微殘清顆粒含藥血清對CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞增殖凋亡的影響及其作用機(jī)制

閆理想，姜靜，楊向東，何敬，楊曦，陳海靜，李德冠，史哲新

1 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，300381 天津；2 天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院消化二科；3 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所

白血病干細(xì)胞（Leukemia stem cells，LSC）可能在白血病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，與白血病的復(fù)發(fā)及多藥耐藥有關(guān)［1-2］。消除LSC 或逆轉(zhuǎn)LSC細(xì)胞耐藥有助于提高白血病療效。LSC 細(xì)胞多藥耐藥不僅與Wnt、PI3K/AKt 等信號通路的表達(dá)異常有關(guān)，還與多藥耐藥負(fù)調(diào)控因子的活性降低或缺失有關(guān)，如Ⅰ型跨膜糖蛋白（CD95）［3］、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（TOPOⅡα）［4］及人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）［5］缺失或表達(dá)下調(diào)等。中醫(yī)理論認(rèn)為，白血病是正氣虛損、內(nèi)邪滋生、邪毒內(nèi)侵導(dǎo)致的，其治療以扶正解毒為原則?；诎籽?fù)發(fā)耐藥發(fā)病機(jī)制及治療原則，我科在當(dāng)歸補(bǔ)血湯、四君子湯及青黃散等經(jīng)典方劑基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床實(shí)踐總結(jié)出微殘清顆粒方劑。我們前期研究［6］發(fā)現(xiàn)，微殘清顆粒輔助治療可提高難治性急性白血病患者的臨床療效，一定程度逆轉(zhuǎn)LSC細(xì)胞的耐藥，但其具體作用機(jī)制尚不明確。我們觀察了微殘清顆粒含藥血清與柔紅霉素共培養(yǎng)對耐藥白血病細(xì)胞（CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞）增殖、細(xì)胞周期及凋亡情況的影響，并探討其可能作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑及儀器 人急性骨髓白血病KG1a細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所饋贈。20只SPF級新西蘭大白兔（6月齡），雌雄各10只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，購于北京華阜康公司（SCXK（京）2014-0004）。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。注射液鹽酸柔紅霉素（20 mg，15049039）購自美國輝瑞；微殘清顆粒（黃芪30 g，當(dāng)歸15 g，全蝎9 g，青黛9 g，雄黃0.3 g，人參10 g，白術(shù)15 g，茯苓15g，甘草10 g）由我院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室采用單藥顆粒制備技術(shù)制備而成，無菌干燥后密封于塑封袋中備用，應(yīng)用時滅菌注射用水配置成1 g/mL 沖劑，105 ℃蒸汽滅菌。實(shí)時定量PCR 儀（CFX96，美國Bio-rad）、流式細(xì)胞儀（C6 型，美國BD）；熒光成像系統(tǒng)（ChemiDoc MP，Bio-rad）。CD34、CD38 磁珠（130-046-702，130-092-263，Miltenyi Biotec）；CCK-8 試劑盒（40203ES60，上海前塵生物）；CD95、PTEN、TOPO Ⅱα 抗 體（sc-8009、sc-165986、sc-133197，Santa Cruz）；羊抗兔IgG 抗體（CW0103S，北京康為世紀(jì)）；RNA、cDNA 提取試劑（CW0597、CW0741A，北京康為世紀(jì)；PCR 試劑盒（PR7012，北京百泰克生物）。

1.2 CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞培養(yǎng)、分選、微殘清顆粒含藥血清培養(yǎng)方法

1.2.1 CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞分選 KG1a 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含柔紅霉素（1ug/ml）的培養(yǎng)液中，以保持其耐藥性。取對數(shù)生長期KG1a 細(xì)胞，采用免疫磁珠法分選CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞，所有操作均嚴(yán)格按試劑使用說明書操作。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測分選前后CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞亞群比例，分選前后CD34+CD38-KG1a細(xì)胞比例分別為45.6%±4.36%、97.2%±2.53%，分選后CD34+CD38-KG1a細(xì)胞比例達(dá)到95%以上，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.2 微殘清顆粒含藥血清制備 20 只大白兔隨機(jī)分為中藥組和空白組，每組各10 只。根據(jù)黃繼漢［7］人鼠劑量換算方法，中藥組給予微殘清顆粒水煎劑8 mL（1 g/mL）灌胃，2 次/日，連續(xù)灌胃7 d；空白組予0.9%生理鹽水8 mL 灌胃，時間頻率同中藥組。灌胃第7 天末次給藥2 h 心臟取血5 mL。常規(guī)離心分離血清，同組兔混勻后過濾分裝，備用。

