基于雙向電泳與質(zhì)譜聯(lián)用的牛羊乳蛋白質(zhì)組比較

宋宏新，劉曉鳳，程妮，薛海燕

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；2.深圳普門(mén)科技股份有限公司，深圳 518108）

0 引言

牛乳和羊乳是世界產(chǎn)量最大的兩類(lèi)乳源[1]，對(duì)其成分與功能的研究歷來(lái)沒(méi)有間斷，兩者的差異造成了消費(fèi)者選擇上的困擾。蛋白質(zhì)是乳中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，其含量大、種類(lèi)多，是牛羊乳區(qū)別檢測(cè)的主要目標(biāo)物質(zhì)[2]。羊乳還包括綿羊乳與山羊乳兩大類(lèi)，兩者蛋白質(zhì)組成亦存在差異，國(guó)內(nèi)羊乳以山羊乳為主，因此本文以山羊乳（文中羊乳皆指山羊乳）為研究對(duì)象，與牛乳的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較研究。

利用蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）方法可對(duì)組織或系統(tǒng)的全部蛋白的表達(dá)模式與功能模式進(jìn)行研究[3]，等電聚焦(IEF)和SDS-PAGE結(jié)合的雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)[4-5]是最常用的蛋白組分析技術(shù)，該技術(shù)廣泛應(yīng)用到了生物學(xué)及食品等研究領(lǐng)域[6-9]。已有報(bào)道利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定乳中蛋白種類(lèi)、蛋白含量并對(duì)蛋白質(zhì)功能進(jìn)行分析等[10]。Lee[11]等使用2-DE圖譜結(jié)合MALDITOF MS技術(shù)對(duì)牛初乳進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，鑒定出了白蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白前體、胰蛋白酶抑制劑等已知的蛋白，此外還鑒定了許多未知的乳清蛋白。Yang[12]等使用2-DE技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜法來(lái)檢測(cè)牛乳中植物蛋白摻假，根據(jù)摻假牛乳凝膠上特有的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)可知，在摻雜大豆蛋白的牛乳中檢測(cè)到β-大豆球蛋白和大豆球蛋白，而在摻雜豌豆蛋白的牛乳中檢測(cè)到豌豆球蛋白，在摻雜小麥蛋白的牛乳中檢測(cè)到β淀粉酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑。陳靜廷[13]等利用2-DE技術(shù)分析pH 4.6與pH 4.8沉淀酪蛋白后的牛乳清樣品，結(jié)果顯示pH 4.6時(shí)提取的乳清樣品2-DE圖譜中存在124個(gè)蛋白點(diǎn)，pH 4.8時(shí)有127個(gè)蛋白點(diǎn)，結(jié)合圖譜清晰度及蛋白點(diǎn)分離效果可得pH 4.6酪蛋白沉淀提取法更適用于牛乳清樣品的制備。雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)組結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)可以較好的分離蛋白并對(duì)其種類(lèi)進(jìn)行鑒定，本研究便基于該技術(shù)對(duì)鮮牛羊乳中的蛋白質(zhì)組進(jìn)行全面系統(tǒng)的比較，并探討牛羊乳的潛在生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

鮮牛乳與鮮羊乳分別由陜西西安草灘奶牛場(chǎng)與金牛乳業(yè)有限公司提供，乳樣采集后密封，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽CHAPs，昂飛公司；碘乙酰胺IAA、硫脲，美國(guó)Amersham公司；PMSF（蛋白酶抑制劑）、DTT（二硫蘇糖醇），美國(guó)Amresco公司；固相pH梯度干膠條(pH4～7,24 cm)、IPG緩沖液(pH4～7)，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；胰酶，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；HCCA(基質(zhì))，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、牛血清標(biāo)準(zhǔn)品BSA，美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

GE Ettan IPGphor 3等 電 聚 焦 儀、GE Ettan DALTsix雙向電泳系統(tǒng)，美國(guó)通用電氣公司；UMAX Powerlook1100掃描儀，力廣科技股份有限公司；Ultraflex III TOF/TOF質(zhì)譜儀，美國(guó)Bruker Daltonic公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

