玉米赤霉烯酮對海南文昌種母雞繁殖性能及其后代發(fā)育的影響

■梁姝婕 羅平成 王偉唯 曹慶云 葉 慧 張常明 馮定遠(yuǎn) 左建軍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣東廣州 510642）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA），是一種由鐮刀菌屬（主要是禾谷鐮刀菌）產(chǎn)生的具有雌激素活性的非甾醇類毒素[1-2]，在霉變的谷類作物（如玉米、大麥、小麥）中廣泛存在[3-4]。ZEA主要作用于動物的生殖系統(tǒng)，具有很強的生殖毒性和免疫毒性，可導(dǎo)致后代畸形，對豬的影響最為嚴(yán)重[5]。ZEA 可通過食用被污染的飼料進入家禽體內(nèi)，蛋雞中毒表現(xiàn)為雞冠腫大、卵巢萎縮、產(chǎn)蛋率下降和腹水癥[6-7]。張偉倫等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA影響蛋雞的產(chǎn)蛋率、雞蛋破損率和畸形率，并損害卵巢正常的組織結(jié)構(gòu)，造成卵母細(xì)胞萎縮、卵巢出血等現(xiàn)象。ZEA還可引起蛋雞肝細(xì)胞變性和壞死，導(dǎo)致肝臟中蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生障礙[9]。目前ZEA對蛋雞生產(chǎn)性能的影響已有相關(guān)的研究[8,10]，但是關(guān)于ZEA對種母雞繁殖性能及其后代影響的研究較少。因此，本試驗以海南文昌種母雞為研究對象，在基礎(chǔ)飼糧中添加不同劑量ZEA，研究ZEA對種母雞以及子代的毒性作用，以期為種雞養(yǎng)殖提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ZEA：純度≥99%，購自青島普瑞邦生物工程有限公司。

1.2 試驗設(shè)計及分組

試驗選取產(chǎn)蛋率、體重、健康狀況相近的30周齡海南文昌種母雞共160 羽，采用單因子分組設(shè)計，隨機分成4 組，每組4 個重復(fù)，每個重復(fù)10 羽。其中空白對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加250、500 μg/kg和750 μg/kg ZEA。

1.3 試驗飼糧

試驗日糧配方參考中國肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 33—2004）和試驗雞場文昌雞營養(yǎng)需要企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)配制，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及其營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗地點在恩平基龍有限公司的半開放式棚舍進行。在試驗前將待選的母雞集中飼養(yǎng)7 d，根據(jù)產(chǎn)蛋率進行分組調(diào)整，調(diào)整到每組產(chǎn)蛋率基本一致。預(yù)試期為7 d，統(tǒng)一飼喂一種商品全價飼料，正試期為36 d，各組飼喂相應(yīng)的飼糧。試驗期間按照公司常規(guī)管理辦法對種母雞進行管理，每天限飼90 g/只，自由飲水。

1.5 樣品采集與指標(biāo)測定

1.5.1 種母雞

1.5.1.1 產(chǎn)蛋率與不合格種蛋率

從正式試驗開始，每天記錄產(chǎn)蛋數(shù)，并計算產(chǎn)蛋率和不合格種蛋率。

產(chǎn)蛋率（%）=產(chǎn)蛋數(shù)/產(chǎn)蛋母雞數(shù)量×100

不合格種蛋率（%）=不合格種蛋/總產(chǎn)蛋數(shù)×100

1.5.1.2 蛋品質(zhì)

在正式試驗第36天，每個重復(fù)收集3個蛋，每組共12個，進行蛋形指數(shù)、蛋黃顏色、蛋殼強度、蛋殼厚度、哈夫單位的測定。蛋形指數(shù)是使用游標(biāo)卡尺測量蛋的長徑與短徑后計算得出，蛋黃顏色由比色卡對比得出，分別使用蛋殼強度計和螺旋測微器測定蛋殼強度和厚度。

