阿霉素致心肌線粒體損傷的分子機(jī)制研究進(jìn)展

李治邑 綜述 李妙齡 審校

西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省醫(yī)學(xué)電生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（瀘州 646000）

根據(jù)作用方式，可將抗腫瘤藥分為：①烷基化劑（如環(huán)磷酰胺等）；②抗腫瘤抗生素類藥（蒽環(huán)類藥物，如阿霉素等）；③抗代謝藥物（如5-氟尿嘧啶等）；④有絲分裂紡錘體抑制劑或抗有絲分裂藥物（紫杉烷類藥物，如長春新堿等）；⑤針對分子的藥物（如貝沙羅汀等）。阿霉素是抗生素蒽環(huán)類藥物，在治療乳腺癌[1]、食道癌[2]、霍奇金淋巴瘤[3]、非霍奇金淋巴瘤[4]、白血病等腫瘤上發(fā)揮了重要作用，但慢性或急性作用又可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用使其在臨床使用受限。在藥物作用的過程中會出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變，而線粒體在心肌組織穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。阿霉素可干擾線粒體呼吸鏈（如解偶聯(lián)）或抑制重要的線粒體酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜電位的改變和線粒體氧化應(yīng)激的增加，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

1 氧化應(yīng)激損傷

1.1 阿霉素誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生

線粒體膜內(nèi)富含心磷脂，是蛋白質(zhì)亞基組裝和催化功能必不可少的成分[5-6]。阿霉素對這種心磷脂有很高的親和力，導(dǎo)致阿霉素在心肌細(xì)胞內(nèi)積聚[7-8]。阿霉素進(jìn)入線粒體，通過與心磷脂結(jié)合進(jìn)而抑制呼吸鏈[9]，與線粒體膜的結(jié)合還可能增加阿霉素與線粒體電子傳輸鏈的NADH 脫氫酶（復(fù)合物I）在較低濃度下相互作用的機(jī)會。

有研究表明，阿霉素氧化還原循環(huán)發(fā)生在線粒體電子傳輸鏈[10]，更具體地說，發(fā)生在電子傳遞鏈復(fù)合體I。阿霉素具有醌的結(jié)構(gòu)，電子傳遞鏈復(fù)合體I中的各種NAD（P）H 依賴還原酶通過電子還原將阿霉素轉(zhuǎn)化為半醌自由基，這種半醌與分子氧反應(yīng)生成超氧自由基，從而產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS），如過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）、過氧亞硝酸根（ONOO-）等，同時(shí)還會釋放電子，破壞呼吸鏈的完整性[7-9]。

CHAISWING等[11]通過計(jì)算機(jī)定量超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)線粒體是阿霉素?fù)p傷心肌最廣泛和持續(xù)的亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)；在阿霉素抗腫瘤治療后的早期，心肌細(xì)胞線粒體中的蛋白質(zhì)就發(fā)生了顯著的氧化/硝化翻譯后修飾。雖然在過去的實(shí)驗(yàn)里幾乎都是在體外條件下用超標(biāo)的阿霉素劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，無法證實(shí)體內(nèi)的適用性，但后續(xù)有研究用不同劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果支持阿霉素治療產(chǎn)生的活性氧主要來源于線粒體的觀點(diǎn)[12]。

1.2 阿霉素誘導(dǎo)活性氮自由基的產(chǎn)生

阿霉素激活NAD（P）H 氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases，NOXs），從而激活心肌細(xì)胞凋亡途徑自由基的產(chǎn)生[13]。NOXs激活可能通過線粒體將ROS轉(zhuǎn)化為超氧自由基并與一氧化氮反應(yīng)生成ONOO-[14]。ONOO-激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），這些蛋白酶已被認(rèn)為是阿霉素產(chǎn)生過氧亞硝酸鹽導(dǎo)致心臟毒性的主要機(jī)制[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，用阿霉素治療后，小鼠心肌細(xì)胞中會形成過氧亞硝酸鹽[16]；并且有研究證明，阿霉素可誘導(dǎo)一氧化氮合成，從而導(dǎo)致亞硝酸鹽在細(xì)胞內(nèi)積聚[17]。

