冠心寧片改善大鼠心肌細胞焦亡機制探究

施佳君 楊欽欽 富丹婷 鄭純威 黃 強 陳 宇

浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

心力衰竭（heart failure，HF）是各種心臟疾病的終末階段，具有發(fā)病率高，死亡率高的特點。心衰的產生受多種因素影響，蒽環(huán)類抗癌藥物長期使用的患者中后期常出現心力衰竭癥狀。阿霉素是一種有效且常用的化療藥，具有劑量依賴的心臟毒性，使其在臨床使用中受到限制[1]。因此，迫切需要找到新的輔助治療方案，降低化療過程中對心臟的毒副作用，保護心臟。

從丹參和川芎中提取而成的冠心寧片（GXN），具有活血化瘀，通脈養(yǎng)心的功效。本課題組前期的研究表明，冠心寧片具有抗炎、降低炎癥因子水平、降低心肌耗氧量、調節(jié)缺血缺氧狀態(tài)下的氧代謝和能量供需平衡,改善心衰小鼠的心肌細胞凋亡等多途徑多靶點的作用[2-4]。越來越多的證據表明冠心寧片在臨床上對心衰防治有益，但其治療作用的分子機制仍然未知，基于此，本研究觀察冠心寧片對阿霉素誘導的心衰大鼠心臟的保護作用，探討冠心寧片的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物：冠心寧片，批準文號：國藥準字Z20150028，由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供。地高辛片，批準文號：國藥準字H33021738，由賽諾菲（杭州）制藥有限公司提供。注射用鹽酸多柔比星（阿霉素），批準文號：國藥準字H33021980，由瀚暉制藥有限公司提供。

1.2 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體重180～220g，購于杭州醫(yī)學院[SCXK（浙）2019-0002]，飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院SPF級屏障實驗室[SYXK（浙）2019-0010]，環(huán)境溫度：（22±2）℃，相對濕度50%～65%，光照12h明暗交替，噪音＜50dB。實驗期間，遵循3R原則給予實驗動物人道主義的關懷。倫理審查批號：浙中研動物倫理審字第[2022]014號。

1.3 主要試劑與儀器：分述如下。

1.3.1 主要試劑：NT-proBNP試劑盒（H334-1-1/20220516）、IL-1β試劑盒（H022-1-1/20220516）和IL-18試劑盒（H015-1-1/20220516）購于南京建成，β-actin（B661202）及PCR引物的設計合成購于生工生物；TRTzol Reagent RNA提取試劑（15596-026）購于invitrogen公司；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒（RR036A）、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ 試 劑 盒（RR820A）購于日本 TaKaRa公司。

1.3.2 主要儀器：M9vet小動物超聲影像系統(tǒng)（深圳邁瑞動物醫(yī)療有限公司）；脫水機及包埋機（湖北貝諾醫(yī)療科技有限公司）；轉輪式切片機（徠卡顯微系統(tǒng)上海有限公司）；Power Wave XS型全波長酶標儀（Gene Company Limited）。

1.4 實驗方法：分述如下。

1.4.1 模型的建立與分組給藥：將30只SD大鼠（雄性）按體質量隨機分成5組，即為正常對照組、模型對照組、GXN低劑量組（600mg/kg）、GXN高劑量組（1200mg/kg）、地高辛組（0.05mg/kg），每組6只。正常對照組和模型對照組每日灌胃純水10mL/kg，GXN低、高劑量組、地高辛組每日對應的劑量連續(xù)給藥9周。給藥的當天開始阿霉素造模，每5天腹腔注射（i.p.）2.5mg/kg，連續(xù)7次，累積濃度17.5mg/kg。

1.4.2 狀態(tài)觀察：試驗中，觀察大鼠的精神狀態(tài)，二便情況及毛色狀態(tài)，并統(tǒng)計存活情況。

1.4.3 超聲心動圖檢測：給藥9周時行超聲心動圖檢測。大鼠異氟烷誘導麻醉后，使用超聲影像系統(tǒng)記錄 M型超聲心動圖。選取連續(xù) 3個心動周期上測量各指標取其平均值。統(tǒng)計各組大鼠左室舒張末期室間隔厚度（IVSd）、左室舒張末期內徑（LVIDd）、左室后壁舒張末期厚度（LVPWd）、舒張末期容積（EDV）、左室收縮末期室間隔厚度（IVSs）、左室收縮末期內徑（LVIDs）、左室后壁收縮末期厚度（LVPWs）、收縮末期容積（ESV）、每搏輸出量（SV）、射血分數(EF)和短軸率（FS）等指標。