蛋形指數(shù)=長徑/短徑

哈夫單位=100lg（H-1.7W0.37+7.6）

式中：H——蛋白高度（mm）；

W——蛋重（g）。

1.5.1.3 血清性激素水平

在正式試驗第36 天，每個重復(fù)選取3只種母雞，每組共12只，采集全血后4 000 r/min 離心20 min，收集并分裝血清，-20 ℃下保存，用于測定血清雌二醇（E2）、促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）的濃度。

1.5.1.4 卵泡發(fā)育

在正式試驗第36天，每個重復(fù)選取3只種母雞，每組共12只，屠宰后統(tǒng)計其卵泡數(shù)量，計算卵泡閉鎖率。

卵泡閉鎖率（%）=閉鎖卵泡數(shù)/小于等于4 mm卵泡總數(shù)×100

1.5.1.5 肝臟指數(shù)

在正式試驗期第36天，每個重復(fù)選取3只種母雞，每組共12只，屠宰后稱量其肝臟重，計算肝臟指數(shù)。

器官指數(shù)（g/kg）=器官重/屠體重

1.5.1.6 腸道形態(tài)

在正式試驗第36 天，每個重復(fù)選取1 只種母雞，屠宰后取空腸前段1～2 cm 組織保存在4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后制作切片，進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosinstaining，H.E.）染色，顯微鏡下觀察、測量其絨毛高度、隱窩深度，計算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.5.1.7 孵化性能

在正式試驗期第27、30、33 天時，每個重復(fù)選20 枚蛋，每組共80 枚，進行孵化，并在對應(yīng)的出苗日進行統(tǒng)計，計算受精率、孵化率和健雛率。

1.5.2 子代小雞

選取正式試驗期第33～36 天的種蛋孵化的雌性小雞，待30日齡小雞階段結(jié)束后，每個重復(fù)選取2只，每組共8只，稱重后屠宰，剖取心臟、脾臟、肝臟、腎臟和法氏囊進行稱重，計算器官指數(shù)。取空腸前段1～2 cm 組織保存在4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后制作切片，進行H.E.染色，顯微鏡下觀察、測量其絨毛高度、隱窩深度，計算絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析（oneway ANOVA），在差異顯著的基礎(chǔ)上采用LSD 方法進行多重比較以及線性（linear）和二次曲線（quadratic）趨勢分析，結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著，其中0.05＜P＜0.10表示具有差異趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加ZEA對種母雞繁殖性能與臟器性狀的影響

2.1.1 飼糧添加ZEA 對種母雞產(chǎn)蛋性能的影響（見表2）

由表2 可知，添加不同劑量ZEA，在數(shù)值上降低了產(chǎn)蛋率，但無顯著差異（P＞0.05），750 μg/kg 組的不合格種蛋率在數(shù)值上高于對照組和250、500 μg/kg組（P＞0.05）。

表2 飼糧添加ZEA對種母雞產(chǎn)蛋性能的影響（%）

2.1.2 飼糧添加ZEA對種母雞蛋品質(zhì)的影響（見表3）

表3 飼糧添加ZEA對蛋品質(zhì)的影響

由表3 可知，不同劑量ZEA 對種蛋的蛋黃顏色、哈夫單位、蛋形指數(shù)均無顯著影響（P＞0.05）。與對照組相比，250 μg/kg組種蛋的蛋殼強度有升高的趨勢，但無顯著差異（P=0.060），隨著ZEA劑量的提高，種蛋的蛋殼強度呈二次曲線降低（P=0.030）。500 μg/kg 組和750 μg/kg 組種蛋的蛋殼厚度顯著低于250 μg/kg組（P＜0.05）。

2.1.3 飼糧添加ZEA對種蛋孵化性能的影響（見表4）

表4 飼糧添加ZEA對種蛋孵化性能的影響（%）

由表4 可知，不同劑量ZEA 處理后，種蛋的受精率和孵化率在數(shù)值上低于對照組，但無顯著差異（P＞0.05）。試驗組的健雛率與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。

2.1.4 飼糧添加ZEA 對種母雞肝臟指數(shù)的影響（見表5）

表5 飼糧添加ZEA對種母雞肝臟指數(shù)的影響(g/kg)