阿霉素在早期誘導(dǎo)線粒體脂質(zhì)過氧化，隨后在所有的亞細(xì)胞間形成硝化損傷產(chǎn)物，并在后期引起更廣泛的細(xì)胞損傷[11]。與MIKKELSEN 等[18]的假設(shè)一致，在心臟中氧化損傷先于硝化性損傷，并且硝化性損傷放大了氧化損傷作用[11]。

1.3 阿霉素誘導(dǎo)線粒體通透性改變

阿霉素可增加氧化磷酸化和引起線粒體轉(zhuǎn)換孔復(fù)合體功能改變。這種線粒體通透性的改變是阿霉素導(dǎo)致的劑量依賴性改變，線粒體通透性轉(zhuǎn)換會導(dǎo)致線粒體失去在內(nèi)膜上形成和維持電化學(xué)梯度的能力[19]。線粒體蛋白易受到外界刺激的影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的增加，線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換可能在調(diào)節(jié)與阿霉素治療相關(guān)的不良生物能量和功能后果方面發(fā)揮了迄今未知的作用[20]。近年已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞[21]或大鼠滲透性心肌纖維[22]中阿霉素抑制線粒體呼吸。

1.4 阿霉素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激信號通路活性的增強(qiáng)

阿霉素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激活性增強(qiáng)可致下游信號通路發(fā)生一系列的代償反應(yīng)，如Keap1/Nrf2/ARE通路的激活[23]或改變MAP激酶和/或PPAR核受體介導(dǎo)的通路[24]。在氧化狀態(tài)下，Keap1不能與Nrf2結(jié)合，從而允許該轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)積累并激活轉(zhuǎn)錄抗氧化反應(yīng)元件（AU-rich element，ARE）。有文獻(xiàn)報(bào)道，阿霉素可致大鼠心肌細(xì)胞中Keap1的氧化和Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)激活[25]，證明了這些通路參與了氧化應(yīng)激過程。

2 線粒體中的關(guān)鍵蛋白

2.1 連接蛋白43（Cx43）

連接蛋白43是細(xì)胞間信息傳遞的主要連接蛋白，對離子和小分子的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)起重要調(diào)節(jié)作用，并負(fù)責(zé)不同類型細(xì)胞之間的電傳遞，尤其是心肌細(xì)胞[26]。在過去的十年中，Cx43在各種細(xì)胞類型的線粒體中的存在已有報(bào)道[27]。有研究表明，線粒體Cx43通過減少胞漿和線粒體活性氧的產(chǎn)生，減少線粒體鈣超載，減少線粒體膜去極化和細(xì)胞色素C 的釋放而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。線粒體Cx43通過阻止細(xì)胞色素C釋放到胞漿中，減少其激活Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)，從而控制細(xì)胞凋亡的啟動[28-29]。

線粒體Cx43還參與另一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路可阻止線粒體通透孔的形成，從而防止線粒體腫脹、線粒體外膜破裂和產(chǎn)生凋亡的線粒體內(nèi)容物的釋放[30]。

RODRíGUEZ-SINOVAS等[31]證明缺血預(yù)處理通過熱休克蛋白90（heat shock protein90，Hsp90）和線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）的有關(guān)機(jī)制誘導(dǎo)Cx43 從胞漿到線粒體的移位。該系統(tǒng)包括將目標(biāo)蛋白與伴侶蛋白（Hsp90/Hsp70）結(jié)合，傳遞到TOMM 復(fù)合物的特定部分，然后釋放到線粒體膜內(nèi)[32]。Cx43移位到線粒體似乎對某些形式的心臟保護(hù)很重要，線粒體Cx43的增加與缺血預(yù)處理和心臟保護(hù)有關(guān)，可能是通過調(diào)節(jié)線粒體離子的穩(wěn)態(tài)和腫脹而發(fā)揮保護(hù)作用[33]。

