沙棗葉提取物體外抗菌、抗氧化活性研究

■德勒黑 楊 斌 薩茹麗* 錢(qián)琳娜 陳樂(lè)祥 吳蘇日古嘎

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3.通遼市畜牧業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古通遼 028000）

隨著現(xiàn)代科技、醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)了沙棗葉具有清熱解毒、抗菌消炎、活血化瘀的藥用價(jià)值。目前，世界上一共有90多種沙棗，廣泛生長(zhǎng)在亞洲、歐洲和北美地區(qū)[1]。沙棗樹(shù)也叫桂香柳，生長(zhǎng)于內(nèi)蒙古自治區(qū)西部沙漠里，是一種抗旱、抗寒能力極強(qiáng)的沙生植物。在現(xiàn)代園林綠化中沙棗也具有一定的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益，可用于防風(fēng)固林、美化環(huán)境和防止侵蝕[2]。許多植物的果實(shí)、花、種子和葉子中含有酚類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物等天然來(lái)源的活性化合物，由于它們能夠釋放電子和清除自由基，因此具有抗氧化活性[1]。有關(guān)研究報(bào)道，沙棗水提物可有效降低四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠的血糖水平[3]。近年來(lái)，由于抗生素耐藥微生物引起的疾病發(fā)生率增加，利用具有天然抗菌活性的藥用植物的研究呈高增長(zhǎng)勢(shì)頭[4]。沙棗果實(shí)提取物中含有類(lèi)黃酮化合物、多糖、谷甾醇、萜類(lèi)、香豆素、酚羧酸、氨基酸、皂苷、類(lèi)胡蘿卜素、維生素和單寧[5-7]。Liu 等[8]發(fā)現(xiàn)金絲小棗酚酸類(lèi)化合物的主要成分為原兒茶酸、兒茶酚、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和對(duì)香豆酸，其含量分別為17.02、5.87、7.46、2.95、1.06 mg/g。研究表明，攝入具有抗氧化特性的膳食抗氧化劑、水果或蔬菜，可提高生活質(zhì)量，延緩衰老及降低退行性疾病的發(fā)生[9]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于植物提取物抗菌及抗氧化等方面的研究較多，但沙棗葉及其提取物的抗菌、抗氧化研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)沙棗葉提取物的體外抗氧化以及抗菌作用進(jìn)行研究，綜合評(píng)價(jià)沙棗葉提取物體外抗菌、抗氧化活性，以期為沙棗葉的綜合開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)際應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沙棗葉：采摘自?xún)?nèi)蒙古呼和浩特市托克托縣永勝域村。

菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）、白葡萄球菌（Staphylococcus albus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）、馬鏈球菌（Stretpococcus equi），由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科院獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室提供。濾菌膜、移液器、移液管、一次性注射器、牛津杯（45～50個(gè)）、小燒杯50 mL×10個(gè)。

1.2 試驗(yàn)試劑及儀器

試劑：總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（ABTS法）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）清除能力試劑盒、羥自由基測(cè)定試劑盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子（·O2-）試劑盒，以上所有試劑盒均購(gòu)買(mǎi)自南京建成生物工程研究所有限公司。

藥物：生理鹽水、血清（孕馬血清）、青霉素、氯化鈉（NaCl）（天津市福晨化學(xué)試劑有限公司）；胰蛋白胨Tryptone（英國(guó)）、酵母提取物Yeast Extract（法國(guó)）、無(wú)水乙醇（天津市登科化學(xué)試劑有限公司）、瓊脂Agar（英國(guó)）等。

試驗(yàn)儀器：全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BIOTEK 公司的Synergy-HT型）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）、移液槍?zhuān)ù簖堘t(yī)療設(shè)備有限公司）、96孔酶標(biāo)板、循環(huán)水式真空泵、全溫雙層振蕩培養(yǎng)箱（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）、SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇州廣源凈化工程有限公司）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

