CaCl2對小麥粉面筋蛋白聚集特性及二級結(jié)構(gòu)的影響

王小花，梁 贏，賈 峰，王 琦，王金水

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

幾千年來，以小麥為基礎(chǔ)的面制食品一直是亞洲國家人們飲食的重要組成部分[1]。在面制品(面條、饅頭和面包)生產(chǎn)加工中，通常用食鹽作為改良劑，不僅能賦予面制品獨(dú)特的風(fēng)味和色澤，還能提高其功能特性[2]，但攝入過量會增加患高血壓和心血管等慢性疾病的風(fēng)險[3-4]。目前，許多學(xué)者探索鈉鹽替代品以解決此問題，作者前期研究在面團(tuán)形成過程中添加NaCl、KCl和低鈉鹽(NaCl和KCl混合鹽)，發(fā)現(xiàn)添加這些鹽顯著提高了面團(tuán)的穩(wěn)定性、形成時間、拉伸面積和最大拉伸阻力[5]。CaCl2在面制品加工過程中提供二價鈣離子，與一價鈉離子和鉀離子的作用機(jī)制不同，其與水相互作用能力弱，不易被水化，能夠破壞已形成的氫鍵[6]。不少學(xué)者在面團(tuán)形成中添加CaCl2，探究其對面團(tuán)流變學(xué)特性的影響。楊鵬程等[7]研究CaCl2對小麥面團(tuán)拉伸特性的影響，發(fā)現(xiàn)添加CaCl2降低了面團(tuán)的最大拉伸阻力和延伸度。Tuhumury等[8]研究不同陽離子Hofmeister系列鹽對小麥粉面團(tuán)混合性能的影響，結(jié)果表明，添加CaCl2的面團(tuán)其吸水率和形成時間顯著降低，與NaCl、KCl相比，CaCl2降低了面團(tuán)的耐攪拌性能。Cao等[9]在面團(tuán)制作過程中添加極低濃度的NaCl和CaCl2，研究其對小麥面團(tuán)動態(tài)流變學(xué)特性的影響，結(jié)果表明，添加CaCl2的面團(tuán)彈性模量高于添加NaCl的面團(tuán)。

目前關(guān)于CaCl2對小麥粉及小麥面團(tuán)聚集特性及結(jié)構(gòu)特性的影響尚不清楚，而面筋蛋白作為小麥蛋白的主要成分，對面團(tuán)行為和最終產(chǎn)品品質(zhì)起著決定性作用。因此，作者研究了不同添加量CaCl2對小麥粉面筋蛋白聚集特性、面團(tuán)質(zhì)構(gòu)及面筋結(jié)構(gòu)特性的影響，以期為鈉鹽替代及改善小麥制品的加工性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中筋粉(粗蛋白含量10.80%、水分含量13.49%、脂肪含量1.28%)：中糧面業(yè)漯河有限公司；CaCl2、NaCl：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Glycine)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素(Urea)：分析純，索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

面筋聚集儀：德國Brabender公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀：上海瑞玢智能科技有限公司；F-7100熒光分光光度計(jì)：日本日立高新技術(shù)公司；傅里葉紅外光譜儀：德國布魯克公司；JHMZ-200和面機(jī)：鄭州中谷機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥粉水分含量的測定

參照GB 5009.3—2016的方法測定小麥粉水分含量。

1.3.2 小麥粉面筋蛋白聚集特性的測定

參考Wang等[10]的方法并稍做修改。分別將CaCl2(0、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%)和NaCl(3.2%)(以面粉干基為基礎(chǔ))加入蒸餾水中，然后將8.5 g面粉分散在9.5 g水中，以水分含量14%為基礎(chǔ)調(diào)整水和面粉質(zhì)量，保持液固比恒定(1.12)。參數(shù)設(shè)置：溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速2 700 r/min，時間300 s。評價指標(biāo)：峰值最大時間(PMT)和峰值扭矩(MT)。

1.3.3 面團(tuán)的制備

參考Liu等[11]使用的方法制備CaCl2添加量為0(C1)、0.2%(G1)、0.4%(G2)、0.8%(G3)、1.6%(G4)、3.2%(G5)，NaCl添加量為3.2%(N1)的面團(tuán)(以面粉干基為基礎(chǔ))。分別將CaCl2或NaCl溶解在蒸餾水中，配制鹽溶液。小麥粉(100.0 g)和鹽溶液(62.5 mL)放入攪拌碗中，每個面團(tuán)攪拌7 min，靜置20 min。

