銅對低溫脅迫下空氣鳳梨抗寒生理特征的影響

丁久玲，孟海濤，鄭 凱*

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400；2.江蘇句容慢生活生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，江蘇句容 212400)

空氣鳳梨(Tillandsia)為鳳梨科(Bromeliaceae)鐵蘭屬(Tillandsia)多年生草本植物，包括近550個品種和90個變種。20世紀(jì)80年代開始在國外流行起來，我國近幾年開始引進(jìn)。因其栽培不需泥土，能吸收甲醛、重金屬等有害物質(zhì)，一經(jīng)引進(jìn)就受到許多人的喜愛和關(guān)注。

目前空氣鳳梨相關(guān)研究限于其作為空氣污染指示植物和去除環(huán)境污染的修復(fù)植物[1-4]及地域分布[5]、開花性狀[6-7]、栽培管理[8-10]、繁殖技術(shù)[11-13]等方面。然而，關(guān)于空氣鳳梨抗寒性的文獻(xiàn)較少。俞祿生等[14]研究認(rèn)為，供試松蘿等5種空氣鳳梨可以短期耐受-5～0 ℃低溫。鮑榮靜等[15]從相對電導(dǎo)率和成活率證明了3種空氣鳳梨抗寒能力大小。鄭桂靈等[16]研究表明，硬葉空鳳與貝可麗空鳳對-5 ℃低溫有一定的耐受性，但會失綠、萎蔫，該溫度已達(dá)到或超過空氣鳳梨生長的臨界溫度。同時，江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院自2006年開始引種馴化空氣鳳梨，栽培管理中發(fā)現(xiàn)，大部分空氣鳳梨品種冬季養(yǎng)護(hù)需溫室大棚方能順利過冬，否則會出現(xiàn)植株葉片受凍受損甚至死亡的現(xiàn)象，表現(xiàn)出較差的抗寒性。長江中下游江蘇、安徽等地區(qū)冬季不開空調(diào)，室內(nèi)溫度較低，甚者會低于-5～-10 ℃，在該低溫環(huán)境下，適于室內(nèi)微景觀裝飾的空氣鳳梨的生長勢必會受到不良影響。空氣鳳梨品種抗寒性不佳的狀況在一定程度上會影響其在市場上規(guī)?；耐茝V應(yīng)用。因此，有必要開展空氣鳳梨抗寒性及提高其抗寒性的探討。

關(guān)于空氣鳳梨抗寒性的研究較少，有關(guān)提高其抗寒性的研究鮮見報(bào)道。近年來，通過水楊酸、聚乙二醇、Ca2+、銅等外源調(diào)控物質(zhì)來緩解低溫對植物造成傷害的研究成為備受關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明[17-21]，銅是植物正常生命活動的微量營養(yǎng)元素，可以在一定程度上提高小麥、華北落葉松、仁用杏、煙草等植物的抗寒性。為滿足空氣鳳梨日以增長的市場需求，筆者基于銅可有效提高植物抗寒性的理論知識和發(fā)明專利(ZL201510609276.4)的相關(guān)授權(quán)內(nèi)容，進(jìn)一步探討外源物銅對低溫脅迫下空氣鳳梨抗寒生理特征的影響及其有效提高其抗寒性的銅適宜濃度等關(guān)鍵難題，豐富空氣鳳梨抗寒性機(jī)制理論，為解決低溫對空氣鳳梨的脅迫問題提供有效的方法和手段，以期為空氣鳳梨廣泛地推廣提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料供試材料為維路提(T.velutina)、小精靈(T.ionantha)、斯垂科(T.stricta)、貝克立(T.brachycaulos)、休斯頓(T.houston)、松蘿(T.usneoides)6個空氣鳳梨品種的無性繁殖系，且已于溫室內(nèi)培養(yǎng)馴化3年為成苗。

1.2 試驗(yàn)方法試驗(yàn)于12月至翌年2月在空氣鳳梨生產(chǎn)基地進(jìn)行。每個供試品種挑選大小基本一致的植株，剪除植株周圍的枯葉短葉，在溫室中恢復(fù)15 d后進(jìn)行銅處理。該溫室內(nèi)設(shè)溫控、風(fēng)機(jī)、遮陽網(wǎng)、水簾、微噴等設(shè)備，空氣濕度75%～90%。用硫酸銅溶液(CuSO4·5H2O)對空氣鳳梨進(jìn)行浸泡處理0.5 h。Cu2+處理設(shè)為7個，濃度分別為0、40、80、100、150、200、250 mg/L，其中0 mg/L為對照(CK)，處理編號分別為CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6。每處理3次重復(fù)，每個重復(fù)每個品種選取生長一致的空氣鳳梨植株30株。

