中老年高同型半胱氨酸血癥基因多態(tài)性與葉酸治療效果的關(guān)聯(lián)性研究

李 麗，李 浩，陳雪梅 ，吉 林，鄭修銀

(四川省宜賓市第一人民醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科，b.健康管理中心，c.心內(nèi)科，四川 宜賓 644000)

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物，血液中Hcy水平與心腦血管疾病、慢性腎病、糖尿病、阿爾茲海默癥甚至復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等多種疾病密切相關(guān)[1]，高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, HHcy)已成為高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有研究認(rèn)為，Hcy水平每上升5 μmol/L，卒中發(fā)生概率會(huì)升高59%[2]。HHcy與基因多態(tài)性有一定相關(guān)性，其中5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)和甲硫氨酸合成還原酶 (methionine synthase reductase, MTRR) 是Hcy代謝過程中的關(guān)鍵酶，其基因多態(tài)性與HHcy密切相關(guān)[3]。補(bǔ)充葉酸能有效降低Hcy，對(duì)預(yù)防心腦血管疾病有一定作用，但研究發(fā)現(xiàn)并非所有HHcy患者經(jīng)過足夠劑量和長(zhǎng)期補(bǔ)充葉酸都能將Hcy降至正常水平[4]，這可能是個(gè)體的相關(guān)基因多態(tài)性決定了對(duì)葉酸補(bǔ)充的敏感性不同有關(guān)[5]。HHcy是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，基因多態(tài)性也與地域、民族等因素有關(guān)[6]，本文通過觀察中老年HHcy患者的相關(guān)基因多態(tài)性分布特征及其葉酸治療效果，探討HHcy葉酸治療失敗分子層面的原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料2020年1～12月于宜賓市第一人民醫(yī)院健康管理中心確診為HHcy的患者400例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①Hcy≥15 μmol/L[7]；②年齡50～75歲；③本地區(qū)居住時(shí)間≥5年；④自愿參與本研究且同意規(guī)律葉酸補(bǔ)充90 d以上者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1月內(nèi)有補(bǔ)充葉酸或B族維生素者；②有心腦血管疾病史；③合并嚴(yán)重感染、肝腎功能不全、惡性腫瘤及自身免疫性疾病。剔除葉酸補(bǔ)充期間依從性差的患者，最終納入334例，其中男181例，女153例，249例來自城市，85例來自農(nóng)村；年齡(56.6±5.9)歲，<60歲者174例，60～70歲101例，70歲以上59例；漢族304例，少數(shù)民族30例；體質(zhì)指數(shù)(BMI)<24 kg/m2261例，≥24 kg/m273例；已婚273例，其他61例；108例有吸煙史，122例有飲酒史，共有吸煙飲酒史者89例。研究經(jīng)宜賓市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1血漿Hcy檢測(cè) 抽取清晨空腹血約5 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝試管中，4000 r/min離心10分鐘分離血漿立即檢測(cè)或存于4 ℃冰箱冷藏待檢，血漿Hcy濃度檢測(cè)采用熒光定量法，檢測(cè)儀器為山東博邁達(dá)生產(chǎn)的同型半胱氨酸POCT檢測(cè)儀，試劑盒也由山東博邁達(dá)提供。

1.2.2MTHFR及MTRR基因多態(tài)性檢測(cè) 樣本收集后送到金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)成都公司進(jìn)行檢測(cè)，生化檢測(cè)剩余血液提取DNA，采用PCR熒光探針法檢測(cè)外周血基因組DNA中MTHFR基因C677T(rs1801133)多態(tài)性位點(diǎn)，試劑盒由武漢明德生物科技股份有限公司提供。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè) MTHFR基因A1298C(rs1801131)和MTRR基因A66G (rs1801394)多態(tài)性位點(diǎn)，每個(gè)樣品反應(yīng)體系為10 μl，內(nèi)含 3.86 μl純水、DNA模板(濃度5 ng/μl)1 μl，2×KASP Master Mix 5 μl，KASP引物Mix 0.14 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性15 min，擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)(94 ℃變性20 s，61℃退火1 min，每個(gè)循環(huán)溫度下降0.6 ℃)，接著再進(jìn)行26個(gè)循環(huán)擴(kuò)增(94 ℃變性20 s，55 ℃退火1 min)，反應(yīng)結(jié)束后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(ABI 7500 fast)讀取樣品孔的終點(diǎn)熒光，然后利用分析軟件判定基因位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)分型。