1.3.4 面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的測定

參考Angioloni等[12]使用的方法并稍做修改。將制備好的鮮面團(tuán)置于內(nèi)徑2 cm的圓柱形模具中，平衡5 min后放在質(zhì)構(gòu)儀的載物臺上，進(jìn)行TPA測定。參數(shù)設(shè)置：TPA模式，P-50探頭，測前、測中和測后速率分別為1.0、2.0、2.0 mm/s，下壓距離10.0 mm，時間10 s，觸發(fā)力10.0 g。

1.3.5 面筋蛋白的提取

分別從CaCl2和NaCl制備的面團(tuán)中分離和收集面筋組分，冷凍干燥(24 h)后研磨成粉末，過90目篩，于-20 ℃保存，備用。

1.3.6 面筋蛋白提取率的測定

參考Pietsch等[13]使用的方法并稍做修改。將30 mg凍干樣品溶解于10 mL提取液中，提取液含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Glycine、4 mmol/L Na2EDTA、8 mol/L Urea和0.5% SDS，pH 9.1。所有樣品溶于提取液后，高速振蕩1 min，再室溫振蕩60 min(250 r/min)，最后離心20 min(17 700g)，收集上清液，用熒光分光光度計(jì)測定熒光強(qiáng)度。參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長295 nm；發(fā)射光譜300～450 nm，狹縫寬度5 nm。

1.3.7 面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定

參考Skendi等[14]使用的方法并稍做修改。采用傅里葉紅外光譜溴化鉀壓片法測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，將凍干面筋樣品與KBr按質(zhì)量比1∶ 100混合，研磨后壓制成均勻透明的薄片。參數(shù)設(shè)置：400～4 000 cm-1全波段掃描，掃描信號累加32次，分辨率4 cm-1，信噪比>500。采用Peak Fit v4.12對譜圖進(jìn)行基線校正、高斯去卷積處理、二階導(dǎo)數(shù)擬合，根據(jù)各二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)的區(qū)間范圍得到其含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次以上，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0和Origin 8.5處理數(shù)據(jù)。通過單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多范圍檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2對小麥粉面筋蛋白聚集特性的影響

面筋聚集儀基于剪切能快速評估面筋蛋白的聚集能力，面粉和CaCl2溶液混合，在外力作用下，面筋網(wǎng)絡(luò)快速形成，面筋蛋白聚集曲線急劇升高，進(jìn)一步施加外力，面筋網(wǎng)絡(luò)會被破壞，扭矩曲線下降[15]。添加CaCl2后小麥粉面筋蛋白聚集特性曲線如圖1所示，隨著CaCl2添加量的增加，峰值曲線明顯向左偏移，說明峰值最大時間明顯縮短。Goldstein等[16]報道品質(zhì)差的小麥粉其特點(diǎn)是稠度迅速增加，隨后又迅速降低，面筋蛋白聚集時間較短；強(qiáng)筋面粉其稠度增加的速度相對較慢，達(dá)到峰值稠度需要較多時間。表明添加CaCl2降低了小麥粉面筋品質(zhì)，甚至可能會影響網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。此外，NaCl添加量3.2%的面筋蛋白聚集曲線明顯向右偏移，說明峰值形成時間明顯大于CaCl2添加量3.2%的，原因可能與離子的類型有關(guān)。

注：C1為CaCl2添加量0，G1—G5分別為CaCl2添加量0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%，N1為NaCl添加量 3.2%。圖2—圖4同。表1、表2同。圖1 CaCl2不同添加量的小麥粉面筋蛋白聚集特性曲線Fig.1 Gluten aggregation characteristic curve of wheat flour with different CaCl2 additions

表1 CaCl2不同添加量對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effects of different CaCl2 additions on the textural properties of wheat flour dough