Cu2+處理后將空氣鳳梨置于室外自然低溫下，即處于低溫脅迫狀態(tài)。試驗(yàn)期間室外最低溫度在-5～5 ℃，室外最高溫度在10～15 ℃。每14 d用1 000 mg/L的氮、磷、鉀比例為17∶8∶22的肥料對空氣鳳梨噴施1次，每隔4 d噴水1次，肥料和水pH 6.0～7.0。試驗(yàn)期間定期觀測植物生長狀況，60 d后取樣測定生理指標(biāo)。

1.3 測定項(xiàng)目電解質(zhì)滲出率(REC)測定采用電導(dǎo)儀法[22]，葉綠素(Chl)含量測定采用乙醇提取法[22]，脯氨酸(PRO)含量采用脯氨酸分光光度計(jì)試劑盒法測定，丙二醛(MDA)含量采用丙二醛分光光度計(jì)試劑盒法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采利用超氧化物歧化酶分光光度計(jì)試劑盒法測定，過氧化物酶(POD)活性采用過氧化物酶分光光度計(jì)試劑盒法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫酶分光光度計(jì)試劑盒法測定。以上試劑盒由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅對低溫脅迫下空氣鳳梨葉片葉綠素(Chl)含量的影響葉綠素是植物進(jìn)行光合作用時捕獲光能的重要物質(zhì)，其含量的增加可以在一定程度上提高光合速率的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)植物生長，進(jìn)而間接提高植物的抗逆性，是研究光合生理的重要指標(biāo)之一[23]。不同濃度銅處理對供試空氣鳳梨Chl含量的影響不同(圖1)。隨著銅濃度的增加，低溫脅迫下各品種Chl含量呈先升高后降低的趨勢，T3或T4處理Chl含量最大(顯著高于CK與其他處理)，處理T6最小。小精靈、松蘿和斯垂科3個品種T5和T6處理的Chl含量顯著低于CK，維路緹、貝克立和休斯頓3個品種CK的Chl含量顯著低于T5處理，高于T6處理。由此可知，并不是銅濃度越高越利于低溫脅迫下空氣鳳梨Chl含量的增加，只有適宜濃度的銅才可以使低溫脅迫下空氣鳳梨Chl含量顯著增加，促進(jìn)其生長。該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)銅濃度為80～150 mg/L時，低溫脅迫下供試空氣鳳梨Chl含量顯著高于CK和其他處理；當(dāng)銅溶液濃度過高時(250 mg/L)，Chl含量反而顯著降低，低于CK，抑制空氣鳳梨生長，不利于抵御嚴(yán)寒。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)

2.2 銅對低溫脅迫下空氣鳳梨游離脯氨酸(PRO)含量的影響低溫條件下，植物會主動合成和積累某些物質(zhì)來降低細(xì)胞液的滲透勢，有效避免細(xì)胞過度脫水，從而完成滲透調(diào)節(jié)過程。PRO是主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，其含量在一定程度上可以反映植物的抗寒性[24]。不同濃度的銅對低溫脅迫下空氣鳳梨PRO含量的影響有所不同(圖2)。從圖2可見，隨著銅濃度的增加，低溫脅迫下空氣鳳梨PRO含量呈先升后降的趨勢，T3或T4處理的PRO含量最大，大部分品種(小精靈除外)以T6處理最小。供試空氣鳳梨(休斯頓除外)T1和T2處理的PRO含量顯著高于CK，而休斯頓T2處理的PRO含量顯著高于CK。各品種T3和T4處理的PRO含量均顯著高于CK和其他處理，2個處理間差異顯著(休斯頓除外)。T5和T6處理與CK對比其PRO含量表現(xiàn)各不相同：小精靈T5和T6處理的PRO含量顯著高于CK，且2個處理間差異顯著；松蘿T5處理的PRO含量顯著高于CK，而T6處理顯著低于CK；斯垂科T5和T6處理的PRO含量均顯著低于CK；維路緹、貝克立和休斯頓3個品種的CK與T5處理相比PRO含量差異不顯著，而CK顯著高于T6處理。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)

由以上分析可知，外施80～150 mg/L的銅可使低溫脅迫下供試空氣鳳梨PRO含量顯著增加，緩解空氣鳳梨因遭受低溫受到的傷害；當(dāng)銅濃度為250 mg/L時，PRO含量顯著下降，甚至顯著低于CK，造成植物細(xì)胞嚴(yán)重脫水，抗寒性顯著降低。