3 鐵代謝障礙

3.1 阿霉素導(dǎo)致鐵代謝障礙

心臟是最活躍的代謝器官之一，它需要提供心肌細(xì)胞活動所需的能量。線粒體在這項(xiàng)任務(wù)中起關(guān)鍵作用，而線粒體正常功能所需的微量元素之一是鐵。數(shù)據(jù)表明，心肌細(xì)胞中近1/3 的的鐵分布在線粒體中[34]。鐵是理想的電子傳輸者，它可以促進(jìn)生化反應(yīng)，但也可以誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，過多的活性氧可能會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[35]。線粒體需要鐵的持續(xù)性供應(yīng)，鐵供應(yīng)的減少會影響細(xì)胞產(chǎn)能，鐵超載會產(chǎn)生過多的ROS 導(dǎo)致線粒體損傷[36]。有證據(jù)支持阿霉素導(dǎo)致鐵代謝障礙[37]。鐵螯合劑和鐵的抑制劑可通過保護(hù)線粒體減少阿霉素毒性。此外，阿霉素毒性的嚴(yán)重程度和不同線粒體鐵蛋白的活性之間的關(guān)系也表明了線粒體鐵失調(diào)在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中的重要性[38-40]。另外，有證據(jù)表明，進(jìn)入線粒體的鐵是通過絲裂鐵蛋白2和線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（mitochondrial calcium uniporter，MCU）調(diào)節(jié)的，而鐵的輸出是通過ATP結(jié)合盒B亞家族蛋白維持，如ATP結(jié)合盒B亞家族成員8（ABCB8）[19，41-44]。

3.2 鐵在阿霉素誘導(dǎo)的活性氧形成中起著至關(guān)重要的作用

由過渡金屬（如鐵）催化的Fenton 反應(yīng)和Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生ROS。DOX半醌超氧自由基和H2O2可以促進(jìn)鐵蛋白和細(xì)胞質(zhì)烏頭酸酶釋放鐵，從而改變鐵的代謝。隨后，鐵可以與阿霉素反應(yīng)，產(chǎn)生·OH[9，45]。氧化還原循環(huán)釋放的活性氧、過渡金屬和鐵絡(luò)合物的形成被認(rèn)為是阿霉素引起的多種心肌有害效應(yīng)的原因[46]。

4 凋亡

4.1 線粒體基因組DNA（MtDNA）損傷

人們普遍認(rèn)為DNA 損傷是阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡的早期重要事件[47]。阿霉素進(jìn)入線粒體，可能通過產(chǎn)生活性氧（ROS）直接或間接地與線粒體DNA（MtDNA）相互作用。線粒體DNA的破壞可能會導(dǎo)致呼吸鏈功能障礙，進(jìn)而產(chǎn)生額外的ROS，從而攻擊呼吸鏈本身，再次導(dǎo)致線粒體DNA突變[8]。

直接作用：蒽環(huán)類藥物，如阿霉素，被稱為拓?fù)洚悩?gòu)酶II（TOP2）類藥。阿霉素可以通過插入DNA鏈來阻斷DNA的合成，并且可以抑制TOP2的作用。這種酶在不改變脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)和序列的情況下改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，瞬間導(dǎo)致雙鏈DNA 斷裂，進(jìn)而調(diào)節(jié)DNA的超螺旋[48]。

間接作用：DNA復(fù)合物的產(chǎn)生：①阿霉素在線粒體產(chǎn)生自由基，這些自由基促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，從而促進(jìn)丙二醛的產(chǎn)生，丙二醛與脫氧鳥苷、脫氧腺苷和脫氧胞苷的環(huán)外氨基反應(yīng)形成烷基化復(fù)合物[48]。②4，6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶（FapyAde）或5-羥甲基尿嘧啶（5-OH-MeUra）等氮堿的氧化損傷也已被證實(shí)。這些氧化復(fù)合物是高度誘變的產(chǎn)物，可以阻止DNA 復(fù)制，并增加DNA聚合酶讀取錯誤的頻率。③阿霉素還可以通過NAD（P）H 氧化酶體系和過渡金屬與甲醛生成復(fù)合物。這種復(fù)合物與DNA 形成共價(jià)鍵，根據(jù)插入?yún)^(qū)域的不同，也可以或多或少形成穩(wěn)定的插層或更穩(wěn)定的DNA 交聯(lián)[45]。解旋酶不能分離DNA 鏈并干擾其解離可能是這些交聯(lián)導(dǎo)致的，但也可能是由于阿霉素對解旋酶的直接作用引起的[7-8，48]。

