CTLA4-Ig 腹腔注射對大鼠實驗性自身免疫性重癥肌無力的治療作用及其機制

2022-11-23 11:00:42焦子洋梁培鑫薛占霞鄭立卿董曉華吳苗苗武海霞侯勇

山東醫(yī)藥 2022年30期

焦子洋，梁培鑫，薛占霞，鄭立卿，董曉華，吳苗苗，武海霞，侯勇

河北北方學(xué)院藥學(xué)院，河北省神經(jīng)藥理學(xué)重點實驗室，河北張家口 075000

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種慢性獲得性自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機制尚未闡明，地塞米松是目前臨床常用的MG 治療藥物［1］。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，胸腺淋巴細(xì)胞的凋亡失控可能是MG的主要發(fā)病機制之一。細(xì)胞凋亡（apoptosis）又稱細(xì)胞程序化死亡（programmed cell death，PCD），是指機體為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由多基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞主動死亡過程［4］。Fas、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease，Caspases）基因是調(diào)控淋巴細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因［5-6］。凋亡相關(guān)因子Fas 能促進(jìn)胸腺細(xì)胞的陰性選擇，影響自身反應(yīng)性胸腺細(xì)胞的凋亡［7］。Bcl-2 可抑制細(xì)胞凋亡，而B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X 蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，二者均參與胸腺細(xì)胞成熟過程中的正負(fù)選擇［8］。Bcl-2 基因表達(dá)的上調(diào)可導(dǎo)致胸腺組織T 細(xì)胞具備抗凋亡能力，最終誘發(fā)MG［9］。Bax/Bcl-2 變化與MG 的預(yù)后密切相關(guān)［10］。此外，研究［11］表明，Caspase 家族也參與MG或?qū)嶒炐宰陨砻庖咝灾匕Y肌無力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）胸腺細(xì)胞凋亡障礙的發(fā)生。細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA4）是一種負(fù)性調(diào)控分子，可通過CD28/B7 介導(dǎo)的共刺激通路，防止細(xì)胞無序或過度活化，將免疫應(yīng)答控制在可控范圍［12］。細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原4 免疫球蛋白（cytotoxic T lymphocyte antigen-4 immunolobulin，CTLA4-Ig）是由CTLA4 胞外區(qū)與IgG 的Fc 段融合構(gòu)建而成的，可有效抑制初始T 細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)T 細(xì)胞進(jìn)入無能狀態(tài)，表現(xiàn)為對特定抗原的不應(yīng)答［13］。本研究組前期研究［14］結(jié)果表明，CTLA4-Ig 可通過抑制CD28/B7 信號通路，減緩MG 的發(fā)生發(fā)展；CTLA4-Ig 可抑制EAMG大鼠淋巴細(xì)胞的增殖。CTLA4-Ig是否通過影響胸腺組織相關(guān)凋亡基因的表達(dá)，發(fā)揮MG 治療作用，目前尚未有相關(guān)報道。因此，我們觀察了CTLA4-Ig 腹腔注射對大鼠EAMG 的治療作用，并探討其可能作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 45 只雌性Lewis 大鼠（7～8 周齡，體質(zhì)量140～160 g）購自南京大學(xué)模型動物研究中心，在無特定病原體（no specific pathogen，SPF）環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫（24±2）℃，12 h 光/暗循環(huán)，40%～70%相對濕度，自由獲得食物和水。本研究期間動物實驗均嚴(yán)格遵守動物倫理要求。乙酰膽堿受體（AchR）α97-116肽序列、完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA）、AChRab 及AChR ELISA 試劑盒購于美國Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于湖北武漢華東生物科技有限公司；地塞米松購于中國天津醫(yī)藥集團有限公司；CTLA4-Ig 購于美國BD公司；TRIzol 購于美國Invitrogen 公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0 購于中國大連寶生物工程有限公司。Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 活性檢測試劑盒購于南京凱基生物發(fā)展有限公司產(chǎn)品。PCR擴增儀（德國），低溫超速離心機（北京安亭儀器設(shè)備廠，中國）。