2.3 銅對低溫脅迫下空氣鳳梨細(xì)胞膜系統(tǒng)的影響

2.3.1對丙二醛(MDA)含量的影響。植物細(xì)胞膜系統(tǒng)是遭受低溫傷害的首要部位，脂質(zhì)過氧化作用啟動，MDA 迅速積累，使細(xì)胞膜的完整性受損[25]。通常利用MDA作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度和植物對低溫逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱，其含量高低與植物抗寒性強(qiáng)弱成反比。不同濃度銅處理對空氣鳳梨MDA含量的影響有所不同(圖3)。從圖3可見，隨著銅濃度的增加，低溫脅迫下空氣鳳梨(小精靈除外)MDA含量呈先降低后升高的趨勢，T3或T4處理MDA含量最小，T6處理最大。其中，小精靈、松蘿、斯垂科和維路緹4個品種T1、T2和CK處理間的MDA含量差異不顯著；貝克立和休斯頓2個品種T1處理的MDA含量與CK相比差異不顯著，T2處理低于CK，T1和T2處理間差異不顯著。T3和T4處理的MDA含量低于CK和其他處理，且2個處理間差異不顯著(松蘿、貝克立和休斯頓除外)。供試品種T5和T6處理的MDA含量顯著高于CK和其他處理，且T6處理的MDA含量顯著大于T5處理(斯垂科除外)。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)

由此可認(rèn)為，并不是銅濃度越高越利于低溫脅迫下供試空氣鳳梨MDA含量的降低，只有適宜濃度的銅才可以使空氣鳳梨MDA含量顯著降低，提高其抗寒性。該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)銅溶液濃度為100～150 mg/L時，供試空氣鳳梨MDA含量顯著低于CK和其他銅處理，與CK相比，降低率達(dá)27.1%～41.1%；當(dāng)銅濃度過高時(200～250 mg/L)其MDA含量反而會增加，顯著高于CK和其他銅處理。

2.3.2對電解質(zhì)滲出率(REC)的影響。低溫條件下，植物的細(xì)胞膜通透性增大，電解質(zhì)大量向細(xì)胞外滲透，導(dǎo)致REC增加。REC是評定植物抗逆境能力的指標(biāo)之一，REC越高，說明植物受到的傷害越大，其抗寒性越低；REC越低，說明植物受傷害越小，其抗寒性越高。該研究在自然低溫狀態(tài)下對不同空氣鳳梨品種進(jìn)行銅處理，通過測定不同銅濃度下各品種的REC，確定銅是否能提高空氣鳳梨的抗寒性。

不同濃度銅處理對低溫脅迫下空氣鳳梨REC的影響與MDA含量表現(xiàn)一致(圖4)，均呈先降低后升高的趨勢，T3或T4處理最低，T6處理最高，且各品種的REC與MDA含量呈明顯的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別為：小精靈0.987、松蘿0.867、斯垂科0.986、維路緹0.872、貝克立0.969和休斯頓0.995。小精靈、松蘿、斯垂科和貝克立4個品種T1、T2和CK處理間的REC差異不顯著；維路緹和休斯頓2個品種T1處理與CK間差異不顯著，T2處理顯著低于CK，T1與T2處理間差異不顯著。各品種T3和T4處理的REC顯著低于CK和其他處理，2個處理間差異顯著。T5和T6處理下空氣鳳梨REC顯著高于CK和其他處理，且T6處理的REC顯著大于T5處理。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)

據(jù)此可判斷，銅濃度過低(≤80 mg/L)，低溫脅迫下空氣鳳梨的REC降低不明顯；只有適宜濃度的銅(100～150 mg/L)才可使空氣鳳梨REC顯著降低，降低率為34.2%～47.4%；當(dāng)銅濃度較高(200～250 mg/L)時空氣鳳梨REC不但沒有降低，反而急劇增加，顯著高于CK和其他銅處理，植物受到的傷害顯著增大。