沙棗葉水提取物的制備：首先將沙棗葉低溫烘干，之后進(jìn)行粉碎處理，然后將粉碎的沙棗葉分裝為300 g/包，每包鍋中加入5～10倍純化水煮3次，每次大火煮1 h，再將經(jīng)煮3 次的沙棗葉水提物合并過(guò)濾濃縮至300 mL，得濃度為1 g/mL 原液。用純化水將沙棗葉水提物原液（1 g/mL）依次稀釋為500、333、250、200、100、50、20、10 mg/mL濃度的待測(cè)液。

沙棗葉乙醇提取物的制備：稱(chēng)取經(jīng)粉碎沙棗葉120 g置于3 000 mL燒杯中，加入2 400 mL 70%乙醇（720 mL純化水+1 680 mL無(wú)水乙醇）混勻后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)60 ℃下微搖2 h，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至120 mL，得濃度為1 g/mL的沙棗葉醇提物原液，原液-20 ℃冰箱保存。臨用前使用70%無(wú)水乙醇將沙棗葉醇提物原液（1 g/mL）稀釋成濃度為500、333、250、200、100、50、20、10 mg/mL的待測(cè)液。

1.3.2 抑菌活性的測(cè)定

抑菌活性的強(qiáng)弱通過(guò)抑菌圈直徑的大小表示，直徑越大抑菌能力越強(qiáng)，反之越弱。先將7～8 mL 固體培養(yǎng)基（LA）均勻倒入培養(yǎng)皿中，凝固后用鑷子將無(wú)菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，在水平放置的平皿中放置3只牛津杯，其間距相等，在小燒杯中倒入30 mL固體培養(yǎng)基再接種200 μL 菌懸液并搖晃均勻，再倒進(jìn)培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固后，取出放置的牛津杯，吸取試驗(yàn)藥物溶液150 μL 至牛津杯孔中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16～18 h。青霉素作為陽(yáng)性對(duì)照組，無(wú)水乙醇為空白對(duì)照組，16～18 h后觀察是否有抑菌效果，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑（mm）。測(cè)量3個(gè)抑菌圈直徑，結(jié)果以3次的平均值進(jìn)行計(jì)算。抑菌效果判定：抑菌圈直徑≤8 mm為不敏感；抑菌圈直徑8～13 mm為低度敏感；抑菌圈直徑13～19 mm為中度敏感；抑菌圈直徑＞19 mm為高度敏感[10]；“-”為無(wú)抑菌活性。

1.3.3 體外抗氧化活性的測(cè)定

沙棗葉提取物體外總抗氧化能力（T-AOC）、清除DPPH自由基的能力以及羥自由基清除能力和抑制超氧陰離子自由基的測(cè)定方法按照南京建成生物工程研究所有限公司所提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Excel制作成表格初步作圖整理后，采用SAS9.2 軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05 視為差異顯著，P＞0.05 視為差異不顯著，數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棗葉提取物體外抑菌活性（見(jiàn)表1）

從表1數(shù)據(jù)可知，在試驗(yàn)中1 g/mL 濃度沙棗葉醇提物對(duì)大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、馬鏈球菌等5種菌的抑菌能力均為中度敏感（抑菌圈直徑13～19 mm），對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌為低度敏感（抑菌圈直徑8～13 mm）。500 mg/mL濃度沙棗葉醇提物對(duì)大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌中度敏感，對(duì)枯草芽孢桿菌和馬鏈球菌為低度敏感。333 mg/mL濃度沙棗葉醇提物對(duì)大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌為中度敏感，對(duì)枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌及馬鏈球菌為低度敏感。250 mg/mL濃度沙棗葉醇提物對(duì)大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌及金黃色葡萄球菌為中度敏感，對(duì)變形桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌及馬鏈球菌為低度敏感。200 mg/mL 濃度的沙棗葉醇提物對(duì)大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌及變形桿菌為低度敏感，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌及馬鏈球菌為不敏感（抑菌圈直徑≤8 mm）。100、50、20、10 mg/mL 濃度的沙棗葉醇提物對(duì)上述8種菌均為不敏感或無(wú)抑菌活性。沙棗葉水提物各濃度樣品對(duì)上述8種菌均為不敏感（抑菌圈直徑≤8 mm）或無(wú)抑菌活性。

表1 不同濃度沙棗葉提取物對(duì)8種菌的抑菌圈直徑(mm)