1.2.3 細(xì)胞分組及微殘清顆粒含藥血清培養(yǎng)方法 取4×104/mL 的CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞分為A、B、C、D 組，接種于96 孔板，每孔100 μL，每組5 個復(fù)孔。A 組用微殘清顆粒含藥血清（血清為終體積20%）+柔紅霉素1.25 μg/mL［8］培養(yǎng)，B 組加入微殘清顆粒含藥血清（血清為終體積20%）培養(yǎng)，C 組加入1.25 μg/mL 的柔紅霉素培養(yǎng)，D 組為空白對照組，加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀察 分別于培養(yǎng)24、48、72 h 時，向各組培養(yǎng)板每孔中加入8 μL CCK8 溶液，然后常溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。測算各組細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增生抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值）×100%。重復(fù)3 次取平均值。

1.4 各組細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及CD95 表達(dá)觀察 培養(yǎng)72 h時取各組細(xì)胞，離心5 min，PBS清洗2次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×105/mL，加入-20 ℃預(yù)冷70%乙醇2 mL 固定，RNase 消化，4 ℃放置24 h，PBS 洗2次，每管加入PI（50 μg/mL）1 mL，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期，AUXIN-V 法測算各組細(xì)胞凋亡率（早期細(xì)胞凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率）。另取培養(yǎng)72 h 各組細(xì)胞，2 000 r/min 離心5 min 去上清，避光分別加入CD95 抗體5 μL，同時設(shè)空白對照，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min，1 mL PBS 混勻、離心后棄上清，加入50 μL PBS 混勻，上機(jī)測算CD95陽性比例。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測算3次，取平均值。

1.5 各組細(xì)胞TOPOⅡα、PTEN mRNA 及蛋白檢測 ①采用RT-PCR 法檢測各組細(xì)胞TOPOⅡα、PTEN mRNA：培養(yǎng)72 h 時取各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有操作步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。RT- PCR 反應(yīng)細(xì)胞TOPOⅡα、PTEN mRNA，引物序列由上海生工公司合成。β-actin（上游引物：5，-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3，，下游引物5，- AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3，）、PTEN（上游引物5，-ACCAGGACCAGAGGAAACCT-3，，下游引物 5，-GCTAGCCTCTGGATTTGACG-3，）、TOPO Ⅱα（上游引物：5，-GCCCTCCTGCTACACATTTC-3，，下游引物5，-AACACTTGGGCTTTACTTCACTT-3，）。以2-ΔΔCt代表目的基因的相對表達(dá)量，重復(fù)檢測3 次取平均值。②采用WESTERN Blotting 檢測各組細(xì)胞TOPOⅡα、PTEN 蛋白：培養(yǎng)72 h 時取各組細(xì)胞混勻，PBS（0.01 mol/L，pH 7.0～7.2）沖洗3 次，加1 mL 液氮研磨，200 μL 蛋白裂解液混勻，4 ℃搖晃震蕩10 min，冰上裂解30 min，離心（12 000 r/min，4 ℃，30 min）后取上清總蛋白。采用BCA法檢測蛋白，變性、離心（10 000 r/min，常溫，30 s），取上清進(jìn)行SDS-PAGE，所有操作均嚴(yán)格按照試劑說明書操作。應(yīng)用Image Lab 4.0 軟件，以D 組為基量（相對定量為1），測算各組細(xì)胞TOPOⅡα、PTEN 蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用P-P 圖檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差檢驗(yàn)；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)24、48、72 h 時各組細(xì)胞增殖抑制率比較 培養(yǎng)24、48、72 h時各組細(xì)胞增殖抑制率比較見表1。

表1 培養(yǎng)24、48、72 h時各組細(xì)胞增殖抑制率比較（%，-x±s）

2.2 培養(yǎng)72 h 時各組細(xì)胞周期比例比較 培養(yǎng)72 h時各組細(xì)胞周期比例比較見表2。

表2 培養(yǎng)72 h時各組細(xì)胞周期比例比較（%，±s）

表2 培養(yǎng)72 h時各組細(xì)胞周期比例比較（%，±s）

注：與D組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05。

組別A組B組C組D組G2/M 17.90±1.10*△18.80±2.74*△10.25±2.11 10.75±1.02 G0/G1 66.35±2.34*△65.19±3.48*△77.51±2.20 74.87±1.64 S 15.74±1.46 16.00±2.06 12.23±0.60 14.77±1.91