2.4 銅對低溫脅迫下空氣鳳梨抗氧化酶活性的影響

2.4.1對超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響。低溫脅迫會使植物體內(nèi)積累有毒害作用的活性氧，過多的活性氧攻擊細(xì)胞膜，使植物受到不良傷害。在植物抗氧化系統(tǒng)中，SOD、POD等是消除活性氧的重要保護(hù)性酶類，可以有效減輕植物細(xì)胞膜的過氧化傷害[26]。從圖5可以看出，不同濃度銅處理對低溫脅迫下空氣鳳梨SOD活性的影響不同。隨銅濃度的增加，空氣鳳梨SOD活性呈先升后降的趨勢，T3或T4處理的SOD活性最大，T6處理最小。各供試空氣鳳梨品種(松蘿除外)T1和T2處理的SOD活性顯著高于CK，而松蘿T2處理的SOD活性顯著高于CK。各品種T3和T4處理的SOD活性均顯著高于CK和其他處理，且2個處理間差異顯著(休斯頓除外)。小精靈和松蘿2個品種CK與T5處理相比SOD活性差異不顯著，但顯著高于T6處理；斯垂科、維路緹、貝克立和休斯頓4個品種CK的SOD活性顯著高于T5和T6處理。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)

據(jù)以上分析可認(rèn)為，外施80～150 mg/L銅溶液可使低溫脅迫下空氣鳳梨SOD活性顯著增強(qiáng)，有效緩解活性氧對空氣鳳梨造成的不良傷害；當(dāng)銅濃度≥200 mg/L時，SOD活性反而下降，甚者顯著低于CK，說明空氣鳳梨的抗寒性顯著降低。

2.4.2 對過氧化物酶(POD)活性的影響研究表明[27]，POD是植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的組成部分，可以抵御細(xì)胞發(fā)生膜質(zhì)過氧化，POD酶活性高低與抗寒性強(qiáng)弱密切相關(guān)。隨著銅濃度的增加，低溫脅迫下空氣鳳梨POD活性的變化趨勢與SOD活性相似(圖6)，呈先升后降的趨勢，以T3或T4處理的POD活性最大(顯著高于CK和其他處理)，T6處理的POD活性最小(顯著低于CK和其他處理)。小精靈、松蘿、斯垂科和維路緹4個品種T1和T2處理的POD活性顯著高于CK；貝克立和休斯頓T1處理和CK的POD活性差異不顯著，T2處理的POD活性顯著高于CK。松蘿、貝克立的T5處理的POD活性顯著低于CK；小精靈、維路緹、斯垂科、休斯頓4個品種CK與T5處理的POD活性差異不顯著。

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)

根據(jù)不同濃度的銅對低溫脅迫下空氣鳳梨POD活性的影響可知，外施80～150 mg/L的銅可顯著增加空氣鳳梨的POD活性，提高其抗寒性，緩解低溫脅迫的傷害；當(dāng)銅濃度為250 mg/L時其POD活性顯著下降，植物的抗寒性降低。

3 結(jié)論與討論

葉綠素與植物的光合生理特征及生長密切相關(guān)，其含量的變化能反映低溫對植物的傷害程度[28]。銅是植物所需的微量元素之一，另外，因葉綠素中有含銅酶，葉綠素的形成與銅有關(guān)，故一定濃度的銅可以提高空氣鳳梨的Chl含量，增強(qiáng)光合作用，促進(jìn)其生長。朱振乾等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CuSO4為80 mg/L時，低溫脅迫下的煙草幼苗Chl含量較高，光合能力較強(qiáng)；朱啟紅等[29]研究認(rèn)為，低濃度銅對燈芯草Chl合成有促進(jìn)作用；謝潛淵等[17]研究證明，CuSO4能使低溫脅迫下的小麥葉綠素色素穩(wěn)定性增強(qiáng)，有效提高小麥的抗寒性。該研究結(jié)果與以上報(bào)道基本一致，表明外施銅濃度為80～150 mg/L時空氣鳳梨Chl含量顯著增加，生長良好。銅作為重金屬，濃度過高可誘發(fā)植物過氧化作用，破壞葉綠體、類囊體膜的結(jié)構(gòu)和功能，使光合過程的聯(lián)系阻斷，使光合作用嚴(yán)重受阻[30]，這可能是當(dāng)銅濃度為250 mg/L時空氣鳳梨Chl含量反而顯著降低的原因之一。

PRO是有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可平衡細(xì)胞滲透壓，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，通過防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化來降低低溫脅迫對空氣鳳梨造成的傷害，其含量增加可提高植物的抗寒性[24]。銅元素作為植物所需的微量元素，同時亦屬重金屬范疇，對植物體內(nèi)PRO含量的影響普遍認(rèn)為是低促高抑。孟衡玲等[31]研究表明，低濃度銅處理(100、200 mg/L)使金銀花PRO含量呈上升趨勢，高濃度銅處理(400、800 mg/L)使PRO含量呈下降趨勢。周娜娜等[32]研究認(rèn)為，隨著銅濃度的增加，花生幼苗的PRO含量呈先升后降的趨勢。該研究亦得出了相似的結(jié)論，認(rèn)為外施濃度相對較低的銅(80～150 mg/L)可以促進(jìn)空氣鳳梨PRO的累積，有效減緩低溫傷害；高濃度的銅(250 mg/L)使空氣鳳梨PRO含量顯著降低，加劇植物受害程度，降低抗寒性。

