期在宿主體內(nèi)表達(dá)，研究新型佐劑、疫苗載體和制備融合蛋白，提高疫苗的免疫原性，在宿主體內(nèi)準(zhǔn)確評(píng)估新型疫苗分子的保護(hù)性免疫機(jī)制，摸索納米微粒技術(shù)引入新型疫苗是否可延長(zhǎng)免疫應(yīng)答的時(shí)間，誘導(dǎo)記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生等這些問(wèn)題均有助于拓展載體介導(dǎo)的Eg疫苗的應(yīng)用前景。