由表5可知，不同劑量ZEA處理后種母雞的肝臟指數(shù)在數(shù)值上有所降低，但無顯著差異（P＞0.05）。

2.1.5 飼糧添加ZEA 對種母雞空腸形態(tài)的影響（見表6）

表6 飼糧添加ZEA對種母雞空腸形態(tài)的影響

由表6可知，不同劑量ZEA對種母雞空腸的絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度/隱窩深度比值均無顯著影響（P＞0.05）。

2.1.6 飼糧添加ZEA 對種母雞血清性激素水平的影響（見表7）

由表7 可知，不同劑量ZEA 對種母雞血清中E2、FSH、LH濃度均無顯著影響（P＞0.05）。

表7 飼糧添加ZEA對種母雞血清性激素濃度的影響（IU/L）

2.1.7 飼糧添加ZEA對種母雞卵泡閉鎖率的影響（見表8）

由表8 可知，與對照組相比，不同劑量ZEA 處理后種母雞的卵泡閉鎖率在數(shù)值上均有所升高，但無顯著差異（P＞0.05）。

表8 飼糧添加ZEA對種母雞卵泡閉鎖率的影響（%）

2.2 飼糧添加ZEA對子代小雞體重和臟器性狀的影響

2.2.1 飼糧添加ZEA對子代小雞體重的影響（見表9）

由表9 可知，與對照組相比，不同劑量ZEA 對種母雞子代30日齡時的體重均無顯著影響（P＞0.05）。

表9 飼糧添加ZEA對子代小雞體重的影響（g）

2.2.2 飼糧添加ZEA對子代30日齡小雞器官指數(shù)的影響（見表10）

由表10可知，與對照組相比，不同劑量ZEA處理后子代小雞的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)在數(shù)值上有所升高，心臟指數(shù)在數(shù)值上有所降低，但無顯著差異（P＞0.05）。與對照組相比，不同劑量ZEA 處理對子代法氏囊指數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。與對照組相比，250 μg/kg 組顯著降低了子代小雞的脾臟指數(shù)（P＜0.05）。500 μg/kg 組和750 μg/kg 組子代小雞的脾臟指數(shù)均顯著高于250 μg/kg組（P＜0.05）。

表10 飼糧添加ZEA對子代小雞器官指數(shù)的影響（g/kg）

2.2.3 飼糧添加ZEA對子代空腸形態(tài)的影響（見表11）

由表11 可知，各處理組之間空腸的絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度/隱窩深度值均無顯著差異（P＞0.05）。

表11 飼糧添加ZEA對子代小雞空腸形態(tài)的影響

3 討論

3.1 飼糧添加ZEA對種母雞繁殖性能與臟器性狀的影響

3.1.1 飼糧添加ZEA對種母雞生產(chǎn)性能的影響

在有關(guān)ZEA的研究中，對于哺乳動物的研究相對較多。關(guān)于單一ZEA 污染對種母雞生產(chǎn)性能造成影響的報道較少，其中大多數(shù)相關(guān)研究表明ZEA對種母雞的生產(chǎn)性能沒有顯著影響。

Allen 等[11]研究中，分別以純品ZEA 添加量為0、10、25、50、100、200、400、800 mg/kg 的飼糧飼喂30 周齡白萊航產(chǎn)蛋種母雞，發(fā)現(xiàn)各濃度ZEA的處理對種母雞的產(chǎn)蛋性能、雞蛋尺寸、飼料消耗量、體重、孵化性能、孵化率、子代前3 周生產(chǎn)性能、蛋殼厚度、蛋哈夫單位均沒有顯著影響。Branton等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，用含有298 μg/kg DON 以及1 102 μg/kg ZEA 的混合污染高粱飼糧飼喂23周齡白來航母雞24周，在試驗期間，沒有對母雞產(chǎn)蛋率造成顯著影響。ZEA 可降低白來航母雞的蛋比重和蛋殼厚度[13]。張偉倫等[8]發(fā)現(xiàn)ZEA影響270 日齡海蘭粉蛋雞的產(chǎn)蛋率，1 mg/kg ZEA 增加雞蛋的破損率和畸形率，但是2 mg/kg ZEA 反而降低雞蛋破損率和畸形率。