植物細(xì)胞膜在逆境脅迫下其完整性遭到破壞，通透性增大，脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致MDA大量積累，REC急劇增加，故通常用MDA含量和REC這2個指標(biāo)反映植物對逆境的適應(yīng)能力，指標(biāo)值越大，說明植物受害越重，反之則植物受到的傷害越輕，其抗性越強(qiáng)[25]。試驗(yàn)表明[20]，銅處理可有效抑制仁用杏細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化作用(即植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的降低)，降低細(xì)胞膜受損程度，使仁用杏抗寒性得到提高。該研究通過MDA含量和REC這2個指標(biāo)來綜合反映銅對低溫脅迫下空氣鳳梨細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響，證明了二者具有較強(qiáng)的相關(guān)性，即細(xì)胞膜通透性增加的同時其脂質(zhì)過氧化亦加?。徊⒉皇倾~濃度越高越利于空氣鳳梨MDA含量和REC的降低，只有銅濃度為100～150 mg/L時，供試空氣鳳梨細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用和透性顯著降低，穩(wěn)定性增強(qiáng)，細(xì)胞膜受損程度顯著降低，進(jìn)而顯著提高空氣鳳梨的抗寒性。

低溫脅迫下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡紊亂，過多的活性氧攻擊細(xì)胞膜，導(dǎo)致植物受到傷害，故及時清除活性氧至關(guān)重要。SOD和POD作為重要的抗氧化酶類，協(xié)同作用可以有效降低植物體內(nèi)因低溫脅迫累積的活性氧濃度，抵御細(xì)胞膜的過氧化傷害[27]。有文獻(xiàn)表明[33]，銅是SOD酶的組成成分，參與消除超氧自由基的傷害作用，對植物生長發(fā)育具有不可替代的作用。楊秀清[20]研究表明，銅通過增強(qiáng)仁用杏SOD活性而使超氧自由基含量降低，從而抑制細(xì)胞脂質(zhì)過氧化作用來提高其抗寒性。李濤等[34]研究認(rèn)為，銅作為SOD同工酶的輔基之一，其適量增加可增強(qiáng)黃瓜幼苗SOD活性，進(jìn)而提高黃瓜的抗冷性。朱振乾等[21]研究報(bào)道，80 mg/L CuSO4可使低溫下煙草POD和PRO增加，有效清除煙草體內(nèi)多余的活性氧，增強(qiáng)抗冷性。筆者將常見的抗氧化酶(SOD和POD)結(jié)合起來反映銅處理對低溫脅迫下空氣鳳梨活性氧變化的影響，結(jié)果表明，外施80～150 mg/L的銅可使供試空氣鳳梨SOD和POD活性顯著增加，二者變化趨勢一致，對有效緩解低溫脅迫累積的活性氧造成的傷害表現(xiàn)出協(xié)同性，平衡性得以維持；同時，適宜濃度的銅處理空氣鳳梨SOD和POD活性的增加與細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用(MDA和PRO)受到抑制及細(xì)胞膜透性(REC)的降低相吻合，說明空氣鳳梨通過自身調(diào)節(jié)機(jī)制適應(yīng)了低溫環(huán)境對其自身的氧化脅迫，維持了機(jī)體內(nèi)自由基代謝的動態(tài)平衡。

該研究表明，不同濃度的銅處理對低溫脅迫下空氣鳳梨抗寒生理特征的影響有所不同。隨著銅濃度的增加，各品種Chl含量、PRO含量、抗氧化酶活性的變化均呈先升高后降低的趨勢，表現(xiàn)細(xì)胞膜透性的MDA含量和REC變化趨勢表現(xiàn)為先降低后升高。綜合各抗寒生理特征，在低溫脅迫下，銅濃度過高或過低均不利于空氣鳳梨抵御低溫脅迫，適宜的銅濃度(100～150 mg/L)下空氣鳳梨Chl含量、PRO含量、抗氧化酶活性均較高，MDA含量和REC較低，植物生長良好，滲透勢穩(wěn)定，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化傷害有效降低，抗寒性顯著提高。