2.2 沙棗葉提取物體外總抗氧化能力（見(jiàn)表2）

表2 沙棗葉提取物總抗氧化能力

從表2可知，沙棗葉提取物總抗氧化能力對(duì)比空白對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），沙棗葉水提物與醇提物之間差異不顯著（P＞0.05）。沙棗葉水提物的總抗氧化能力高于空白對(duì)照組和沙棗葉醇提物。

2.3 沙棗葉提取物體外清除DPPH自由基的能力（見(jiàn)表3）

表3 沙棗葉提取物DPPH自由基清除能力(μg Tro lox/g)

從表3 可知，沙棗葉提取物濃度由原液（1 g/mL）至測(cè)定100 倍（10 mg/mL）稀釋濃度，DPPH 自由基清除能力呈下降趨勢(shì)。沙棗葉水提物1 g/mL 組和500 mg/mL 組清除DPPH 自由基能力高于醇提物1 g/mL 組和500 mg/mL 組，二者之間差異顯著（P＜0.05）。沙棗葉水提物、醇提物原液（1 g/mL）和2 倍（500 mg/mL）濃度的清除能力高于其他稀釋倍數(shù)的清除能力，沙棗葉提取物原液（1 g/mL）的清除能力顯著其他測(cè)定組（P＜0.05），隨著測(cè)定樣品稀釋濃度的下降，清除能力呈不同程度降低。

2.4 沙棗葉提取物對(duì)羥自由基的抑制作用（見(jiàn)圖1）

圖1 可以看出，沙棗葉醇提物原液（1 g/mL）到100 mg/mL 濃度的抑制率具有緩慢上升趨勢(shì)，到達(dá)100 mg/mL濃度后迅速下降。沙棗葉水提物從1 g/mL濃度到200 mg/mL 濃度抑制率迅速上升，200 mg/mL開(kāi)始其上升趨勢(shì)平緩，且其抑制率隨其濃度的下降而提高。在100 mg/mL濃度以下，沙棗葉醇提物對(duì)抑制羥自由基能力明顯弱于水提物。

2.5 沙棗葉提取物對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用（見(jiàn)圖2）

如圖2 所示，沙棗葉醇提物隨著其濃度降低，其抑制率也跟著緩慢下降，從不同提取物及不同濃度組間的比較可以看出，醇提1 g/mL、500 mg/mL濃度的抑制率顯著高于其他濃度組（P＜0.05）。在不同提取物同濃度比較時(shí)，100 mg/mL、50 mg/mL、20 mg/mL 濃度抑制率差異不顯著（P＞0.05）。與水提物各濃度組相比，醇提物各濃度抑制率稍強(qiáng)，醇提物抑制率隨著濃度下降更為陡峭。沙棗葉醇提物對(duì)超氧陰離子自由基具有明顯抑制能力且表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

