水稻耐淹性狀QTL分析

王 倩，吳 嫻，劉玉薇，吳朝昕，李祖軍，龔記熠，朱速松*

(1.貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽 550001；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院水稻研宄所，貴州貴陽 550006；3.貴州大學農(nóng)學院，貴州貴陽 550025)

水稻是唯一能在無氧環(huán)境下萌發(fā)的谷類作物[1]，在水淹環(huán)境下雜草能夠得到一定程度的控制。當水稻種子遭受水淹時，氧氣濃度過低，種子在進行有氧呼吸時直接受制，造成出苗率下降[2]。已有研究表明，水稻種子在水淹環(huán)境中萌發(fā)時，其胚芽鞘的長度與耐淹成苗率呈極顯著正相關關系[3-5]。因此，水稻在受到水淹的惡劣環(huán)境下萌發(fā)時，挑選出苗能力強的耐淹性水稻品種對水稻的安全生產(chǎn)具有重要意義。

在水稻水淹試驗中，不同品種、環(huán)境和處理方法下的胚芽鞘長度存在不同程度的變異[6]，屬于多基因控制的數(shù)量性狀[7]。學者們選取不同群體進行耐淹性狀QTL研究，定位到的位點存在一定差別，如侯名語等[4]利用Kinmaze/DV85 RIL群體分別在第1、2、5、7號染色體上檢測到耐淹性QTLs,貢獻率在10.5%～19.6%。Jiang等[8]利用秈稻與粳稻雜交F2群體定位到2個相關QTL，分布在第5、11號染色體上，貢獻率分別為15.51%和10.99%。王洋等[9]利用粳粳交RIL群體定位到2個相關QTLs，又利用秈粳交BIL群體定位到6個相關QTLs。Angaji等[10-11]以IR64為輪回親本構建2個不同的BIL群體,用區(qū)間作圖(IM)和復合區(qū)間作圖(CIM)2種方法進行比較，在其中一個BIL群體中的9號染色體上定位到一個位點qAG-9-2, 該位點貢獻率為20.59%。與此同時，與耐淹性狀有關的基因也被成功克隆，如位于第2染色體上的OsABA8ox1基因[12]，位于第3染色體上的OsETOL1基因[13]和OsMPK3基因[14]，以及第9染色體上的Sub1A基因[15]。筆者以貴9B和熱研2號為親本構建的秈粳交遺傳背景RIL，以胚芽鞘長度為表型數(shù)據(jù)，對控制水稻耐淹性狀進行QTL定位分析，篩選和創(chuàng)制耐淹種質，旨在為主效基因的克隆和育種應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選取粳稻品種熱研2號作母本，秈稻品種貴9B作父本，雜交后獲得F1，自交后采用單粒傳法在貴陽、海南兩地連續(xù)重組自交，穩(wěn)定后得到100個重組自交系群體家系。

1.2 田間種植將100個重組自交系群體家系及2個親本于2020年5月播種于貴州省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所試驗田中。每個家系種植4行,每行10株，規(guī)劃密度為寬行35 cm,窄行25 cm，株距為20 cm，所有材料管理方式均為常規(guī)田間管理。

1.3 水淹條件下種子萌發(fā)將構建的RILs群體以及對應親本成熟后的種子分別于9月和10月以行中單株收取。種子曬干后脫粒,置于鼓風干燥箱中38 ℃處理2 d，-20 ℃貯存?zhèn)溆?。從每個株系中挑選出20粒飽滿、干燥、無病種子，用6% NaClO 浸泡種子15 min，再用純凈水沖洗3～4次，使NaClO無殘留。使用純凈水淹沒種子，使其浸泡24 h后換1次水，再繼續(xù)浸泡24 h。待種子打破休眠后，將其放入光照培養(yǎng)箱中催芽，溫度設定為37 ℃，時間為48 h。挑選出發(fā)芽情況相同的種子各12粒，分別置于6支相同規(guī)格的試管中，每支試管底部裝入4粒種子，加入20 mL去離子水，用試管塞密封試管口，放置在27 ℃適溫黑暗條件下的人工氣候箱中培養(yǎng)7 d,并設置3次重復。品種比較分析和QTL檢測的表型值為3次重復計算出的胚芽鞘長度平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析試驗種子出箱后,使用毫米刻度尺測定每一株系每一株幼苗萌發(fā)的胚芽鞘長度，利用 Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理和直方圖的繪制。

1.5 葉片DNA提取和遺傳圖譜的構建從田間收取成熟的葉片組織后，使用CTAB法提取DNA。用覆蓋水稻全基因組的SSR標記共661對，在親本貴9B和熱研2號之間進行多態(tài)性篩選，最終篩選出161對SSR引物以及3對InDel引物多態(tài)性良好且在基因組上分布均勻的分子標記，篩選出的引物用來分析RIL群體基因型。圖譜構建采用ICI Mapping 4.2軟件，將軟件中的“sdl”作圖模塊中的“SAM ”分析方法作為偏分離檢測，其中LOD值設置為2.5，用以分析作圖所用標記的偏分離情況，在圖譜中只檢測到1個占總標記數(shù)0.6%顯著偏分離標記，說明該圖譜適用于QTLs檢測。