1.2.3葉酸補(bǔ)充及結(jié)果判定 所有研究對(duì)象均在體檢后遵醫(yī)囑外另補(bǔ)充葉酸5 mg/d[8]，補(bǔ)充周期90 d，院外期間每2周電話隨訪一次，叮囑患者規(guī)律用藥，90 d后調(diào)查患者依從性，將依從性差(每周漏服藥物2次及以上)或未復(fù)查血漿Hcy者剔除出本研究，干預(yù)周期結(jié)束后復(fù)查血漿Hcy水平，根據(jù)Hcy水平(Hcy≥15 μmol/L或<15 μmol/L)將療效分為無(wú)效組和有效組[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。遺傳平衡分析采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，基因各位點(diǎn)分型及等位基因頻率用頻數(shù)或率描述，其組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同一般情況HHcy患者各基因SNP分布特點(diǎn)MTHFR基因C677T位點(diǎn)CC型、CT型和TT型占比分別為20.1%、33.2%和46.7%，A1298C位點(diǎn)AA型、AC型和CC型占比分別為58.1%、25.7%和16.2%，MTRR基因A66G位點(diǎn)AA型、AG型和GG型占比分別為55.4%、31.1%和13.5%，將不同一般情況HHcy患者的各基因SNP分布進(jìn)行比較，不同居住地、民族及吸煙飲酒史的rs 1801131基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同居住地、BMI及吸煙飲酒史的rs1801394 基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 不同一般情況HHcy患者M(jìn)THFR及MTRR各等位基因頻率比較MTHFR基因rs1801133的C、T等位基因占比分別為36.7%和63.3%，rs1801131的A、C等位基因占比分別為71.0%和29.0%，MTRR基因rs1801394的A、G等位基因占比分別為71.0%和29.0%。將不同一般情況HHcy患者各等位基因分布占比進(jìn)行比較，rs1801131 C等位基因不同居住地和吸煙飲酒史差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，rs1801394 G等位基因不同居住地和民族分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 不同葉酸治療效果患者各基因SNP分型分布比較葉酸治療3個(gè)月后，有效組271例，無(wú)效組63例，兩組患者M(jìn)THFR基因rs1801133和rs1801131的SNP分型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，無(wú)效組MTHFR基因T677T型及C1298C基因型構(gòu)成比高于有效組(P<0.05)，而MTRR基因 rs1801394基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 不同葉酸治療效果患者各基因等位基因分布比較葉酸治療3個(gè)月后，治療后無(wú)效組rs1801133 T等位基因、rs1801131 C等位基因及MTRR基因G等位基因頻率高于有效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表1 不同一般情況HHcy患者M(jìn)THFR基因C677T、A1298C及MTRR基因A66G分布情況 [n(%)]

表2 不同一般情況HHcy患者M(jìn)THFR基因及MTRR基因各等位基因分布比較 [n(%)]

表3 不同葉酸治療效果兩組患者的基因SNP分型分布比較 (n)

表4 不同葉酸治療效果兩組患者的等位基因分布比較(n)

