結(jié)直腸癌的關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因篩選及其生物學(xué)功能分析

王錦淼，王穎，周博昊，王雷，穆偉斌

1 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161003；2 常熟理工學(xué)院計(jì)算機(jī)科學(xué)與工程學(xué)院

癌癥已經(jīng)成為全球主要死亡原因之一［1-2］。癌癥是一種由體細(xì)胞突變和克隆選擇導(dǎo)致的細(xì)胞惡性增殖的基因疾病，可直接導(dǎo)致癌癥發(fā)生的基突變即為“驅(qū)動(dòng)突變”［3］，而不會造成癌細(xì)胞增殖的無直接影響基突變則為“乘客突變”，“乘客突變”對癌癥的驅(qū)動(dòng)作用很?。?］，因此，識別出對癌癥具有重要影響的“驅(qū)動(dòng)基因”是目前癌癥發(fā)生機(jī)制的研究重點(diǎn)［5-6］，包含驅(qū)動(dòng)突變的基因則為“癌癥驅(qū)動(dòng)基因（Cancer Driver Genes，CDGs）”。CDGs可為癌癥預(yù)防、診斷和精準(zhǔn)治療提供關(guān)鍵信息［7］。結(jié)直腸癌（Colorectal carcinoma，CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升［8］。CRC 的發(fā)病與多種因素相關(guān)，隨著高通量測序技術(shù)的進(jìn)展，多組學(xué)基因檢測技術(shù)得到快速發(fā)展，但檢測常產(chǎn)生成千上萬CRC 相關(guān)基因，無法識別CRC的CDGs［9-11］。2021年6月起，我們采用多組學(xué)數(shù)據(jù)的組合優(yōu)化方法，篩選CRC 的關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因（Cancer Driver Genes，CDGs），并分析其生物學(xué)功能。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 CRC 基因數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)的下載及預(yù)處理 從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome. nih. gov/）中搜索并下載CRC 基因［13］，一共獲得612 份樣本轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，其中CRC 患者568 例、正常人44 例，癌基因56 753 個(gè)。從國際腫瘤基因組協(xié)作組數(shù)據(jù)庫

（the International Cancer Genome Consortium，ICGC）

（https：//dcc. icgc. org/）中搜索并下載CRC 基因表達(dá)數(shù)據(jù)［14］，一共獲得548 份數(shù)據(jù)，癌基因20 888 個(gè)。對下載的數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，剔除異常值數(shù)據(jù)，去除信息不全、重復(fù)和可能存在錯(cuò)誤的樣本和突變頻率過高或過低基因［15］，提高數(shù)據(jù)可靠性、準(zhǔn)確性。

1.2 CRC的關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因篩選

1.2.1 構(gòu)建CRC 基因突變矩陣與CRC 突變基因表達(dá)矩陣 從基因芯片中提取出樣本原始突變基因和表達(dá)基因，運(yùn)用“python”軟件將數(shù)據(jù)整理為基因-樣本形式的矩陣，將其分為癌癥組和對照組，將CRC突變基因數(shù)據(jù)整理成突變矩陣（CRC 基因突變矩陣），將突變基因表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建成基因表達(dá)矩陣（CRC突變基因表達(dá)）。

1.2.2 構(gòu)建CRC 高維突變基因加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模型 從STRING 數(shù)據(jù)庫（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）［17］中獲取CRC 基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用python 軟件將CRC 基因突變矩陣、CRC突變基因表達(dá)矩陣和PPI數(shù)據(jù)整合交集，以突變基因和PPI 網(wǎng)絡(luò)的score 值分別作為節(jié)點(diǎn)和邊，score值代表了基因之間這種相互作用（既包括蛋白質(zhì)之間直接的物理的相互作用，也包括蛋白質(zhì)間連接功能的相關(guān)性），節(jié)點(diǎn)屬性為突變因子分?jǐn)?shù)，兩者結(jié)合建立高維突變基因加權(quán)網(wǎng)絡(luò)，共包含14 388個(gè)基因。

1.2.3 CRC 癌癥驅(qū)動(dòng)基因篩選 根據(jù)高維突變基因加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模型的結(jié)構(gòu)特征，通過每個(gè)基因在網(wǎng)絡(luò)中相鄰基因的突變影響，計(jì)算最大基因影響分?jǐn)?shù)，基因節(jié)點(diǎn)影響分?jǐn)?shù)最大值即基因最大突變影響分?jǐn)?shù)得分，根據(jù)基因最大突變影響分?jǐn)?shù)得分最終得到CRC癌癥驅(qū)動(dòng)基因。