CaCl2不同添加量對小麥粉面筋蛋白聚集特性的影響如圖2所示。峰值最大時間(PMT)是反映麥谷蛋白聚集力學(xué)的指標(biāo)，最大扭矩(MT)是反映小麥粉面筋強(qiáng)度的指標(biāo)[17]。由圖2可知，與空白樣品(C1)相比，CaCl2添加量為0.2%和0.4%時，PMT顯著低于C1，而0.2%和0.4%CaCl2處理的樣品PMT變化無顯著性差異；隨著CaCl2添加量的進(jìn)一步增加(0.8%～3.2%)，PMT顯著降低，說明添加CaCl2能加速面筋的形成，從而縮短面筋聚集時間。這種加快效應(yīng)可能是由于鈣離子屬于“結(jié)構(gòu)破壞型離子”，鈣離子的引入導(dǎo)致水結(jié)構(gòu)的無序，使水分子更快地滲透到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，從而使得蛋白質(zhì)更快地展開[18]；也有可能是蛋白質(zhì)間通過Ca2+形成鹽橋促進(jìn)蛋白質(zhì)快速聚集[9]。Melnyk等[19]研究發(fā)現(xiàn)，面筋蛋白聚集時間的變化規(guī)律遵循Hofmeister系列，其中Ca2+減少面筋蛋白聚集時間，這與本研究的結(jié)果一致。與N1相比，CaCl2添加量3.2%的樣品峰值最大時間明顯縮短。此外，與C1相比，添加CaCl2的樣品MT增加，且隨著CaCl2添加量增加，MT顯著增加。峰值扭矩可能與有效參與蛋白的聚集量有關(guān)，且有助于在面筋展開完成后形成充分的面筋結(jié)構(gòu)[19]；峰值扭矩也可能是由各種相互作用的疊加決定的，而鹽橋在其中只占很小的比例[9]。因此，CaCl2添加量如何影響面筋蛋白的峰值扭矩還需要進(jìn)一步的研究認(rèn)證。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3同。圖2 CaCl2不同添加量對小麥粉面筋蛋白聚集特性的影響Fig.2 Effects of different CaCl2 additions on gluten aggregation characteristics of wheat flour

2.2 CaCl2對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的影響

CaCl2不同添加量對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的影響見表1，與C1相比，添加CaCl2降低了面團(tuán)的硬度、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性和回復(fù)性，表明CaCl2可能阻礙面團(tuán)內(nèi)部面筋網(wǎng)絡(luò)的形成，進(jìn)而導(dǎo)致面團(tuán)品質(zhì)的下降。其中面團(tuán)的硬度、彈性和咀嚼性隨CaCl2添加量的增加而顯著降低，回復(fù)性隨CaCl2添加量的增加變化不顯著，這與楊鵬程[20]的研究結(jié)果一致。面團(tuán)的黏附性隨CaCl2添加量的增加先顯著增加再降低之后趨于平緩。另外，面團(tuán)的彈性和內(nèi)聚性跟面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)點(diǎn)多少呈高度正相關(guān)[20]。本研究中面團(tuán)的彈性和內(nèi)聚性降低，表明添加CaCl2使面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)點(diǎn)減少，進(jìn)而減弱蛋白質(zhì)分子間的相互作用，從而進(jìn)一步證實(shí)前面所述的面團(tuán)品質(zhì)變差的結(jié)果。添加3.2% CaCl2的面團(tuán)與添加3.2% NaCl的面團(tuán)相比，其硬度、彈性、黏附性和咀嚼性有顯著性差異，內(nèi)聚性和回復(fù)性變化不大。

2.3 CaCl2對面團(tuán)面筋蛋白提取率的影響

面筋蛋白在含變性溶劑中的可提取性是測定小麥面筋蛋白亞基間聚合反應(yīng)的常用方法，提取溶劑的熒光強(qiáng)度反映小麥面筋蛋白聚合的程度，即提取溶劑的熒光強(qiáng)度越大，小麥面筋蛋白的可提取率越高，小麥面筋蛋白聚合程度越小[21]。由圖3可知，CaCl2在低添加量(0.2%和0.4%)時，面筋蛋白的熒光強(qiáng)度降低，表明面筋蛋白的可提取率降低，面筋蛋白發(fā)生了一定程度的聚合，這與楊鵬程[20]的研究結(jié)果一致。原因可能與靜電自由能的變化有關(guān)，也可能是由Ca2+交聯(lián)了帶負(fù)電荷的羧基(—COOH)導(dǎo)致。隨著CaCl2添加量的進(jìn)一步增加(0.8%～3.2%)，面筋蛋白的熒光強(qiáng)度變化不顯著，原因可能是CaCl2添加量較高時，會出現(xiàn)鹽析效應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性基團(tuán)完全暴露至疏水基團(tuán)達(dá)到極點(diǎn)，因此面筋蛋白的提取率沒有顯著變化[18]。另外，CaCl2添加量3.2%的面筋蛋白提取率高于NaCl添加量 3.2%的，表明添加NaCl的樣品其聚集程度大于添加CaCl2的樣品。