3 討論

高同型半胱氨酸血癥是心腦血管病的重要誘因，相關(guān)代謝酶關(guān)鍵基因的多態(tài)性可能導(dǎo)致HHcy，其中MTHFR和MTRR基因多個(gè)位點(diǎn)突變可能誘發(fā)HHcy，研究表明：MTHFR基因C677T及A1298C單核苷酸多態(tài)性影響Hcy相關(guān)代謝酶活性，從而增加心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[10]。MTHFR位于細(xì)胞質(zhì)中，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，C677T 和A1298C分別位于α螺旋結(jié)構(gòu)與β折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角處和α螺旋結(jié)構(gòu)中，不同基因型對(duì)MTHFR結(jié)構(gòu)有一定影響[11]，進(jìn)而影響MTHFR酶活性。研究表明，MTHFR基因C677T 基因型為TT時(shí)，其酶活性僅為CC型時(shí)的一半[12]，A1298C位點(diǎn)CC型時(shí)酶活性僅為AA型的63.0%左右[13]。MTHFR和MTRR的基因型分布有一定人種、民族和地域分布差異[14,15]，但不論哪種人群，其C677T位點(diǎn)為TT型時(shí)，其高同型半胱氨酸血癥、代謝綜合征、心血管疾病發(fā)病率均顯著升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同居住地、民族和吸煙飲酒史的rs 1801131基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同居住地、BMI及吸煙飲酒史的rs1801394 基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同民族存在基因型分布差異。渠巍等對(duì)貴州省漢族和布依族人群MTHFR基因和MTRR基因多態(tài)性分析，認(rèn)為兩個(gè)基因位點(diǎn)存在民族和地域差異[17]。喻艷琴等也分析了貴州苗族、布依族和漢族人群MTHFR基因rs1801133多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)也存在不同民族間的差異，并認(rèn)為其與原發(fā)性高血壓有相關(guān)性，T677T是原發(fā)性高血壓的危險(xiǎn)因素[18]。有研究指出，飲酒會(huì)影響水溶性維生素吸收，加之尿液排出增加，直接導(dǎo)致葉酸缺乏[19]，吸煙者也可能因飲食結(jié)構(gòu)改變，水果蔬菜攝入量減少，從而減少葉酸的攝入量，導(dǎo)致HHcy的發(fā)生。

葉酸是一種水溶性維生素，通過參與Hcy的再甲基化途徑起到降低Hcy的作用，從而降低患者心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[20]。有研究表明，高同型半胱氨酸血癥患者容易發(fā)生葉酸缺乏，其原因與相關(guān)基因多態(tài)性密不可分[21]。補(bǔ)充葉酸對(duì)HHcy患者的效果可能受較多因素影響：①同型半胱氨酸代謝需要其他B族維生素(B6、B12)的參與，單獨(dú)補(bǔ)充葉酸是否能達(dá)到臨床治療效果尚證據(jù)不足[22]；②MTHFR和MTRR基因多態(tài)性影響同型半胱氨酸代謝，可能導(dǎo)致葉酸治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)[23]；③對(duì)HHcy者建議的葉酸補(bǔ)充量目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，臨床上葉酸使用劑量從0.4～45 mg，大部分研究認(rèn)為5 mg左右能達(dá)到比較好的療效[24]。2016年《H型高血壓診斷與治療專家共識(shí)》指出，MTHFR T677T基因型是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，建議H型高血壓患者應(yīng)進(jìn)行MTHFR C677T基因型檢測(cè)，判斷H型高血壓危險(xiǎn)分層，精準(zhǔn)治療和預(yù)防并發(fā)癥[25]。本研究發(fā)現(xiàn)：MTHFR基因T677T型和C1298C型或者M(jìn)THFR 677 T等位基因和1298 C等位基因是5 mg葉酸治療HHcy失敗的重要影響因素，但同一患者同時(shí)存在多種HHcy高?；蛐蜁?huì)不會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的高同型半胱氨酸血癥或?qū)θ~酸治療更不敏感尚不得而知。MTHFR C677T 位點(diǎn)多態(tài)性可能通過改變蛋白質(zhì)局部空間結(jié)構(gòu)，降低MTHFR與其配體的結(jié)合能力，影響酶的催化活性，從而導(dǎo)致HHcy和心腦血管疾病的發(fā)生[26]。有研究顯示，當(dāng)高血壓病史、冠心病病史和MTHFR T677T等3種因素同時(shí)存在時(shí)，葉酸治療HHcy失敗的風(fēng)險(xiǎn)是非此組合人群的8.84倍[23]。

綜上，高同型半胱氨酸血癥患者rs1801133的TT型、rs1801131的CC型及rs1801394的GG基因型構(gòu)成有一定居住地、民族、BMI和吸煙飲酒史差異，rs1801133 T等位基因、rs1801131的C等位基因及rs1801394的G等位基因構(gòu)成比也有類似分布趨勢(shì)，5 mg葉酸治療效果與rs1801133和rs1801131的基因型有關(guān)，MTHFR的T677T和C1298C基因型患者葉酸治療效果差。