1.2 EAMG 模型構(gòu)建取35 只大鼠，用AchR α 97-116 肽免疫法構(gòu)建EAMG 大鼠模型。50 μg 的AChR α97-116 肽和CFA 混合制備200 μL 乳液，然后將其皮下注射至大鼠的頸部、背部和足墊區(qū)域（注射當(dāng)天為第1 天）。第30、60 天分別在初次免疫注射部位等劑量進(jìn)行強化免疫。另外10 只大鼠為正常對照（對照組），于同期予等量生理鹽水。在第74 天評估EAMG 模型是否成功。依據(jù)大鼠臨床表現(xiàn)判斷EAMG 造模是否成功。與對照組比較，EAMG 模型大鼠造模2 周后出現(xiàn)爬行無力、背頸部皮毛松弛等MG 癥狀，4 周后癥狀明顯加重，包括呼吸困難，頭部震顫，背部出現(xiàn)腫塊，毛發(fā)倒豎，行走困難，奄奄一息。最終30 只大鼠造模成功。

1.3 大鼠分組及CTLA4-Ig 給予方法將30 只EAMG 模型大鼠隨機分為CTLA4-Ig 組、EAMG 組及地塞米松組，每組各10 只。第74 天時CTLA4-Ig 組大鼠用2 mg/kg 的CTLA4-Ig 腹腔注射，地塞米松組用1 mg/kg的地塞米松腹腔注射，EAMG組及對照組大鼠腹腔注射同體積PBS，1 天1 次（間隔24 h），持續(xù)至第130 天。CTLA4-Ig 給予期間，EAMG 組大鼠死亡1只，對照組麻醉死亡1只。因此每組選取9只大鼠進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 各組大鼠體質(zhì)量及肌力觀察分別于第74、102、130 天記錄各組大鼠體質(zhì)量，觀察并記錄大鼠肌力。Lennon 評分0 級：沒有顯著的MG 癥狀，計0分；1 級：活動減少、輕微抓撓或哭聲減少，計1 分；2級：前肢屈曲、低頭、駝背、動作不協(xié)調(diào)，計2分；3級：嚴(yán)重的MG 表現(xiàn)，無哭無爬，震顫，處于垂死狀態(tài)，計3分。如果大鼠的癥狀在上述4級之間，評分為0.5、1.5和2.5分。

1.5 標(biāo)本留取及指標(biāo)檢測分別于第74、102、130天采集各組大鼠尾靜脈血，第130 天同時采集大鼠后肢肌肉組織和胸腺組織。

1.5.1 各組大鼠血清AChR IgG、AChR IgG 2b 及后肢肌肉組織AChR 含量檢測 ①采用ELISA 法檢測血清AChR IgG、AChR IgG 2b。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的光密度（OD）值，重復(fù)測定3 次取平均值。②取各組大鼠后肢肌肉組織，0.01 mol/L PBS 勻漿后離心20 min。棄上清，將沉淀物重新懸浮含有2% Triton X-100 的緩沖液中。根據(jù)說明書，使用大鼠AChR ELISA 試劑盒檢測上清液AChR 含量，重復(fù)測定3 次取平均值。

1.5.2 各組大鼠胸腺組織凋亡相關(guān)基因mRNA 檢測采用RT-PCR 法檢測各組大鼠胸腺組織Fas、FasL、Bcl-2、Bax、Caspases-3、Caspases-8和Caspases-9基因mRNA 表達(dá)。取各組大鼠胸腺組織，提取總RNA，紫外分光光度測定RNA濃度，參考文獻(xiàn)［15］測定凋亡相關(guān)基因mRNA，以TATA 盒式蛋白編碼基因（Tbp）為內(nèi)參。根據(jù)試劑盒說明書加入各反應(yīng)試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及cDNA 擴增。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：30 ℃、10 min，50 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min；PCR擴增：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性40 s；51 ℃～57.5 ℃，復(fù)性40 s；72 ℃延伸40 s，循環(huán)35～40次，72 ℃延伸加時10 min。瓊脂糖凝膠電泳，F(xiàn)luorochem 5500成像系統(tǒng)采集圖像，以各凋亡相關(guān)基因mRNA吸光度和Tbp吸光度比值表示其mRNA相對表達(dá)量。凋亡相關(guān)基因和Tbp的引物序列見表1。

表1 凋亡相關(guān)基因和Tbp引物序列

1.5.3 各組大鼠胸腺組織Caspases-3、Caspases-8和Caspases-9 活性檢測采用紫外分光法檢測各組大鼠胸腺組織Caspases-3、Caspases-8 和Caspases-9活性。所有操作均嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書進(jìn)行。測定405 nm時的最大吸收峰值即為Caspases-3、Caspases-8 和Caspases-9 活性值，重復(fù)測定3 次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用Shapiro-Wilk 檢驗進(jìn)行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，如組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義則采用LSD-t檢驗進(jìn)行兩兩比較；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。