響應面法優(yōu)化混菌發(fā)酵肉鵝青貯飼料工藝研究

■裴朝東

（廣西工商職業(yè)技術學院，廣西南寧 530007）

近幾年來，隨著飼料原料價格的上漲，以玉米、豆粕為主要原料的配合飼料的成本大幅上升，對養(yǎng)殖戶造成非常大的壓力，并進一步壓縮了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益。越來越多的養(yǎng)殖企業(yè)將目光轉(zhuǎn)向原料代替。其中，地緣性飼料（特別是青貯飼料）的使用，可提高飼料利用率，降低養(yǎng)殖成本，改善養(yǎng)殖動物品質(zhì)，減少由養(yǎng)殖帶來的環(huán)境壓力，是近年來養(yǎng)殖業(yè)的主要發(fā)展趨勢。青貯飼料作為牲畜的重要飼料之一，受到越來越多的業(yè)內(nèi)人員關注和使用。特別是以嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌等為菌種，通過不同工藝發(fā)酵甜象草、甘蔗尾、構樹葉、桑枝等地緣性飼料，具有重要的研究價值。研究發(fā)現(xiàn)，微生物飼料添加劑能有效改善青貯飼料的營養(yǎng)價值和飼料價值，其中乳酸菌能在厭氧環(huán)境下良好生長，青貯過程中添加嗜酸乳桿菌能抑制有害菌的生長、降低細胞的有氧消耗，從而減少青貯原料的養(yǎng)分損失、降低青貯飼料的pH 和氨態(tài)氮的含量[1]。高曉梅等[2]關于不同類型飼料原料混合發(fā)酵青貯象草品質(zhì)的影響研究顯示，在象草中添加不同類型飼料原料混合青貯象草，可有效降低青貯飼料的pH 和纖維含量。彭昱雯等[3]對酒糟發(fā)酵生物飼料的生產(chǎn)及其對動物生產(chǎn)性能的影響研究發(fā)現(xiàn)白酒糟富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是青貯發(fā)酵飼料的理想原料。楊耀剛等[4]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對玉米秸稈等青貯原料具有良好的發(fā)酵作用。

基于以上研究情況，本試驗以嗜酸乳桿菌活菌數(shù)為衡量指標，通過對組成產(chǎn)品的干白酒糟、稻殼、玉米粉和象草等4 種原料的組成含量進行分析，研究各因素對嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的影響情況，為肉鵝養(yǎng)殖戶根據(jù)實際生產(chǎn)條件進行混菌發(fā)酵青貯飼料提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

原料：稻殼（廣西雄達米業(yè)有限公司）、干白酒糟（市售干白酒糟，常溫下暫存3個月，簡稱酒糟）、玉米粉（廣西馬山縣本地產(chǎn)玉米）、甜象草（簡稱象草，廣西本地種植象草）。

菌粉：嗜酸乳桿菌（Lactobacilltus acidlophilus）（山東蔚藍生物科技有限公司，含量10×108CFU/g）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（山東蔚藍生物科技有限公司，含量1 000×108CFU/g）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（山東蔚藍生物科技有限公司，含量200×108個/g），以上3 種微生物組分，分別按30%、30%、40%混合，取500 g待用。

培養(yǎng)基及試劑：MRS 培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

試驗基地：廣西馬山縣紅益養(yǎng)殖公司；廣西馬山縣喬利鄉(xiāng)、丁當鄉(xiāng)等肉鵝養(yǎng)殖戶。

1.2 儀器與設備

萬分之一電子天平（FA2004，上海舜宇恒平科學儀器有限公司，e=1 mg，d=0.1 mg）、電子天平（WT30002、杭州萬特衡器有限公司，e=0.1 g，d=0.01 g）、電子水分測定儀（DHS-10A，寧波市鄞州華豐電子儀器廠）、生化培養(yǎng)箱（SPX-150，上海力辰邦西儀器科技有限公司）、脂肪測定儀（SZF-06A，上海精隆科學儀器有限公司）、自動定氮儀（K1100，濟南海能儀器有限公司）、消化爐（SH220，濟南海能儀器有限公司）。

1.3 測定指標與方法

試驗主要測定混菌發(fā)酵青貯肉鵝飼料中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)以及粗脂肪、粗蛋白含量等指標。其中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的含量按GB/T 20191—2006《飼料中嗜酸乳桿菌的微生物學檢驗》的方法測定；pH按AACC（2000）的方法測定；水分含量按GB/T 6435—2014《飼料中水分的測定》方法測定；粗脂肪含量按GB/T 6433—2006《飼料粗脂肪的測定》方法測定；粗蛋白含量按GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定》（凱氏定氮法）方法測定。

2 試驗方法

2.1 發(fā)酵工藝

試驗模擬養(yǎng)殖基地或養(yǎng)殖戶生產(chǎn)實際相似的發(fā)酵條件，全株新鮮象草經(jīng)粉碎后，先與4%菌粉混合均勻，按順序添加酒糟、玉米粉，再次混合均勻后，最后添加稻殼混合均勻，拉桿自封袋封裝，壓實或適當抽真空，密封，（36±1）℃發(fā)酵72 h以上。