2.3 培養(yǎng)72 h時各組細(xì)胞凋亡率比較 培養(yǎng)72 h時各組細(xì)胞凋亡率比較見表3。WCQ 組、WCQ+DNR組的早期凋亡明顯升高，在晚期凋亡上僅有WCQ+DNR組的比例明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 培養(yǎng)72 h時各組細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表3 培養(yǎng)72 h時各組細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

注：與B組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.052.4 培養(yǎng)72 h時

組別A組B組C組D組細(xì)胞凋亡率晚期凋亡率28.95±1.66*10.85±0.82△14.13±1.86 14.56±1.69總凋亡率55.24±2.71*31.23±2.36 26.11±2.38 27.25±1.36早期凋亡率29.29±1.88*20.34±1.49△10.18±0.97 11.59±1.94

2.4 各組CD95 陽性細(xì)胞比例比較 培養(yǎng)72 h 時A、B、C、D 組CD95 陽性細(xì)胞比例 分別為16.50% ±2.62%、9.60% ± 1.73%、5.00% ± 3.06%、7.70% ±2.51%，與B、C、D 組比較，A 組CD95 陽性細(xì)胞比例高（P均＜0.05）。

2.5 培養(yǎng)72 h 時各組細(xì)胞PTEN、TOPOⅡα mRNA相對表達(dá)量比較 培養(yǎng)48 h 時A、B、C、組細(xì)胞PTEN mRNA 相 對 表 達(dá) 量 分 別 為27.34 ± 4.16、7.52 ± 2.48、1.87 ± 0.69，與D 組 比 較，A、B 組PTEN mRNA 相對表達(dá)量升高（P 均＜0.05），與C 組比較，A、B 組PTEN mRNA 相對表達(dá)量升高（P 均＜0.05）；TOPOⅡα mRNA 相對表達(dá)量分別為12.74±2.53、1.08±1.16、0.75±0.62，與C、D組比較，A組TOPOⅡα mRNA相對表達(dá)量升高（P均＜0.05）。

2.6 培養(yǎng)72 h 時各組細(xì)胞PTEN、TOPOⅡα 蛋白相對表達(dá)量比較 培養(yǎng)48 h 時A、B、C、組細(xì)胞PTEN蛋白相對表達(dá)量分別為2.3 ± 0.41、1.99 ± 0.27、0.92±0.26，與D 組比較，A、B 組PTEN 蛋白相對表達(dá)量升高，與C 組比較，A、B 組PTEN 蛋白相對表達(dá)量升高（P 均＜0.05）；TOPOⅡα 蛋白相對表達(dá)量分別為1.68±0.16、1.47±0.53、0.61±0.19，與D 組比較，A 組TOPO Ⅱα 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05），與C 組比較，A、B 組TOPOⅡα 蛋白相對表達(dá)量升高（P均＜0.05）。

3 討論

LSC 多藥耐藥是白血病復(fù)發(fā)難治的根源，盡管其發(fā)生的機(jī)制是復(fù)雜多樣的，但不外乎正調(diào)控與負(fù)調(diào)控兩方面，其中負(fù)調(diào)控蛋白CD95、負(fù)調(diào)控酶TopoⅡα和負(fù)調(diào)控基因PTEN 是近年來研究的熱點(diǎn)，這些負(fù)調(diào)控因子的活性降低或缺失與LSC多藥耐藥的發(fā)生有著密切的關(guān)系。負(fù)調(diào)控蛋白CD95（又稱Fas，Apo-1）是細(xì)胞表面膜蛋白受體分子，分子量48ku，CD95 與其天然配體（FasL）結(jié)合后可向敏感靶細(xì)胞內(nèi)傳遞死亡信號而誘導(dǎo)凋亡。近年研究已證實(shí)，多藥耐藥病人CD95低表達(dá)或活性降低，通過Fas/FasL凋亡途徑參與LSC 多藥耐藥［9］。負(fù)調(diào)控酶TopoⅡα是蒽環(huán)類化療藥物作用靶點(diǎn)，蒽環(huán)類藥物和TopoⅡα 結(jié)合，抑制DNA 再連接，阻止細(xì)胞復(fù)制，TopoⅡα 高表達(dá)有利于蒽環(huán)類藥物敏感，相反多藥耐藥的LSC低表達(dá)TopoⅡα，提高TopoⅡα表達(dá)及活性就是增強(qiáng)拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑作用效果［10］。研究發(fā)現(xiàn)，TopoⅡα 的高表達(dá)可提高化療病理反應(yīng)性［11］。負(fù)調(diào)控基因PTEN 在急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等中存在不同程度的低表達(dá)或雜合性缺失［12-13］，研究證實(shí)PI3K/Akt/mTOR 通路的活化與PTEN 的低表達(dá)或缺失相關(guān)，而該通路為細(xì)胞凋亡、耐藥的重要通路［14］。