新鮮牛羊乳于4℃，5 000 r/min離心30 min，棄去上層脂肪，得脫脂牛羊乳[14]，取部分脫脂牛羊乳用1 mol/L HCl調(diào)pH至酪蛋白等電點(diǎn)(牛乳pH4.6，羊乳pH4.1)，靜置30 min后4℃，5 000 r/min，離心30 min取上清即為牛羊乳清。對(duì)脫脂牛羊乳和乳清進(jìn)行冷凍干燥，并保存于-80℃下備用。

1.2.2 雙向電泳分析

第一向等電聚焦(IEF)，分別取脫脂牛羊乳及牛羊乳清凍干粉20 mg，各加入200μL再水化液RB(7 mol/L尿素、4%CHAPs、2 mol/L硫脲，雙蒸水溶解)充分混合溶解，在4℃下12 000 r/min離心20 min取上清液（即為樣品液），用考馬斯亮藍(lán)染色法定量測(cè)定。IEF采用固相pH梯度干膠條，根據(jù)蛋白質(zhì)定量結(jié)果取樣，硝酸銀染色的分析膠上樣量為40μg，而考馬斯亮藍(lán)染色的質(zhì)譜膠上樣量為500μg。上樣液的成分為：樣品液、1%IPG緩沖液、1%DTT、1×溴酚藍(lán)緩沖液、RB至460μL[15]。室溫20℃泡脹過(guò)夜（10～12 h），使膠條完全吸收上樣液。等電聚焦程序[16]為：300V 0∶30Hr，500V 1∶00Hr，1 000V 1∶00Hr，8 000V 3∶00Hr，8 000V 5∶20Hr，聚焦電壓：58kVh。

第二向SDS-PAGE，膠條復(fù)溫并進(jìn)行平衡，先用100 mmol/L DTT的SDS平衡液平衡15 min，再用250 mmol/L IAA的SDS平衡液避光平衡15 min。SDS-PAGE凝膠濃度為12.5%，上樣與電泳方法參照Qin[17]等的方法。電泳結(jié)束后對(duì)凝膠分別進(jìn)行銀染或者考染，掃描銀染膠，圖像用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件分析。

1.2.3 質(zhì)譜前處理、質(zhì)譜分析鑒定及生物信息學(xué)分析

在質(zhì)譜（考染）膠上挖出需鑒定的點(diǎn)，對(duì)膠粒進(jìn)行洗滌、脫色、脫水、干燥、胰酶（1μg/μL）酶切[2]，將提取的肽段用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件為：UV波長(zhǎng)355 nm；重復(fù)速率200 Hz；加速電壓20 000 V；最優(yōu)質(zhì)量分辨率1 500 u；掃描質(zhì)量范圍700～3 200 u；采用儀器默認(rèn)模式獲得質(zhì)譜圖，胰酶自切峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀，基線峰過(guò)濾、信號(hào)峰識(shí)別用flexAnalysis（Bruker Dalton）軟件進(jìn)行。搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行匹配鑒定，搜索UniPort蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/），將鑒定成功的蛋白質(zhì)信息轉(zhuǎn)換為基因名稱(chēng)，然后利用mas3.0分子功能注釋系統(tǒng)（http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/）進(jìn)行GO注釋并分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫脂牛羊乳2-DE圖譜分析

2.1.1 2-DE圖譜分析

脫脂牛羊乳2-DE圖譜如圖1所示，主要酪蛋白集中在25～40 ku，主要乳清蛋白分布在15 ku處，此外還有許多低豐度蛋白點(diǎn)。將牛羊乳中所有蛋白點(diǎn)置于一張坐標(biāo)圖上進(jìn)行比較，如圖2所示，由圖可知牛羊乳蛋白整體分布差異不明顯，在羊乳中共發(fā)現(xiàn)659個(gè)蛋白點(diǎn)，牛乳中592個(gè)，其中酪蛋白與清蛋白的點(diǎn)數(shù)之和占脫脂乳總蛋白的60%左右，蛋白含量占70%以上。牛羊乳蛋白的分子量均處于0～160 ku，其等電點(diǎn)分布于4～7。Minh[18]等曾采取pH 3～10的IPG膠條對(duì)牛羊乳進(jìn)行分析顯示大多蛋白仍分布于pH 4～7之間，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

