石見(jiàn)穿HPLC指紋圖譜研究

陳 莉 吳美蘭 應(yīng)松言

1 紹興市上虞第二人民醫(yī)院 浙江 紹興 312300

2 浙江景岳堂藥業(yè)有限公司 浙江 紹興 312025

石見(jiàn)穿為唇形科植物華鼠尾草（Salvia chinensis Benth.）的干燥地上部分[1]，收載于《中國(guó)藥典》1977年版一部，具有清熱解毒，活血，利氣，止痛的功效，用于脘脅脹痛，癰腫[1]。在臨床上廣泛應(yīng)用于抗腫瘤的治療[2-4]。石見(jiàn)穿產(chǎn)地主要為江蘇、湖北、浙江等地[5]。目前石見(jiàn)穿藥材的各省標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，僅性狀、顯微鑒別項(xiàng)。曲悅等[6]通過(guò)檢測(cè)迷迭香酸的含量對(duì)石見(jiàn)穿藥材的質(zhì)量進(jìn)行研究。現(xiàn)代研究中通過(guò)建立合適的指紋圖譜方法可以更好地呈現(xiàn)中藥的質(zhì)量[7]。目前尚無(wú)石見(jiàn)穿相關(guān)的指紋圖譜研究，通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究建立石見(jiàn)穿HPLC指紋圖譜有助于石見(jiàn)穿藥材質(zhì)量的控制。

1 儀器與試劑

島津LC-20AT高效液相色譜儀、電子天平［BT-125D，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］、超聲波清洗機(jī)（DL-480E，上海之信儀器有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（HHS-21-8，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、迷迭香酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)111871-201706，含量90.5%），甲醇乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。共收集不同產(chǎn)地石見(jiàn)穿藥材11批，樣品編號(hào)1～4產(chǎn)地為江蘇宿遷，5～6產(chǎn)地為浙江臨安,7～8產(chǎn)地為浙江淳安，9～11產(chǎn)地為湖北武漢。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件：色譜柱：InterSustain C18，4.6mm×250mm，5μm，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%甲酸酸溶液為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm，流速1.0mL/min，柱溫30℃。見(jiàn)表1。

表1 色譜條件

2.2 參照物溶液制備：取迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加75%甲醇制成每毫升含迷迭香酸40μg的溶液，作為參照物溶液。

2.3 供試品溶液制備：取本品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察：分述如下。

2.4.1 專屬性：精密吸取參照物溶液與供試品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性圖

2.4.2 精密度：取供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以迷迭香酸峰為S峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積，RSD值為0和1.23%，表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性：取供試品溶液分別在0、1、2、4、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣，以迷迭香酸峰為S峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積，RSD值為0.49和2.15%，表明24小時(shí)之內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性：取樣品照“供試品溶液制備方法”制備供試品溶液6份，以迷迭香酸峰為S峰，計(jì)算各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積，RSD值為0和3.11%，表明重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜建立與相似度計(jì)算：取11批樣品，依法制成供試品溶液，同前條件記錄指紋圖譜，見(jiàn)圖2。11批樣品共有峰為7個(gè)，其中6號(hào)峰為迷迭香酸參照峰。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2.0版，以10批中藥湯劑樣品的HPLC圖進(jìn)行自動(dòng)匹配，建立對(duì)照品指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。相似度計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 11批石見(jiàn)穿樣品指紋圖譜

圖3 石見(jiàn)穿對(duì)照指紋圖譜

表2 11批樣品相似度計(jì)算結(jié)果

3 討論

通過(guò)對(duì)不同流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸）的比較，選擇乙腈-0.05%甲酸按梯度進(jìn)行洗脫，分離效果最佳。在柱溫25℃、30℃、35℃條件下洗脫，均能達(dá)到較好的分離效果。分別選用不同型號(hào)色譜柱（InterSustain C18、Agilent SB-C18、Ultimate AQ-C18），結(jié)果均適用。通過(guò)3D光譜圖分析，迷迭香酸色譜峰最大吸收波長(zhǎng)為328nm，為指紋圖譜呈現(xiàn)更多色譜峰，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。

浙江省中藥飲片炮制規(guī)范2015年版收載石見(jiàn)穿基原為唇形科植物紫參（Salvia chinensis Benth.）或鼠尾草（Salvia japonica Thunb.）的干燥地上部分。其中“紫參”拉丁文名與華鼠尾草相同[8]，為同一植物。其他各省飲片炮制規(guī)范石見(jiàn)穿基原僅為華鼠尾草，未選用鼠尾草基原。經(jīng)市場(chǎng)調(diào)研，鼠尾草基原應(yīng)用較少，市場(chǎng)流通基原主流為華鼠尾草，實(shí)驗(yàn)所用藥材基原均為華鼠尾草。指紋圖譜的建立對(duì)藥材基原的區(qū)別提供參考。