2.2 試驗設計

2.2.1 單因素選擇及水平確定

根據(jù)前期試驗，通過查閱相關文獻，根據(jù)肉鵝營養(yǎng)需要，結合養(yǎng)殖基地、養(yǎng)殖戶現(xiàn)實情況，以及嗜酸乳桿菌發(fā)酵優(yōu)化條件的相關研究，模擬養(yǎng)殖基地或農(nóng)戶在一定的溫度、一定水分范圍、特定添加量、發(fā)酵青貯飼料與肉鵝配合飼料的成本對比、肉鵝在3～7周齡的營養(yǎng)需要量、嗜酸乳桿菌的發(fā)酵優(yōu)化溫度、水分條件等因素，選擇酒糟、稻殼、玉米粉、象草等4 個因素為自變量因子。

根據(jù)GB/T 20191—2006《飼料中嗜酸乳桿菌的微生物學檢驗》要求，以及嗜酸乳桿菌高密度發(fā)酵條件的研究結果，將發(fā)酵溫度設定為（36±1）℃[5-6]，接種量設定為4%。Box-Behnken 響應面試驗的各因素和水平如表1所示。

表1 青貯肉鵝飼料優(yōu)化設計因素及目標范圍

2.2.2 Box-Behnken響應面試驗設計方法確定

根據(jù)前期試驗結果，不同組分發(fā)酵條件下，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)與組分之間的關系一般呈散點式，符合Design Expert 中的Box-Behnken 方法特征。故試驗選用Design Expert 中的Box-Behnken優(yōu)化方法。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

數(shù)據(jù)首先用Excell 2010進行初步整理，然后再用Design Experts 13.0.1.0響應面（Response surface methodology，RSM）設計中的Ben-henken 設計方法，試驗結果通過方差分析后，進行優(yōu)化。

3 結果與分析

3.1 Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗及結果分析

3.1.1 Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗及結果

設嗜酸乳桿菌活菌數(shù)（R1）為響應值，采用Box-Behnken 響應面優(yōu)化設計原理，考查稻殼（A）、酒糟（B）、玉米粉（C）和象草（D）4 個因素對嗜酸乳桿菌活菌數(shù)（R1）的影響。嗜酸乳桿菌活菌數(shù)響應面優(yōu)試驗設計及結果如表2所示。

表2 嗜酸乳桿菌活菌數(shù)響應面優(yōu)試驗設計及結果

試驗同時監(jiān)測樣品的粗脂肪及粗蛋白含量等兩個主要營養(yǎng)成分變化情況。發(fā)酵前后，各試驗組主要粗脂肪、粗蛋白等兩個主要營養(yǎng)成分指標變化如表3所示。

由表3 可知，與發(fā)酵前相比，各試驗組發(fā)酵后粗脂肪、粗蛋白的含量均有不同程度的增加，其中粗脂肪的增幅度為1.34%～4.33%，粗蛋白的增幅3.50%～5.10%。

表3 各試驗組粗脂肪、粗蛋白檢測結果

3.1.2 嗜酸乳桿菌活菌數(shù)響應面優(yōu)化試驗回歸模型及方差分析

將嗜酸乳桿菌活菌數(shù)（R1）響應面結果進行二次響應面回歸分析，結果如表4所示。

由表4 中可知，項目的模型顯著性檢驗（P=0.003 3＜0.05），表明該模型具有統(tǒng)計學意義。由表4知，其自變量一次項變量B、C、D、二次項AB、D2顯著（P＜0.05）。失擬項（Lack of Fit 的P=0.577 5＞0.05）不顯著，表明所用模型與試驗擬合的差異，對模型是有利的，無失擬因素存在。因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。擬合統(tǒng)計結果如表5、表6所示。

表5 回歸擬合統(tǒng)計

表6 回歸方程系數(shù)表

通過Design Expert 13.0.1.0 軟件進行二次響應面回歸分析，得到多元二次響應面回歸模型。

3.1.3 等高線和三維響應曲面圖分析

各組分的交互作用對嗜乳桿菌活菌數(shù)所形成的等高線及響應面如圖1～圖6所示。

3.2 各組分優(yōu)化及驗證試驗分析

3.2.1 組分響應面優(yōu)化分析

由圖1～圖6所示可以看出，每個響應面三維分析圖和對應的等高線圖分別為當2個變量保持一定水平時，另2個獨立變量之間的交互作用。由圖1可見，A（稻殼）、B（酒糟）的交互作用顯著（P=0.016 8＜0.05），說明它們之間對發(fā)酵后的嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的影響并不是簡單的線性關系；在一定范圍內(nèi)，隨著A（稻殼）、B（酒糟）的增加，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)隨之增加，當達到最大值后，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)有所下降；圖2、表4 所示，也反映了AC（P=0.142 6）、CD（P=0.132 6）的交互作用對嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的影響在一定范圍內(nèi)有所上升，但顯著性不強。