基于白血病復(fù)發(fā)“髓虛邪伏，邪毒致變”的機(jī)制，治則當(dāng)以益氣養(yǎng)陰以扶正，解毒以祛邪，本課題組根據(jù)這一中醫(yī)病理變化提出益氣養(yǎng)陰解毒法。經(jīng)多年臨床實(shí)踐，證實(shí)該治法在復(fù)發(fā)難治白血病的治療中具有較好的臨床效果，該治法選用經(jīng)典方劑當(dāng)歸補(bǔ)血湯、四君子湯合青黃散加減共奏益氣養(yǎng)陰解毒之功，方藥選用黃芪、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血為君，全蝎、青黛、雄黃解毒攻毒為臣，人參、白術(shù)、茯苓、甘草益氣健脾為佐使，全方攻補(bǔ)兼施，顧護(hù)正氣，驅(qū)邪不傷正，扶正不留邪。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)化療配合微殘清顆粒藥可提高難治性急性白血病患者的臨床療效，推測微殘清顆?？赡芫哂性黾踊颊邔ΤＲ?guī)化療藥的敏感性，具有逆轉(zhuǎn)難治性急性白血病耐藥的作用，但其作用機(jī)制尚不清楚［6］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，微殘清顆粒含藥血清單獨(dú)培養(yǎng)時對耐藥CD34+CD38-KG1a 并未表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而單獨(dú)柔紅霉素組的抑制率亦低于微殘清含藥血清聯(lián)合柔紅霉素組，結(jié)果表明微殘清顆粒單獨(dú)用藥抗白血病耐藥效果不顯著，而與柔紅霉素聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞增殖明顯抑制，提示微殘清顆?？赡芫哂心孓D(zhuǎn)耐藥的作用，從而增加白血病干細(xì)胞對化療藥物的敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，微殘清顆粒組和微殘清顆粒聯(lián)合柔紅霉素組均可促進(jìn)CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期及凋亡，尤其表現(xiàn)在早期凋亡上，提示微殘清顆粒逆轉(zhuǎn)耐藥的途徑可能是促進(jìn)KG1a 干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，增加分化凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)DNR 對KG1a干細(xì)胞的抑制作用。同時我們發(fā)現(xiàn)，微殘清顆?？商岣逰G1a 干細(xì)胞膜蛋白CD95 的表達(dá)，在聯(lián)合DNR 時可提高TOPOⅡα、PTEN 蛋白及mRNA 的表達(dá)，單獨(dú)微殘清顆粒僅可提高PTEN mRNA，對TOPOⅡα mRNA 未見明顯干預(yù)作用，提示微殘清顆粒具有逆轉(zhuǎn)LSC耐藥作用的機(jī)制可能是通過調(diào)控膜蛋 白CD95、TOPO Ⅱα、PTEN 耐 藥 負(fù) 調(diào) 控 因 子 而實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，加入微殘清顆粒含藥血清與柔紅霉素可抑制CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞的增殖、降低G0/G1期細(xì)胞比例、增加G2/M期細(xì)胞比例，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制為微殘清顆粒含藥血清可提高CD34+CD38-KG1a 細(xì)胞CD95 的陽性比例、促進(jìn)細(xì)胞PTEN、TOPOⅡαmRNA 及蛋白表達(dá)。微殘清顆粒含藥血清可增加KG1a 干細(xì)胞對柔紅霉素的藥物敏感性，其機(jī)制可能是微殘清顆粒通過活化CD95、PTEN及TOPOⅡα 負(fù)調(diào)控因子影響KG1a干細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡。但LSC 細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制復(fù)雜，涉及蛋白磷酸化、基因甲基化等諸多調(diào)控因子的干預(yù)，而微殘清顆粒的效成分及具體藥理作用后續(xù)仍需進(jìn)一步深入研究探討。