圖2 脫脂牛羊乳蛋白點(diǎn)分布

在銀染膠的酪蛋白區(qū)域選擇清晰且牛羊乳中差異較大的蛋白點(diǎn)（見(jiàn)圖1，圖中選取的牛乳酪蛋白斑點(diǎn)標(biāo)注為b1～b10；羊乳酪蛋白斑點(diǎn)標(biāo)注為g1～g11），并在考染膠上對(duì)應(yīng)位點(diǎn)挖出對(duì)應(yīng)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

圖1 脫脂牛羊乳2-DE圖譜

2.1.2 脫脂牛羊乳蛋白分布特點(diǎn)

對(duì)脫脂牛羊乳2-DE圖譜中所有蛋白點(diǎn)分布進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3與圖4所示。圖3中分子量處于0～20 ku時(shí)牛乳的蛋白點(diǎn)數(shù)與含量均低于羊乳，乳清蛋白主要分布于此區(qū)域。分子量為20～40 ku時(shí)牛乳中蛋白點(diǎn)數(shù)及含量略高于羊乳，且酪蛋白多分布于此區(qū)域。在40～160 ku分子量區(qū)域內(nèi)存在多種低豐度蛋白，且牛乳蛋白點(diǎn)數(shù)略低于羊乳而蛋白含量高于羊乳。結(jié)合圖4可知，當(dāng)?shù)入婞c(diǎn)為0～5時(shí)牛乳蛋白點(diǎn)數(shù)及含量均高于羊乳；而等電點(diǎn)為5～7時(shí)牛乳蛋白點(diǎn)數(shù)及含量低于羊乳，因此，從整體來(lái)看牛乳蛋白等電點(diǎn)低于羊乳。劉鳴暢[19]等人采用雙向電泳技術(shù)對(duì)牛羊乳蛋白進(jìn)行分析，表明牛羊乳中αs1-CN與β-CN的等電點(diǎn)基本相同，但牛乳αs2-CN的等電點(diǎn)小于羊乳；在乳清蛋白中牛乳β-LG的等電點(diǎn)也小于羊乳，且兩者α-乳白蛋白的等電點(diǎn)基本相同，與本研究的結(jié)果類(lèi)似。

圖3 脫脂牛羊乳蛋白分子量分布

圖4 脫脂牛羊乳蛋白等電點(diǎn)分布

2.1.3 牛羊乳主要酪蛋白圖譜比較

對(duì)占乳蛋白質(zhì)80%以上的酪蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定比較研究。乳酪蛋白主要有αs1-CN（區(qū)域A）、αs2-CN（區(qū)域B）、β-CN（區(qū)域C）、κ-CN（區(qū)域D）4類(lèi)（比較如表1，在雙向電泳中的位置見(jiàn)圖1中的標(biāo)注），其在2-DE圖譜中電泳行為存在一定差別。由表1可知，區(qū)域A處牛羊乳αs1-CN的等電點(diǎn)相同，而牛乳中分子量稍大于其在羊乳中的分子量，且蛋白點(diǎn)相對(duì)含量差別較大，牛乳為11.0%，羊乳為3.8%；區(qū)域B中牛羊乳αs2-CN也存在較大差異，羊乳中此類(lèi)蛋白為一系列橫向排列的點(diǎn)，蛋白質(zhì)磷酸化修飾可能導(dǎo)致了其等電點(diǎn)的不同，Olumee[20]等發(fā)現(xiàn)羊乳αs2-CN中含有2個(gè)多磷酸肽和10個(gè)磷酸化位點(diǎn)，在等電聚焦過(guò)程中磷酸基團(tuán)不斷解離使蛋白質(zhì)聚焦于不同的pH，而牛乳αs2-CN分布較為集中，相對(duì)含量為8.9%，高于羊乳中的3.3%；區(qū)域C中牛乳β-CN的相對(duì)含量為14.3%，羊乳為21.8%，兩者在電泳行為上無(wú)明顯差異[21]，而Costa[22]等認(rèn)為薩能羊與高山羊2-DE圖譜中B區(qū)域一系列橫向排列的點(diǎn)為β-CN，C區(qū)域?yàn)棣羢2-CN；區(qū)域D主要分布的為κ-CN，牛乳κ-CN的等電點(diǎn)及蛋白點(diǎn)數(shù)較羊乳偏高，根據(jù)文獻(xiàn)顯示[23]，牛乳所有酪蛋白中只有κ-CN是糖基化的，因此磷酸化修飾及聚合程度的不同造成了牛羊乳κ-CN的差異。