表4 嗜酸乳桿菌活菌數(shù)（R1）響應面試驗結果

在獲得回歸二次項模型和響應面之后，對已回歸的二次項非線性模型方程求極值，可以得到曲面的最大點。對回歸方程求解最大值可得優(yōu)化結果如表7所示。

表7 嗜酸乳桿菌優(yōu)化結果

當A=148.663，B=88.657，C=28.448，D=280.182，即當?shù)練?48.663 g，干白酒糟為88.657 g，玉米粉為28.448 g，象草為280.182 g，在特定的溫度條件下（36±1）℃，指定的添加量（4%），經(jīng)過混合發(fā)酵72 h以上，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)預測值為44.92×107CFU/g。

3.2.2 驗證試驗

按上述優(yōu)化后的組分，每組3 個平行，接種量為4%，混合均勻后壓實，密封，（36±1）℃發(fā)酵72 h后檢驗，得到嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)為44.82×107CFU/g，與預測值的相對誤差為0.22%，符合規(guī)定。

4 討論

固態(tài)混菌發(fā)酵青貯飼料是一個復雜的過程。發(fā)酵過程中，微生物生長所需要的碳源、氮源是重要的條件。本試驗反映了組分中稻殼、酒糟、玉米粉、香草等各組分對發(fā)酵產(chǎn)品中嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的影響程度，其可能的影響機理包括以下幾種。

①研究表明，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母在嗜酸乳桿菌發(fā)酵中，存在復雜的影響關系[7-8]。在一定條件下改變枯草芽孢桿菌、釀酒酵母的比例會引起嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的變化，但本試驗所接種的復合菌中，嗜酸乳桿菌、釀酒酵母的含量已確定。在真空或密封袋裝狀態(tài)下，枯草芽孢桿菌繁殖過程會促進嗜酸乳桿菌的擴繁，同時，一定條件下，釀酒酵母也會促進嗜酸乳桿菌的擴繁，但只要不改變接種量，一般情況下不會影響總體的活菌數(shù)，其影響機理有待進一步研究。

②本試驗中，引起嗜酸乳桿菌大量擴繁的碳源和氮源來源，主要考慮來自3個方面，一是酒糟，二是玉米粉，三是象草。研究表明，干白酒糟主要是以高粱、玉米和大麥等谷物為主要原料，以谷殼為發(fā)酵填充通過固態(tài)發(fā)酵和蒸餾形成[9-10]，干白酒糟的主要成分為粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、淀粉和多糖[11]；玉米粉是青貯飼料發(fā)酵的一般營養(yǎng)物質(zhì)，為青貯飼料的發(fā)酵提供氮源和碳源；而新鮮的象草，具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，向白菊等[12]研究表明，新鮮象草的含糖量大于4%。

③本試驗中，沒有對水分進行優(yōu)化處理，一方面考慮在實際發(fā)酵過程中，養(yǎng)殖基地對水分的控制并不精準；另一方面，新鮮象草的含水量高達75%～80%。本試驗中發(fā)酵所需要的水分含量，可直接由鮮象草本身提供，不需要額外添加水分；有關水分的另一不穩(wěn)定因素在于新收割的象草，需要盡快粉碎發(fā)酵，以免水分和糖分損失，影響發(fā)酵效果。

④本試驗對混合工藝有一定的要求，混合是否均勻、粉碎粒度大小等，均影響發(fā)酵的時間和品質(zhì)。前期試驗顯示，先將菌粉與粉碎后的鮮象草進行混合后，再按順序混合其他原料，一方面保證菌粉分布均勻，另一方面，可讓接種的菌粉快速繁殖，進一步提高發(fā)酵質(zhì)量。

⑤各組樣品在發(fā)酵前后，其主要營養(yǎng)指標（粗脂肪、粗蛋白）等均有一定程度的增加，但增加幅度均不大，其可能原因在于有益菌在發(fā)酵擴繁過程中，能產(chǎn)生少量的營養(yǎng)物質(zhì)，具體機理有待進一步研究。

5 結論

模擬肉鵝養(yǎng)殖基地或養(yǎng)殖戶實際生產(chǎn)條件，采用響應面法優(yōu)化設計，探索指定添加量、指定發(fā)酵溫度條件下，篩選出以稻殼、酒糟、玉米粉、象草等因素中對嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的顯著影響因素，并通過響應面優(yōu)化法，找到最優(yōu)組成成分。優(yōu)化后的組分為稻殼為148.663 g，干白酒糟為88.657 g，玉米粉為28.448 g，象草為280.182 g，接種量為4%，發(fā)酵溫度為（36±1）℃，發(fā)酵72 h后，可得嗜酸乳桿菌的最大活菌數(shù)為44.92×107CFU/g。為養(yǎng)殖基地或養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中進行簡易快速發(fā)酵肉鵝青貯飼料提供參考依據(jù)。

綜上所述，本研究可為肉鵝養(yǎng)殖戶利用象草等地緣性飼料進行青貯發(fā)酵提供參考依據(jù)和參數(shù)借鑒。