1.6 QTL分析QTL分析采用ICI Mapping 4.2軟件中的完備區(qū)間作圖法(ICIM),掃描步長(walk speed)為1.0 cM，逐步回歸標記進入概率PIN為 0.001，LOD閾值確定為2.5。RILs群體中加性效應值為正，說明增效等位基因來源于親本熱研2號；加性效應值為負，說明增效等位基因來源于親本貴9B。

2 結果與分析

2.1 雙親和 RILs 群體在淹水條件下胚芽鞘表型數(shù)據(jù)2個親本以及100個重組自交系群體家系在淹水條件下黑暗生長7 d后進行表型測定，其中親本貴9B在淹水環(huán)境下生長7 d后胚芽鞘長度為1.427 cm，親本熱研2號胚芽鞘長為1.999 cm。該RILs 群體在淹水條件下生長7 d后，其胚芽鞘長變幅為0.793～2.801 cm，峰度0.163，偏度0.521。胚芽鞘長度數(shù)據(jù)接近正態(tài)分布(圖1)，耐淹性狀表現(xiàn)出受多基因控制的數(shù)量性狀特征。

圖1 貴9B/熱研2號RILs耐淹條件下生長7 d后的胚芽鞘長度分布

2.2 RILs耐淹性狀QTL分析利用ICI Mapping 4.2軟件中的完備區(qū)間作圖法(ICIM)模塊對貴 9B和熱研2號的RILs群體進行耐淹性狀QTL分析，在第6和第9染色體上檢測到2個控制耐淹性狀的QTL位點，分別將其命名為qGS-6-1和qGS-9-1，對應位置和遺傳效應見表1。qGS-6-1位于第6染色體標記 RM345 與RM461遺傳距離10.14 cM之間，LOD值為2.89，貢獻率12.03%，加性效應為負，等位基因來源于親本貴9B；qGS-9-1位于第9染色體標記RM257與RM566遺傳距離13.15 cM之間，LOD值為2.51，貢獻率10.52%，加性效應為正，等位基因來源于親本熱研2號(表1、圖2)。

注：a.RILs耐淹性狀QTL定位在第6染色體上的分布;b.RILs耐淹性狀QTL定位在第9染色體上的分布

表1 水稻耐淹性狀QTL定位

3 討論

由于種植地區(qū)的環(huán)境差異，當種子播種在遭受氣候及水災等惡劣環(huán)境影響時，急劇減少的氧氣濃度導致水稻的出苗率嚴重下降，使直播稻的生展受到限制[16]。據(jù)相關研究報道,種子的耐淹性狀在不同品種之間存在著差異[17-19]，直播稻生產(chǎn)中提高種子出苗率的關鍵是選擇耐淹能力強的品種，Sub1A基因是一個通過QTL定位克隆得到的控制水稻耐淹性狀的QTL基因，因此,篩選耐淹性強的種質資源,挖掘新的耐淹性狀基因,并解釋其耐淹機制是克服直播出苗率低的有效途徑。

該研究利用貴9B/熱研2號構建重組自交系群體，并對水稻耐淹性狀進行QTL定位分析，共檢測到2個耐淹性狀相關QTL，分別定位在第6和第9染色體上，貢獻率分別為12.03%和10.52%。qGS-6-1的標記區(qū)間在RM345～RM461，在GRAMENE網(wǎng)站(https://archive.gramene.org/)進行比對分析發(fā)現(xiàn)，與饒玉春等[20]在第6染色體上定位到的耐淹QTL(RM528～SBE1)有重疊部分，說明該區(qū)間可能存在一個穩(wěn)定控制水稻耐淹性狀的位點。由于Sub1基因是一個已知的耐淹基因，同時也分布在第9染色上[15]，將qGS-9-1(RM257～RM566)與Sub1(RZ698～C1232)的物理位置比較后發(fā)現(xiàn)，Sub1與該研究的qGS-9-1位點不同，物理距離相差較遠，推測qGS-9-1所在區(qū)間內有一個潛在的耐淹性狀相關QTL位點。同時，將qGS-9-1與孫廣志等[21]在第9條染色體處檢測到的耐淹QTLqGS9比較后發(fā)現(xiàn)，qGS-9-1位點與qGS9位點相近，說明該位點在不同環(huán)境及群體中的表達較穩(wěn)定。根據(jù)該研究檢測到的2個耐淹性QTL，可為下一步通過分子標記輔助選擇方法選育耐淹性狀優(yōu)良的品種創(chuàng)造條件，也為水稻耐淹新品種的培育提供了重要的親本資源、基因資源以及標記資源，同時也對優(yōu)良耐淹品種的選育提供了理論依據(jù)。

4 結論

該研究利用貴9B/熱研2號構建RILs，對該群體的耐淹性狀進行QTL定位，最終在第6和第9染色體上定位到2個控制耐淹性狀的QTL，分別是qGS-6-1和qGS-9-1，貢獻率分別為12.03%和10.52%。與前人的研究比較發(fā)現(xiàn)，已有研究中的部分位點與該研究中的位點有重疊或相近部分，說明該研究結果能夠穩(wěn)定表達。綜上所述，該研究中定位的QTL位點可為分子輔助育種奠定基礎，篩選出耐淹性狀的材料和克隆出耐淹新基因是水稻直播提高育種效率的關鍵。