表1 牛羊乳2-DE圖譜酪蛋白種類(lèi)比較

2.2 牛羊乳清2-DE圖譜分析

2.2.1 2-DE圖譜分析

牛羊乳清2-DE圖譜如圖5所示，在牛乳中檢測(cè)到628個(gè)蛋白點(diǎn)，羊乳中650個(gè)，由圖可知在25～40 ku的酪蛋白區(qū)間仍含有少量蛋白斑點(diǎn)，但其含量甚微。圖中蛋白點(diǎn)大多分布于凝膠下方20 ku以下低分子量區(qū)間和上方40 ku以上的高分子量區(qū)間，其中低分子量區(qū)域主要分布乳清蛋白，高分子量區(qū)域主要分布牛羊乳低豐度蛋白。乳清蛋白主要包括β-LG（E區(qū)域）和α-LA（F區(qū)域），低豐度蛋白主要為一些酶類(lèi)及活性蛋白成分[24]。在牛羊乳銀染膠上選擇清蛋白點(diǎn)（見(jiàn)圖5，牛乳清蛋白斑點(diǎn)標(biāo)注為b11～b16；羊乳清蛋白斑點(diǎn)標(biāo)注為g12～g15）和低豐度清蛋白（圖5中牛乳清低豐度蛋白斑點(diǎn)標(biāo)注為b17～b26；羊乳清低豐度蛋白斑點(diǎn)標(biāo)注為g16～g24），并在考染膠上對(duì)應(yīng)位點(diǎn)挖出對(duì)應(yīng)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

圖5 牛羊乳清蛋白2-DE圖譜

2.2.2 牛羊乳主要清蛋白圖譜比較

牛羊乳清蛋白主要有β-LG（區(qū)域E）、α-LA（區(qū)域F），此外乳清中還有低豐度蛋白如血清白蛋白（區(qū)域G）（比較如表2，在雙向電泳中的位置見(jiàn)圖5中的標(biāo)注）。牛乳α-LA的等電點(diǎn)略低于羊乳，蛋白點(diǎn)數(shù)與位置基本相同，因此牛羊乳α-LA無(wú)明顯差異。然而牛羊乳β-LG的雙向電泳行為存在顯著差別，牛乳β-LG斑點(diǎn)比羊乳β-LG更靠近酸性端，顯示牛乳β-LG的等電點(diǎn)低于羊乳，分子量與蛋白點(diǎn)數(shù)無(wú)明顯差別。血清白蛋白BSA處于70 ku分子量處，且牛羊乳中該蛋白電泳行為無(wú)明顯區(qū)別。

表2 牛羊乳2-DE圖譜清蛋白種類(lèi)比較

2.3 牛羊乳蛋白質(zhì)譜鑒定

2.3.1 牛羊乳酪蛋白質(zhì)譜鑒定

在脫脂牛羊乳考染膠上挖出選定的酪蛋白質(zhì)斑點(diǎn)（圖1標(biāo)示：b1～b10牛乳10個(gè)蛋白點(diǎn)，g1～g11羊乳11個(gè)蛋白點(diǎn)）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中主要差異酪蛋白斑點(diǎn)的質(zhì)譜圖如圖6所示，可知肽段離子峰主要集中在750～2 500 m/z之間，且此類(lèi)蛋白的匹配肽段數(shù)在2～2之間，匹配比率為11%～42%，牛羊乳中均鑒定出αs1-CN（b1～b3，g1～g2）、αs2-CN（b4，g5～g8）、β-CN（b10，g3～g4，g11）、κ-CN（b5～b9，g9～g10）4類(lèi)酪蛋白。