1.4.4 血液指標檢測：大鼠行頜下靜脈取血，分離血清備用，用于測定N末端腦利鈉肽前體（NT-proBNP）水平。

1.4.5 心肌組織病理學觀察：取大鼠心臟非心尖部分置于10%中性甲醛溶液中固定1周后，脫水，透明，浸蠟，包埋。制成蠟塊后，用切片機切成4μm薄片，待用于病理染色分析。①蘇木素-伊紅（HE）染色：行HE染色，掃描后用K-Viewer觀察心肌組織病理變化。②Masson染色：Masson染色按照試劑盒說明書進行，評估心肌纖維化程度，使用Image-ProPlus軟件測算每個切片各視野的心肌組織膠原容積分數（CVF）（CVF=膠原藍色陽性面積 /心肌組織總面積×100%）[5]。

1.4.6 RT-PCR檢測焦亡相關基因的蛋白表達：使用TRIzol法提取各組心肌組織的RNA，按照試劑盒說明進行逆轉錄反應和Real-time PCR檢測。逆轉錄反應條件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。RT-PCR反應條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，40 個循環(huán)；熔解曲線95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。以β-Actin作為內參基因，通過2-△△Ct法計算目的基因的相對表達量，各目的基因的引物序列。見表1。

表1 定量PCR的引物序列

1.5 統(tǒng)計學方法：用SPSS 19.0軟件和Image-Pro Plus分析數據，以平均數±標準差（±s）表示，計量資料應用ANOVA方差分析評價試驗結果，組間比較采用LSD分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察：正常組大鼠狀態(tài)良好，毛色光亮順滑，實驗期間未出現死亡；模型對照組大鼠前4周未見明顯異常，第5周開始出現輕微腹水，狀態(tài)萎靡，后期出現嚴重腹水、腹瀉癥狀，期間死亡1只；冠心寧低、高劑量組和地高辛組狀態(tài)均較模型組有所改善，期間均未出現死亡。

2.2 大鼠心臟結構和功能改變：9周后，與正常對照組比，模型對照組 IVSd、IVSs、LVPWs、SV顯著減?。≒＜0.01，P＜0.05），LVIDs、ESV顯著增加（P＜0.01），FS、EF顯著降低（P＜0.01），心率顯著減緩（P＜0.05）。與模型對照組相比，GXN低劑量組IVSs、SV、FS、EF和HR（P＜0.01，P＜0.05）顯著增加；GXN 高劑量組 IVSs、LVIDs、SV、FS和EF（P＜0.01，P＜0.05）顯著增加，ESV（P＜0.01）顯著降低；地高辛組IVSs、LVIDs、FS和EF（P＜0.01，P＜0.05）顯著增加，ESV（P＜0.01）顯著降低。見圖1。

圖1 大鼠超聲心動圖指標分析

2.3 血清NT-proBNP的指標變化：給藥9周后，與正常組相比，模型組的NT-proBNP顯著升高（P＜0.01）；給予不同劑量的冠心寧片和地高辛后，各組的NT-proBNP較模型組均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠血清NT-proBNP變化

2.4 冠心寧片對大鼠心肌病理形態(tài)的影響：HE染色顯示，正常對照組心肌細胞排列致密規(guī)則，細胞核呈橢球形，位于細胞中央，細胞形態(tài)完整，間隙清楚分明，周圍血管清晰，有薄層結締組織；模型對照組心肌組織分布不規(guī)則，結構雜亂，心肌細胞形態(tài)改變，肌纖維增厚，部分肌纖維斷裂，心肌細胞肥大，間隙增大，血管的基本結構喪失不飽滿，結締組織增生，炎癥細胞浸潤。給予不同濃度的冠心寧片和地高辛后，心肌組織損傷有一定的改善，心肌組織排列較為緊密，肌纖維斷裂的情況顯著改善，血管形態(tài)和外膜結締組織得到控制，炎癥浸潤減少。見圖3。