3.1 沙棗葉提取物體外抗菌活性

近年來(lái)，隨著飼料禁抗時(shí)代的到來(lái)，將尋找天然抗生素替代品的研究逐步推向了高潮。近些年對(duì)于天然植物提取物的抗菌活性研究非常廣泛，也取得了一定的研究成果。家畜日糧中添加適量的植物提取物可以提高動(dòng)物免疫力[11]。大量的研究表明，天然植物提取物中的生物活性成分具有抗菌功效，在謝永華等[12]欖綠粗葉木水提物體外抗菌效果的初步探討試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)欖綠粗葉木水提物對(duì)金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌高度敏感，對(duì)枯草芽孢桿菌中度敏感，對(duì)銅綠假單胞菌低敏感，而對(duì)大腸桿菌無(wú)抑制效果。Singh 等[13]研究發(fā)現(xiàn)粗莖老鸛草根的乙醇提物和乙醚提物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性病原體均具有顯著的抗菌作用。Tran 等[14]研究發(fā)現(xiàn)金銀花和四角楓甲醇提取物對(duì)大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和無(wú)乳鏈球菌3 種菌具有顯著的抗菌活性。吳小詩(shī)等[15]的訶子水提物體內(nèi)外抗菌作用及止癢效果研究試驗(yàn)結(jié)果表明，水提物對(duì)馬拉色菌感染模型具有良好的治療作用，有望成為抗菌止癢且溫和的去屑止癢產(chǎn)品的有效活性成分。沙棗作為西北部地區(qū)特有的沙生植物，其抗菌作用也逐漸被人們發(fā)覺(jué)。本次試驗(yàn)中1 g/mL、500 mg/mL、333 mg/mL、250 mL、200 mL 濃度沙棗葉醇提物對(duì)大腸桿菌、白葡萄球菌、綠膿桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌具有一定的抗菌作用，其他濃度沙棗葉醇提物對(duì)上述8 種菌不敏感或無(wú)抗菌活性，其抗菌活性與其醇提物濃度和受試菌菌種類(lèi)型有關(guān)。沙棗葉水提物各濃度樣品對(duì)上述8 種菌均為不敏感或無(wú)抑菌活性。買(mǎi)買(mǎi)提吐?tīng)枴た肆δ镜萚16]選用新疆沙棗水提液和濃縮物研究其抗菌活性，得出沙棗水提取物對(duì)受試菌無(wú)顯著抗菌活性，對(duì)福式痢疾桿菌有微弱的抗菌效果。從結(jié)果中可以看出，隨著水提物濃度的降低，其對(duì)一些受試菌的抗菌效果逐漸提高。因此推斷沙棗葉水提物的抗菌活性可能與其受試菌種及濃度有關(guān)，后續(xù)可以從沙棗葉其他活性成分作為研究對(duì)象更加深入地研究其抗菌活性。

3.2 沙棗葉提取物體外抗氧化活性

畜禽機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的自由基會(huì)對(duì)其細(xì)胞功能有所損壞，從而導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能下降。植物提取物可清除有害自由基，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，有效預(yù)防氧化應(yīng)激造成的機(jī)體損傷[17]?？寡趸瘎┑幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)多樣，作用機(jī)制各不相同，其關(guān)鍵機(jī)制是抗氧化劑與自由基反應(yīng)形成相對(duì)穩(wěn)定的非活性產(chǎn)物[18]。Hamidpour 等[19]研究沙棗乙酸乙酯提取物的抗氧化和抗腫瘤活性，隨著各樣品濃度和極性水平的增加，其抗氧化能力逐漸提高了。馮濤等[20]使用超聲波和離心結(jié)合的方法，以沙棗果實(shí)為材料，用70%乙醇提取的沙棗果肉對(duì)羥基自由基和過(guò)氧化物自由基的清除效果最好，其中羥基自由基的清除率更是高于河北棗和維生素E。本試驗(yàn)中沙棗葉醇提物清除羥自由基能力及抑制超氧陰離子能力的結(jié)果與其一致，因此推斷，沙棗葉提取物體外抗氧化活性與其濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)沙棗葉乙醇提取物可通過(guò)調(diào)整體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)，降低白細(xì)胞介素-4（IL-4）及免疫球蛋白E（IgE）的含量、升高γ干擾素（IFN-γ）的含量，調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞/Th2 細(xì)胞免疫平衡而改善哮喘模型小鼠氣道炎癥[21]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度沙棗葉醇提物抗氧化活性良好，總抗氧化能力及清除DPPH自由基能力沙棗葉水提物各濃度略高于醇提物，但在清除羥自由基能力及抑制超氧陰離子能力測(cè)定結(jié)果中沙棗葉醇提物顯著高于水提物。在后期的研究中需向沙棗葉醇提物方面進(jìn)行更加深入的研究，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)沙棗葉生物活性功能，有利于其飼料添加劑潛力的開(kāi)發(fā)，為現(xiàn)代畜牧業(yè)做出新貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

①沙棗葉醇提物具有良好的抗菌活性，且其抗菌活性與其醇提物濃度和受試菌菌種類(lèi)型有關(guān)，而沙棗葉水提物均無(wú)顯著的抗菌活性。

②沙棗葉提取物具有一定的總還原能力、清除羥自由基、清除DPPH有機(jī)自由基能力以及抑制超氧陰離子自由基能力，其清除能力與其濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。