圖6 牛羊乳主要差異酪蛋白點(diǎn)質(zhì)譜圖

搜索數(shù)據(jù)庫(kù)得到的蛋白理論等電點(diǎn)與分子量見(jiàn)表3，結(jié)合表1中各蛋白點(diǎn)所處區(qū)域pH范圍及分子量位置可知，牛羊乳中酪蛋白種類(lèi)基本相同，但質(zhì)譜鑒定出的4類(lèi)酪蛋白的理論分子量和等電點(diǎn)與圖譜中顯示的分子量和等電點(diǎn)存在差異，且牛羊乳中同種類(lèi)蛋白的等電點(diǎn)也不相同，其原因可能為牛羊乳中同種蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同，不同的研究者鑒定該蛋白分子量與等電點(diǎn)的方法不同，且蛋白所處環(huán)境也可能不同，這些研究者的成果共同構(gòu)成了數(shù)據(jù)庫(kù)中該蛋白的理論等電點(diǎn)和分子量[25]。

表3 牛羊乳酪蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定信息

2.3.2 牛羊乳清蛋白質(zhì)譜鑒定

在牛羊乳清蛋白考染膠上挖出選定的清蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，選擇牛乳清蛋白點(diǎn)6個(gè)（圖5標(biāo)示：b11～b16）、羊乳清蛋白點(diǎn)4個(gè)（圖5標(biāo)示：g12～g15），主要差異清蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7，肽段離子峰主要分布在800～2 900 m/z之間，此類(lèi)蛋白的匹配肽段數(shù)在3～9之間，匹配比率為19%～55%，鑒定結(jié)果顯示出β-LG（b11～b13，b15～b16，g15）、α-LA（b14，g12～g14）兩類(lèi)清蛋白。b11～b13，b15～b16蛋白質(zhì)點(diǎn)的理論等電點(diǎn)與分子量分別為4.93和20 269 u；b14的為4.80和16 692 u；g15的為5.50和20 362 u；g12～g14的為5.06和16 700 u，結(jié)合表2可知，清蛋白在圖譜中顯示的等電點(diǎn)接近于理論等電點(diǎn)，顯示的分子量略小于理論分子量。同時(shí)在羊乳清2-DE圖譜區(qū)域E的左側(cè)存在一系列縱向排列的α-LA斑點(diǎn)（區(qū)域H），而牛乳清2-DE圖譜中不存在此類(lèi)斑點(diǎn)，因此可用于區(qū)別牛羊乳。

圖7 牛羊乳主要差異清蛋白點(diǎn)質(zhì)譜圖

2.3.3 牛羊乳低豐度清蛋白質(zhì)譜鑒定

在牛羊乳清蛋白考染膠上端挖出選定的低豐度清蛋白斑點(diǎn)（牛乳10個(gè)b17～b26、羊乳9個(gè)g16～g24）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示在牛乳中共鑒定出10種蛋白質(zhì)，羊乳中6種。其中絲氨酸蛋白酶系列（b17～b19,g17～g18）、補(bǔ)體成分3（點(diǎn)b23，g20～g21）、血清鐵傳遞蛋白（b25，g24）與聚免疫球蛋白受體（b26，g22～g23）在牛羊乳中均可鑒定出。Lu[26]等表明補(bǔ)體蛋白在山羊乳中的表達(dá)量高于其在牛乳中的含量。此外多種活性蛋白成分也在牛羊乳清中被鑒定出，如牛乳中的維生素D結(jié)合蛋白（b20）、α-1-抗糖蛋白（b21）、鋅-α-2-糖蛋白（b22）以及位于圖譜100 ku處的IgM重鏈恒定區(qū)（b24），而與牛乳絲氨酸A3-2（b17）對(duì)應(yīng)位置的羊乳清圖譜中鑒定的蛋白為α-2-HS-糖蛋白（g16），與牛乳鋅-α-2-糖蛋白（b22）和IgM重鏈恒定區(qū)（b24）對(duì)應(yīng)的分別為羊乳α-心肌1（g19）和聚免疫球蛋白受體（g22～g23）。因此牛羊乳中低豐度清蛋白種類(lèi)繁多且不同，該類(lèi)蛋白均可作為牛羊乳區(qū)別檢測(cè)的靶點(diǎn)。