4.2 線粒體的凋亡途徑

線粒體功能障礙在阿霉素治療的早期階段很普遍，可能是細(xì)胞凋亡的直接原因[49]。KOTAMRAJU 等最近研究表明，超氧陰離子產(chǎn)生的過氧化氫可能是阿霉素誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵氧化劑，線粒體通過釋放細(xì)胞色素C 導(dǎo)致Caspase 激活和隨后的細(xì)胞死亡等機(jī)制在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用[48]。線粒體可對幾種信號（即活性氧、氧化還原狀態(tài)改變和鈣水平增加）做出反應(yīng)，這些信號觸發(fā)Caspase 激活蛋白的釋放，如細(xì)胞色素C 和凋亡誘導(dǎo)因子[50]。細(xì)胞色素C 從線粒體釋放到胞漿中可以導(dǎo)致Caspase-9 的激活，Caspase-9 負(fù)責(zé)激活效應(yīng)Caspase，如Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。有實(shí)驗(yàn)表明，Caspase-3 的活性主要?dú)w因于線粒體途徑[49-51]。

4.3 炎癥反應(yīng)損傷線粒體

蒽環(huán)類藥物可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子IL-6 和TNF 的過度表達(dá)，引起心臟組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體和細(xì)胞膜的氧化損傷，增加心臟毒性[52]。

5 線粒體能量代謝障礙

心臟高能磷酸鹽代謝障礙，已被認(rèn)為是蒽環(huán)類藥物心臟毒性的一個重要特征。已提出的阿霉素誘導(dǎo)的心臟能量衰竭的機(jī)制包括線粒體氧化還原功能的改變、細(xì)胞內(nèi)ATP 的降低，能量底物利用狀況的改變，以及能量生產(chǎn)和消耗之間能量轉(zhuǎn)移的干擾[53-57]。研究表明，臨床相關(guān)的阿霉素引起的急性心功能不全也與心臟能量代謝受損有關(guān)。阿霉素引起的急性心臟毒性伴隨NADPH氧化還原狀態(tài)、線粒體膜電位和葡萄糖攝取的變化。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果也一致地表明阿霉素?cái)_亂了心肌線粒體能量代謝。

最近有研究表明阿霉素在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中是NF-κB 的有效激活因子[58]，通過干擾素-γ介導(dǎo)心肌細(xì)胞信號導(dǎo)致線粒體呼吸和脂肪酸氧化的中斷，也減少AMPK信號，從而導(dǎo)致能量代謝障礙[59]。有實(shí)驗(yàn)表明，阿霉素影響心肌的代謝功能可能是通過調(diào)控PPAR核受體。在嚙齒動物中，阿霉素導(dǎo)致心肌組織中PPARα、PPARγ和PPARσ的下調(diào)，這些都被認(rèn)為是對該藥物代謝組反應(yīng)的重要因素。PGC1α被認(rèn)為在介導(dǎo)這一系列反應(yīng)中起主要作用[60-64]。

阿霉素在進(jìn)入線粒體的過程中使線粒體的NADH脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶[65]、細(xì)胞色素還原酶及琥珀酸脫氫酶的活性降低，使其氧化磷酸化受到抑制，ATP生成障礙，還嚴(yán)重影響了心肌的收縮和舒張。

ATP/ADP 和能荷（EC）是反映細(xì)胞能量水平和能量狀況的重要參數(shù)。ATP/ADP和EC比值的降低不僅刺激了線粒體的氧化磷酸化，而且還導(dǎo)致自由能和線粒體膜電位的降低。

線粒體Ca2+蓄積可減少高能磷酸鍵生成，通過能量代謝機(jī)制進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞損傷。較多文獻(xiàn)認(rèn)為阿霉素及其代謝物降低了線粒體鈣負(fù)荷的能力[19，48]。此外，心肌線粒體MPT 的誘導(dǎo)增強(qiáng)也可能是導(dǎo)致心肌線粒體呼吸頻率降低的原因之一[66]。

6 小結(jié)與展望

通過對阿霉素心臟毒性機(jī)制的研究，降低阿霉素治療癌癥帶來的副作用，對阿霉素的臨床應(yīng)用，癌癥治療和患者預(yù)后有十分重要的意義，也對未來研發(fā)更有效的蒽環(huán)類藥物提供了理論基礎(chǔ)。

（利益沖突：無）