圖3 CaCl2不同添加量對面團(tuán)面筋蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of CaCl2 on the extractability of gluten isolated from wheat dough

圖4 面筋蛋白的傅里葉紅外光譜特征曲線Fig.4 Characteristic curve of gluten Fourier infrared spectra

2.4 CaCl2對面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

圖4為面筋蛋白的傅里葉紅外光譜圖。酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化較敏感，吸收強(qiáng)度較大[22]，其中酰胺Ⅰ帶在1 614～1 640 cm-1和1 670～1 690 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)的特征吸收，1 640～1 650 cm-1為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的特征吸收，1 650～1 660 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收，1 660～1 670 cm-1和1 690～1 700 cm-1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的特征吸收[23]。由圖4可知，CaCl2不同添加量的面筋蛋白其FTIR譜圖的出峰位置和走勢基本一致，說明添加CaCl2不能改變面筋蛋白的特定基團(tuán)，而是改變面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的含量，與楊鵬程[20]的研究結(jié)果一致。

表2為CaCl2對面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)酰胺Ⅰ帶的擬合結(jié)果，β-折疊是面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)，與桂俊等[24]研究結(jié)果一致。由表2可知，與空白樣品相比，不同添加量的CaCl2顯著降低面筋蛋白的β-折疊含量，提高無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量，α-螺旋含量無顯著性變化。表明添加CaCl2的面筋蛋白其構(gòu)象變化主要取決于β-折疊、無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量，進(jìn)而影響面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Choi等[25]研究表明，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)是比較有序的結(jié)構(gòu)，具有較高的穩(wěn)定性；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲是無序結(jié)構(gòu)。本研究中添加CaCl2導(dǎo)致面筋蛋白的無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量增加，而β-折疊含量降低，使面筋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定。面筋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性變差，可能是面團(tuán)硬度、內(nèi)聚性和彈性降低的主因。另外，NaCl添加量3.2%的樣品二級結(jié)構(gòu)含量的變化與添加CaCl2的面團(tuán)有顯著性差異，主要體現(xiàn)在β-折疊含量增加、β-轉(zhuǎn)角含量降低、無規(guī)則卷曲和α-螺旋含量無顯著性變化(與空白相比)。CaCl2和NaCl對蛋白二級結(jié)構(gòu)差異的原因可能是由于添加CaCl2引入二價陽離子破壞了氫鍵的形成，從而使得面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)變得無序，最終可能導(dǎo)致面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)性能發(fā)生改變。

表2 CaCl2不同添加量對面團(tuán)面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of CaCl2 on secondary structure of gluten in dough

3 結(jié)論

小麥粉面筋蛋白聚集特性的結(jié)果表明，隨著CaCl2添加量的增加，PMT顯著降低，說明CaCl2加快面筋的形成，縮短面筋聚集時間；面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的結(jié)果表明，添加CaCl2降低面團(tuán)的硬度、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性和回復(fù)性，且硬度、彈性和咀嚼性隨CaCl2添加量的增加而顯著降低，回復(fù)性隨CaCl2添加量的增加變化不顯著，黏附性隨CaCl2添加量的增加先顯著增加再降低之后趨于平緩，說明CaCl2可能阻礙面團(tuán)內(nèi)部面筋網(wǎng)絡(luò)的形成，進(jìn)而使面團(tuán)品質(zhì)特性變差；面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果表明，添加CaCl2增加無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量，降低β-折疊含量，α-螺旋含量無顯著性變化，說明面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)變得無序，面筋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性變差。以往的研究大多只簡單地研究CaCl2對面團(tuán)流變學(xué)特性的影響，而對CaCl2在面團(tuán)加工中的研究較少，本研究利用面筋聚集儀分析面筋蛋白的聚集特性，并從面筋結(jié)構(gòu)變化的角度探討CaCl2對面筋蛋白聚集特性的影響。研究結(jié)果表明CaCl2影響了面團(tuán)面筋的品質(zhì)，為面制品加工業(yè)及減鈉策略提供理論基礎(chǔ)。