2.4 牛羊乳蛋白生物信息學(xué)分析

對(duì)鑒定成功的15種牛乳蛋白與12種羊乳蛋白進(jìn)行基因注釋?zhuān)饕煞譃榉肿庸δ埽∕olecular Function）、生物學(xué)途徑（Biological Process）和細(xì)胞組件（Celluar Component）3個(gè)層面，注釋結(jié)果如圖8、圖9、圖10所示。

圖8為分子功能層面上的比較。鑒定出的牛乳蛋白中檢測(cè)到的功能有黏附功能、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、分子功能監(jiān)管、抗氧化活性、轉(zhuǎn)移酶的活性等5類(lèi)，其中有11種蛋白參與黏附功能，是蛋白參與最多的一種功能。而羊乳中檢測(cè)到了黏附功能、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、催化活性、酶調(diào)節(jié)活性、聚合物免疫球蛋白受體活性和受體活性等6類(lèi)功能，且參與各種功能的蛋白種類(lèi)相近。李春強(qiáng)[27]等研究發(fā)現(xiàn)黏附功能可以使蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)結(jié)合，形成結(jié)合蛋白，從而拓展蛋白功能，若其與抗原結(jié)合便可激活補(bǔ)體，促進(jìn)吞噬作用。

圖8牛羊乳蛋白GO注釋?zhuān)ǚ肿庸δ埽?/p>

圖9 為生物學(xué)途徑層面上的比較。牛乳蛋白參與的生物學(xué)途徑有14類(lèi)，以生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)、定位、細(xì)胞過(guò)程、個(gè)體組織過(guò)程、代謝過(guò)程等為主。而羊乳蛋白參與的生物學(xué)途徑有11類(lèi)，與牛乳相比多了受體集群與病毒反應(yīng)兩種途徑，少了免疫系統(tǒng)過(guò)程、應(yīng)對(duì)其他生物體、組織或生物起源細(xì)胞組件、抗氧化活性和細(xì)胞黏附5種途徑。張熙桐[28]等研究表明母乳、牛乳及羊乳3種乳中的清蛋白均在生物調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮最大作用，其次為對(duì)刺激的反應(yīng)，且母乳中參與各種生物學(xué)途徑的蛋白種類(lèi)數(shù)高于牛羊乳。

圖9牛羊乳蛋白GO注釋?zhuān)ㄉ飳W(xué)途徑）

圖10 為細(xì)胞組件層面上的比較。牛乳蛋白中檢測(cè)出的細(xì)胞組件包括細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞組分、高爾基腔、細(xì)胞器組分、膜、蛋白質(zhì)復(fù)合體等10類(lèi)，羊乳蛋白中未測(cè)到細(xì)胞、高爾基腔與膜，但檢測(cè)到了膜的有機(jī)組成部分和細(xì)胞核兩類(lèi)。葉清[29]等研究顯示在乳的細(xì)胞組件中，胞外區(qū)所占比例最大，在此區(qū)域會(huì)發(fā)生一系列細(xì)胞激活反應(yīng)，也是大量分子發(fā)生結(jié)合的重要區(qū)域。