1.2.4 CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因篩選 CGC（The Cancer Gene Census）［19］數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址為：https：//cancer. sanger. ac. uk/census，其收錄基因是已被醫(yī)學(xué)界和生物界所認(rèn)定與癌癥相關(guān)的驅(qū)動(dòng)基因。從CGC 數(shù)據(jù)中提取已經(jīng)證實(shí)的結(jié)直腸癌癥基因［20-21］與“1.2.3”得到CRC 癌癥驅(qū)動(dòng)基因比較，得到CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因。

1.3 CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的生物學(xué)功能分析 采用STRING（https：//string-db. org）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），互動(dòng)分?jǐn)?shù)設(shè)置為中等置信度0.4 分，該圖由節(jié)點(diǎn)和邊組成，節(jié)點(diǎn)代表蛋白，邊代表關(guān)系，不同的顏色代表不同的數(shù)據(jù)來源。利用STRING在線分析工具生物注釋將排名前100的顯著差異基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析。GO 功能富集分析是對基因進(jìn)行注釋和生物學(xué)功能分析的重要工具，Go 功能主要分成三大類：生物學(xué)過程（BP）、分子功能（MF）和CC細(xì)胞組成（CC），KEGG 信號通路富集分析可從大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集中了解基因的富集通路。

2 結(jié)果

2.1 CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因 最終篩選出22 個(gè)CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因，其中排名前20分別為ATM、TTN、PCDHGB3、LRP1B、PCDHA6、PIK3CA、SYNE1、PCDHGB2、KMT2C、BRAF、BMPR1A、PCDHGA8、PCDHGA5、FAT4、PCDHA8、APC、PCDHGA7、PCDHA10、PCDHA9 及FBXW7?；蜃畲笸蛔冇绊懛?jǐn)?shù)得分分別為37 146.55、37 146.55、34 319.47、33 546.18、33 546.18、32 235.49、32 008.97、31 207.03、30 492.44、30 362.73、30 340.14、29 289.54、29 289.54、28 121.02、26 733.33、23 042.20、21 811.26、20 764.04、20 764.04、20 394.35。CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的相互作用圖見圖1。

圖1 CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的相互作用圖

2.2 CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的生物學(xué)功能 CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)包含100 個(gè)節(jié)點(diǎn)，241條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為4.82，局部聚類系數(shù)為0.474，PPI 富集P值＜1.0e-16。GO 功能富集結(jié)果顯示，CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的分子功能主要集中在鈣離子結(jié)合、陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、離子結(jié)合、捆綁、β-連環(huán)蛋白結(jié)合、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性（h3-k4特異性）等；生物過程主要集中在通過質(zhì)膜黏附分子的同源性細(xì)胞黏附、通過質(zhì)膜黏附分子的細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞黏附、細(xì)胞間黏附、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展、心臟發(fā)育、系統(tǒng)開發(fā)、多細(xì)胞生物發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生等；細(xì)胞組成主要集中在質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、膜、肌原纖維、肌膜、肌節(jié)、膜的組成部分、質(zhì)膜有界細(xì)胞投射、肌原纖維附著點(diǎn)、超分子纖維等。

KEEG 信號通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的信號通路主要集中在大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細(xì)胞癌、慢性粒細(xì)胞白血病、FoxO 信號通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、胃癌、前列腺癌、乙型肝炎、癌癥中的微小RNA。

3 討論

癌癥的發(fā)生和發(fā)展與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀組學(xué)及代謝組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)息息相關(guān)［12］。以往通常是在單個(gè)的大樣本數(shù)據(jù)中找到一些突變率顯著很高的基因作為候選基因，這樣的篩選造成癌癥通路中存在基因之間強(qiáng)異質(zhì)性的問題，所以如果單純的對其中一種組學(xué)數(shù)據(jù)來進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和生物研究會存在明顯的不足與缺陷，那么通過整合多組學(xué)數(shù)據(jù)并進(jìn)行綜合分析對癌癥得到了更深層次和更全面的探索，利用生物信息學(xué)技術(shù)鑒定出關(guān)鍵基因及其相關(guān)通路，從病理發(fā)生的分子機(jī)制角度對CRC 進(jìn)行理解，找到潛在可深入研究的用于診斷生物標(biāo)志物以及治療CRC的分子八項(xiàng)標(biāo)志物。