2.5 冠心寧片對大鼠心肌纖維化的影響：Masson染色顯示，正常組心肌細胞形態(tài)正常，無明顯的膠原沉積。模型組細胞間隙大量膠原纖維沉積，給予冠心寧片后，細胞間隙的膠原纖維明顯減少。見圖4。

圖4 大鼠心肌組織Masson染色圖（200×）

模型對照組的CVF顯著高于正常對照組（P＜0.01）；與模型對照組比，各給藥組及地高辛組的CVF均顯著下降（P＜0.01，P＜0.05），提示冠心寧片能顯著降低阿霉素誘導的心肌纖維化。見圖5。

圖5 大鼠心肌組織膠原容積分數

2.6 冠心寧片對焦亡相關基因表達的影響：由圖6可知，模型對照組NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA水平較正常對照組均顯著升高（P＜0.01），給予GXN后，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA水平均有不同程度的降低（P＜0.01，P＜0.05）。

圖6 大鼠心肌組織mRNA的差異表達

3 討論

HF是由多種因素引起的慢性心功能障礙疾病，其最基本的原因是心臟收縮或舒張功能障礙，導致心臟射血無法滿足機體的需求[6]。中醫(yī)學對心力衰竭沒有明確的定義，根據辨證論治和病因病機多將其歸為“胸痹”“真心痛”[7]。冠心寧是根據中醫(yī)學“活血化瘀”理論和多年臨床經驗總結而來，用于治療心臟疾病的代表復方，主要由丹參和川芎組成。同時，現代藥理學研究發(fā)現，丹參和川芎中的多糖類和酚酸類在心血管治療中起到了重要作用[8]。

蒽環(huán)類化療藥阿霉素作為有效的化療藥，常導致心臟毒副作用，主要表現為左心室功能障礙最終導致充血性心衰和擴張性心肌病，本研究運用該原理通過多次阿霉素腹腔注射建立心衰模型[9]。本研究結果顯示，冠心寧片能改善HF大鼠的存活情況，降低血清NT-proBNP、IL-1β和IL-18水平，表明冠心寧片對阿霉素誘導的心衰大鼠心臟有保護作用。

阿霉素誘導的心衰表現為心肌擴張、結構重塑[10]超聲心動結果顯示IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs均顯著降低，ESV顯著增加，冠心寧片干預后，沒有模型對照組改變的那么明顯，冠心寧片可延緩心肌擴張、結構重塑。本研究顯示，阿霉素誘導的心衰大鼠SV、EF、FS顯著降低，表明心臟功能嚴重損傷，GXN干預后，這些指標顯著增加，提示GXN可保護阿霉素誘導的心臟功能損傷，但是與給藥劑量并沒有明顯的依賴性，可能與劑量的設置有關系。

心臟的舒縮功能與心臟的順應性密切相關，心肌間質膠原沉積形成的纖維化是導致順應性降低的主要原因，是各種心臟疾病末期的必然結果，是心室重構的重要形式。HE和Masson染色顯示，心衰大鼠心肌發(fā)生了明顯的病理改變，且產生了大面積的纖維化，冠心寧片干預后，心臟的病理改變得到顯著緩解，纖維化明顯減少，表明冠心寧片可抑制膠原沉積，改善心臟重塑，提示抑制心肌纖維化可能是冠心寧片保護阿霉素誘導的心衰大鼠的重要機制之一。

研究顯示，阿霉素可通過氧化應激誘導活性氧的產生，從而導致NLRP3炎癥小體激活，使Caspase-1活性增強，促進IL-18和IL-1β的成熟，加重炎癥反應，進而導致細胞膨脹并最終溶解，從而誘導細胞焦亡[11]，并且細胞焦亡是除凋亡之外誘導心肌損傷的另一種重要形式，可導致心肌收縮功能下降，進而導致心衰。研究結果顯示，模型對照組的NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β的mRNA表達顯著增加，冠心寧片干預后，這些指標的mRNA有所降低，血清中IL-18和IL-1β水平亦降低，進一步證實了冠心寧片具有抵抗心肌細胞焦亡的作用。

綜上所述，冠心寧片能改善HF大鼠的存活情況，改善心肌重塑，增強心臟的功能，降低心肌纖維化，其作用機制可能是通過抑制Caspase-1介導的焦亡通路來減少心肌細胞焦亡，從而保護心衰大鼠。這也為長期使用阿霉素抗癌而導致心臟毒性副作用的患者提供了新的保護策略。