圖10 牛羊乳蛋白GO注釋?zhuān)?xì)胞組件）

目前對(duì)牛羊乳蛋白質(zhì)的研究一般采用蛋白質(zhì)組分析方法對(duì)總蛋白樣品進(jìn)行研究，期望獲得更多種類(lèi)的蛋白質(zhì)信息，如翁秀秀[30]等利用雙向電泳技術(shù)探究不同泌乳期湖羊脫脂乳蛋白質(zhì)組特征，以第一天初乳的2-DE圖譜為參照，分別在第3天、第7天、第14天、第28天、第56天檢測(cè)到了38、35、34、38、36個(gè)差異蛋白點(diǎn)，然而由于脫脂牛羊乳中酪蛋白含量占乳中總蛋白質(zhì)的80%以上，致使許多低豐度清蛋白不被檢出，酪蛋白和較高含量的清蛋白作為乳中重要的儲(chǔ)藏蛋白，它們對(duì)乳品加工特性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值起決定性作用[31]。本研究采用等電點(diǎn)沉淀法去除酪蛋白的乳清樣品進(jìn)行電泳分析，有利于大量低豐度乳清蛋白的檢出，清蛋白大多為具有生物活性的球蛋白，對(duì)其功能分析有利于探尋產(chǎn)乳動(dòng)物的泌乳及生理特性[32]，其中一些蛋白還可以反映出乳腺的健康狀況。但由于該類(lèi)蛋白含量低、易變性的特點(diǎn)[33]，使得進(jìn)行蛋白組研究的重復(fù)穩(wěn)定性較差，本實(shí)驗(yàn)采取低溫冷凍干燥制樣，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。Yang[34]等利用相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)分析牛乳、耗牛乳、水牛乳、山羊乳與駱駝乳的乳清蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示共鑒定出211種蛋白質(zhì)，并分析了不同種類(lèi)乳蛋白質(zhì)組學(xué)模式差異的顯著性，揭示了各物種的特征清蛋白，為評(píng)估上述乳品摻假提供了信息，然而此種方法只從蛋白種類(lèi)與含量上分析了其差異，并未顯示其性質(zhì)差異，因此本研究采用雙向電泳技術(shù)分離乳蛋白，然后用質(zhì)譜鑒定并搜索數(shù)據(jù)庫(kù)得出各蛋白的分子結(jié)構(gòu)信息差異。本研究在牛羊乳離心脫脂過(guò)程中棄去了脂肪成分，其含有的乳脂肪球膜蛋白有待后續(xù)研究完善，對(duì)牛羊乳的蛋白質(zhì)組分析為牛羊乳蛋白質(zhì)的深入比較及摻假靶標(biāo)研究奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過(guò)雙向電泳技術(shù)在脫脂牛乳中檢測(cè)到了595個(gè)蛋白點(diǎn)，脫脂羊乳中659個(gè)，牛乳清中628個(gè)，羊乳清中650個(gè)，脫脂牛羊乳中主要蛋白種類(lèi)基本相似，但在2-DE圖譜中所處的位置卻不相同，主要是由于分子量與等電點(diǎn)存在差異，牛乳清與羊乳清的鑒定結(jié)果也類(lèi)似。其中αs1-CN、αs2-CN、κ-CN及β-LG在2-DE圖譜中區(qū)別較大，牛乳中αs1-CN含量為11.0%,，遠(yuǎn)高于羊乳的3.8%；牛乳中αs2-CN含量為8.9%，也高于羊乳中含量；牛乳κ-CN等電點(diǎn)為4.7～5.7，高于其在羊乳中等電點(diǎn)；牛乳β-LG的等電點(diǎn)為4.0～5.0，明顯高于其在羊乳中等電點(diǎn)，因此這4類(lèi)蛋白可作為牛羊乳摻假的指示蛋白。通過(guò)質(zhì)譜分析確定了牛羊乳酪蛋白與清蛋白的分子結(jié)構(gòu)信息以及理論等電點(diǎn)與分子量，同時(shí)多種低豐度蛋白也在乳清中被鑒定出，如牛乳中特有的維生素D結(jié)合蛋白、絲氨酸蛋白酶及α-1-抗糖蛋白，羊乳中特有的α-2-HS-糖蛋白等，此外還對(duì)成功鑒定的乳蛋白進(jìn)行基因注釋和功能差異分析比較，牛乳蛋白主要涉及抗氧化活性及細(xì)胞黏附等特有功能，而羊乳蛋白包括催化活性及與病毒反應(yīng)等特有功能。因此牛羊乳中蛋白質(zhì)等電點(diǎn)及分子量差異、特有低豐度蛋白種類(lèi)以及鑒定成功的蛋白功能差異均可作為牛羊乳區(qū)別檢測(cè)的靶點(diǎn)。