在本研究中，飼糧中添加不同劑量ZEA在數(shù)值上降低了種母雞的產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率，對蛋品質(zhì)中的哈夫單位、蛋形指數(shù)、蛋黃顏色等均沒有產(chǎn)生顯著影響，但是健雛率有所增加，與張偉倫等[8]研究相似。蛋殼強度與蛋殼厚度方面的趨勢比較一致，與對照組相比，250 μg/kg 組種蛋的蛋殼強度有升高的趨勢，隨著ZEA 劑量的提高，種蛋的蛋殼強度有降低的趨勢。與對照組相比，250 μg/kg組種蛋的蛋殼厚度有升高的趨勢，500 μg/kg 組和750 μg/kg 組種蛋的蛋殼厚度顯著低于250 μg/kg組。

本研究的有關(guān)結(jié)果與前人的試驗結(jié)果較為一致，但添加250 μg/kg ZEA在數(shù)值上提高了種蛋的蛋殼強度和蛋殼厚度，需要做進一步的研究。關(guān)于750 μg/kg組蛋殼強度相對較低，這可能提示ZEA對于種母雞輸卵管的子宮部位的鈣代謝相關(guān)機制有一定的影響，但是相關(guān)機制有待進一步的研究。

3.1.2 飼糧添加ZEA 對種母雞臟器及腸道形態(tài)的影響

在關(guān)于ZEA 對非繁殖系統(tǒng)的臟器以及腸道形態(tài)影響方面，鮮見ZEA對種母雞臟器有顯著影響的研究報道，現(xiàn)有的報道對ZEA 在這方面的作用還存在爭議，對于腸道形態(tài)方面鮮有報道。

Chi 等[14]選取1 日齡肉雞（Indian River?，公母對半）分成6 組，在飼糧中分別添加0、10、25、50、100、200、400、800 mg/kg純品ZEA，飼喂至21日齡，結(jié)果表明，各組間肉雞的器官指數(shù)（肝臟、心臟、脾臟、睪丸、輸卵管、卵巢、法氏囊）均沒有顯著差異。但是朱碧波等[15]關(guān)于ZEA 對肉雞肝臟氧化損傷方面的研究中，結(jié)果表明飼糧中添加2 mg/kg ZEA 對肉雞肝臟具有氧化損傷的作用。ZEA 可嚴(yán)重?fù)p傷270 日齡海蘭粉蛋雞的肝臟結(jié)構(gòu)，引起肝細(xì)胞變性、壞死和纖維化，并出現(xiàn)相應(yīng)的肝功能下降[9]。楊美璐[16]研究發(fā)現(xiàn)1 500～3 500 μg/kg ZEA 不影響育成期蛋雞肝臟、腎臟及生殖器官發(fā)育指數(shù)，但對其組織形態(tài)學(xué)有一定的病理影響。這些研究說明ZEA 可引起肝臟氧化應(yīng)激而造成損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生炎癥[17-18]。在本研究中，不同劑量ZEA處理在數(shù)值上降低了種母雞的肝臟指數(shù)，與前人的研究結(jié)果一致，具體的損傷機制需要從分子生物學(xué)層面做進一步的研究。

在前人的研究中，未見ZEA對雞腸道健康的相關(guān)負(fù)面報道。在本試驗中，不同劑量ZEA對種母雞的空腸形態(tài)沒有顯著影響，可能與家禽較強的腸肝循環(huán)和排泄能力、毒素在臟器中的殘留時間短和殘留量少以及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物毒性低有關(guān)[19]。