本研究采用多組學(xué)數(shù)據(jù)的組合優(yōu)化方法，整合體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)、基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)三種組學(xué)數(shù)據(jù)。首先基于多統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的CDGs生物特征提取，計(jì)算基因突變因子和皮爾遜相關(guān)系數(shù)，分別構(gòu)建出突變矩陣和基因表達(dá)矩陣。然后以基因的突變頻率和基因表達(dá)水平相關(guān)性為節(jié)點(diǎn)和邊，建立高維突變基因加權(quán)網(wǎng)絡(luò)模型，基于該網(wǎng)絡(luò)模型利用重力學(xué)模型計(jì)算基因與鄰居節(jié)點(diǎn)的突變影響分?jǐn)?shù)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的影響分?jǐn)?shù)最大值進(jìn)而得出基因的突變影響因子大小，并在兼顧基因網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的條件下，以突變影響因子大小為根據(jù)運(yùn)用一種綜合的基因打分方法，最終得出驅(qū)動(dòng)基因的預(yù)測集。

本研究中構(gòu)建的基因相互作用網(wǎng)絡(luò)信息更加全面，對于以往單一組學(xué)數(shù)據(jù)研究的缺陷進(jìn)行了彌補(bǔ)，在多個(gè)體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)集上進(jìn)行評估，優(yōu)先選擇潛在的癌癥驅(qū)動(dòng)基因，對識別出的驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行CGC富集對比分析并能很好富集到CGC 列表中，利用本方法識別出的CRC排名靠前出現(xiàn)在CGC基因列表中的 前10 個(gè) 包 括：ATM、TTN、PCDHGB3、LRP1B、PCDHA6、PIK3CA、SYNE1、PCDHGB2、KMT2C 和BRAF，在CRC 組織中均明顯表達(dá)增高，說明了這10個(gè)基因均與癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這些關(guān)鍵基因可以作為CRC診斷和治療的潛在靶標(biāo)，也使我們更加全面的了解CRC的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展機(jī)理，對于CRC的預(yù)防和早期診斷、治療具有重要的臨床意義。

對CRC 的關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行GO 本體論分析和KEGG 通路生物功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的分子功能主要集中在鈣離子結(jié)合、陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、離子結(jié)合、捆綁、β-連環(huán)蛋白結(jié)合、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性（h3-k4 特異性）等；生物過程主要集中在通過質(zhì)膜黏附分子的同源性細(xì)胞黏附、通過質(zhì)膜黏附分子的細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞黏附、細(xì)胞間黏附、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展、心臟發(fā)育、系統(tǒng)開發(fā)、多細(xì)胞生物發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生等；細(xì)胞組成主要集中在質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、膜、肌原纖維、肌膜、肌節(jié)、膜的組成部分、質(zhì)膜有界細(xì)胞投射、肌原纖維附著點(diǎn)、超分子纖維等。驅(qū)動(dòng)基因都是與質(zhì)膜、肌膜和離子結(jié)合炎癥等生命正常運(yùn)行時(shí)有密切關(guān)聯(lián)的，說明這些驅(qū)動(dòng)基因具有重要的生物學(xué)功能。對KEGG 信號通路與關(guān)鍵基因關(guān)聯(lián)的分析，本研究中CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的信號通路主要集中在大腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細(xì)胞癌、慢性粒細(xì)胞白血病、FoxO信號通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、胃癌、前列腺癌、乙型肝炎、癌癥中的微小RNA，說明CRC 關(guān)鍵基因的基因調(diào)控通路可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)同一驅(qū)動(dòng)基因在不同腫瘤之間產(chǎn)生致癌作用，說明癌癥的發(fā)病存在共通之處。

綜上所述，成功篩選出22個(gè)CRC關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因，如ATM、TTN、PCDHGB3等。CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因的分子功能主要集中在鈣離子結(jié)合、陽離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合等；生物過程主要集中在通過質(zhì)膜黏附分子的同源性細(xì)胞黏附、通過質(zhì)膜黏附分子的細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞黏附等；細(xì)胞組成主要集中在質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、膜等；信號通路主要集中在大腸癌、FoxO 信號通路、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路等。深入了解CRC 關(guān)鍵癌癥驅(qū)動(dòng)基因有助于研究CRC 發(fā)生發(fā)展機(jī)制，同時(shí)可為CRC 提供新的治療靶點(diǎn)。同時(shí)，多組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法能夠高精度預(yù)測疾病的驅(qū)動(dòng)基因，為其他癌癥的診療研究提供了一種新方法。