3.1.3 飼糧添加ZEA 對種母雞繁殖系統(tǒng)和性激素水平的影響

ZEA可對動物的生殖系統(tǒng)造成一定的負(fù)面影響，但是關(guān)于種母雞血清性激素、卵泡閉鎖率的相關(guān)報道相對較少。

Chi 等[14]選取1 日齡肉雞（Indian River?，公母對半）分成6 組，在飼糧中分別添加0、10、25、50、100、200、400、800 mg/kg純品ZEA，飼喂至21日齡，結(jié)果表明，與其他各組相比，400 mg/kg和800 mg/kg組的白細(xì)胞總數(shù)因為總淋巴細(xì)胞的減少而顯著減少；各組間紅細(xì)胞、血紅蛋白含量以及各項血清生化指標(biāo)（鈣含量、磷含量、總蛋白濃度、堿性磷酸酶濃度、膽固醇含量）沒有顯著差異。楊美璐[16]研究發(fā)現(xiàn)1 500～3 500 μg/kg ZEA顯著影響育成期蛋雞的血液生理生化、血清抗氧化和血清激素水平，并隨時間的增長，毒性逐漸積累。凌阿茹等[10]研究發(fā)現(xiàn)ZEA 劑量高于5 mg/kg 時，損傷34 周齡海蘭褐蛋雞的卵巢機能，干擾性激素分泌。張偉倫等[8]發(fā)現(xiàn)ZEA可造成卵巢充血、出血、卵母細(xì)胞萎縮、卵泡間質(zhì)細(xì)胞群增多并水腫的現(xiàn)象。

本試驗的有關(guān)研究表明不同劑量ZEA 對種母雞血清中E2、FSH、LH 濃度均沒有顯著影響。關(guān)于卵泡閉鎖率的結(jié)果顯示，不同劑量ZEA處理后種母雞的卵泡閉鎖率在數(shù)值上高于對照組。本試驗關(guān)于種母雞的研究沒有找到直接的參考依據(jù)，前人有關(guān)哺乳動物的研究表明，ZEA 具有刺激機體產(chǎn)生雌二醇的作用[20-22]，但是在本研究中該作用未能體現(xiàn)出來，ZEA及其代謝產(chǎn)物的雌激素活性在本研究中并未起到對機體本身這三種性激素產(chǎn)生影響的作用。

3.2 飼糧添加ZEA對種母雞后代生長發(fā)育的影響

鮮見ZEA對種母雞后代生長發(fā)育情況的研究，但是有少量研究實驗室動物的相關(guān)報道。高鑫等[23]關(guān)于ZEA對大鼠生殖發(fā)育跨代毒性的研究表明，在日糧中添加5～20 mg/kg ZEA 會導(dǎo)致妊娠雌性大鼠采食量和體重的顯著降低，但是產(chǎn)仔數(shù)沒有顯著差異，其中20 mg/kg ZEA會導(dǎo)致產(chǎn)仔存活率顯著降低，也會導(dǎo)致其后代雌性小鼠的體重顯著下降。Xu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA可誘導(dǎo)雛雞肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞脫落和炎性細(xì)胞浸潤。

在本研究中，不同劑量ZEA 對子代小雞階段的體重?zé)o顯著影響。但是子代在器官指數(shù)方面出現(xiàn)了一定程度的差別，與對照組相比，不同劑量ZEA 處理在數(shù)值上升高了子代小雞的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)，降低了心臟指數(shù)。250 μg/kg 組子代小雞的脾臟指數(shù)顯著低于對照組，500 μg/kg 組和750 μg/kg 組子代小雞的脾臟指數(shù)顯著高于250 μg/kg 組。但是這樣的差別并未出現(xiàn)對于ZEA 的劑量效應(yīng)關(guān)系，目前尚未發(fā)現(xiàn)充分的證據(jù)可對這樣的差別進行充分說明。

對于這一部分的結(jié)果，ZEA對子代生長沒有呈現(xiàn)劑量效應(yīng)的影響，與針對大鼠的試驗相對比可能是因為種間差異以及使用劑量的懸殊導(dǎo)致了試驗結(jié)果的差異，也可能與之前提到的ZEA在種母雞體內(nèi)的代謝情況以及家禽對ZEA不敏感有關(guān)[19,25]。

4 結(jié)論

飼糧中添加500、750 μg/kg ZEA可顯著降低文昌種母雞的蛋殼厚度，對其產(chǎn)蛋性能、孵化性能以及子代生長發(fā)育等重要的繁殖性狀影響不顯著，且在本試驗條件下不存在劑量效應(yīng)關(guān)系。