從HBV cccDNA角度談乙型肝炎的功能性治愈

陳 娟， 黃愛龍

重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室， 重慶 400016

HBV感染是我國最為重要的公共衛(wèi)生問題之一，雖然我國乙型肝炎流行程度大大降低，但是現(xiàn)存感染者和患者數(shù)量依然龐大。現(xiàn)有乙型肝炎治療藥物僅能使極少慢性乙型肝炎(CHB)患者達成功能性治愈，即使最有效的組合療法，HBsAg年陰轉(zhuǎn)率也難以超過2%。實現(xiàn)CHB治愈的關(guān)鍵，在于有效抑制或清除HBV在細胞內(nèi)形成的高穩(wěn)定性遺傳物——微染色體樣共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)[1]。

現(xiàn)階段正在研發(fā)的抗病毒藥物包括病毒進入抑制劑、衣殼抑制劑、HBV聚合酶抑制劑、HBV X蛋白(hepatitis X protein，HBx)靶向藥物、HBsAg抑制劑、RNA干擾(RNAi)類藥物，靶向HBV生命周期的不同環(huán)節(jié)[2-3]。雖然上述部分抗病毒藥物可通過有效阻斷肝細胞發(fā)生再感染或病毒復(fù)制從而切斷cccDNA生成途徑，但遺憾的是，目前尚未見直接靶向cccDNA使之永久失活或清除的藥物[4]。

研究cccDNA合成、轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定性調(diào)控機制，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出靶向cccDNA的有效藥物是實現(xiàn)乙型肝炎治愈的重大科學問題。本文將簡要回顧cccDNA基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的進展，重點圍繞cccDNA沉默或清除策略介紹在研乙型肝炎新藥并進行討論。

1 cccDNA的生物學特征

1.1 cccDNA的形成機制 HBV屬于嗜肝DNA病毒，其通過與肝細胞膜上受體?；悄懰徕c離子共轉(zhuǎn)運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)結(jié)合并進入肝細胞[5]。隨后病毒基因組部分環(huán)狀雙鏈DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)釋放入細胞核，并修復(fù)為cccDNA，具體包括3個環(huán)節(jié)：(1)去除rcDNA負鏈5′端共價結(jié)合的病毒P蛋白以及5′-flap結(jié)構(gòu)；(2)去除rcDNA正鏈5′端RNA引物并補齊不完整的正鏈；(3)連接正負鏈末端缺口。體外生化體系的研究[6-7]顯示，rcDNA修復(fù)為cccDNA至少需要包括瓣結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶1(FEN1)、人增殖細胞核抗原(PCNA)、復(fù)制因子C復(fù)合物(RFC)、DNA聚合酶δ(Polδ)和ATP依賴性DNA連接酶Ⅰ(LIG1)5個因子參與。cccDNA的形成是HBV侵入細胞后在細胞內(nèi)進行復(fù)制的起始步驟，也是建立病毒感染狀態(tài)的最重要標志[8]。

1.2 cccDNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制 cccDNA轉(zhuǎn)錄是HBV完成生活周期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其轉(zhuǎn)錄受到宿主因子和病毒蛋白的雙重調(diào)控。靶向cccDNA轉(zhuǎn)錄是提高乙型肝炎功能性治愈率的重要手段。目前，研究較為明確的是，有多種普遍分布的轉(zhuǎn)錄因子(TBP、AP-1、Sp1、NF-1、CREB等)和肝組織富集轉(zhuǎn)錄因子(HNF1、HNF3、HNF4、C/EBP、PPARα等)可結(jié)合于HBV基因組增強子或啟動子區(qū)域，并調(diào)控HBV的轉(zhuǎn)錄過程[9-11]。近年來，參與DNA甲基化和組蛋白修飾的宿主因子在cccDNA轉(zhuǎn)錄活性中的作用逐漸被揭示。研究[12]表明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、DNMT2、DNMT3)通過作用于HBV基因組中的CpG島導(dǎo)致cccDNA高度甲基化，抑制其轉(zhuǎn)錄活性；組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶p300、CBP、HAT1等可增加 cccDNA組蛋白乙酰化水平，增強cccDNA轉(zhuǎn)錄活性，相反，組蛋白去乙?；窰DAC1、HDAC11則降低cccDNA組蛋白乙酰化水平并抑制其轉(zhuǎn)錄活性[13-14]；除此之外，多種蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶如SETDB1、PRMT1、PRMT5等也被證實通過調(diào)控cccDNA組蛋白甲基化水平增強或減弱cccDNA轉(zhuǎn)錄功能[15-16]。本課題組也發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；窼IRT3可協(xié)同組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETD1A和SUV39H1抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄[17]。近年來，隨著高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)的進步，巴豆?；?、琥珀?；?、丙?；⒈；?、丁酰化等多種新型組蛋白修飾類型相繼被發(fā)現(xiàn)[18-22]。這些發(fā)現(xiàn)為進一步拓展對cccDNA微染色體表觀遺傳修飾類型的認識提供了依據(jù)，同時也將為發(fā)展表觀遺傳治療等新型抗病毒策略奠定基礎(chǔ)。

隨著對宿主因子在cccDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控中作用的認識逐漸深入，病毒蛋白HBx也被證實對cccDNA轉(zhuǎn)錄的起始和維持發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究[23]表明，當HBx存在時，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶PCAF/GCN5和CBP/p300被募集到cccDNA，而蛋白去乙?；窰DAC1和SIRT1與cccDNA的結(jié)合減少，激活cccDNA的轉(zhuǎn)錄；HBx缺失時，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1和PRMT1等結(jié)合到cccDNA，并導(dǎo)致cccDNA轉(zhuǎn)錄活性下降[24]。此外，HBx也可增加宿主限制因子Smc5/6、STIM1、ZEB2和PSME4的泛素化水平，誘導(dǎo)其降解，從而增強cccDNA轉(zhuǎn)錄活性[25-26]。這些研究發(fā)現(xiàn)提示，靶向宿主因子和病毒蛋白HBx是失活cccDNA轉(zhuǎn)錄功能的重要策略，同時也為提高乙型肝炎功能性治愈率提供潛在的研究方向。

1.3 cccDNA的降解機制 除上述cccDNA合成與轉(zhuǎn)錄外，cccDNA降解是另一個影響CHB治愈的重要因素。HBV cccDNA半衰期是評估cccDNA降解的重要指標，但目前cccDNA的半衰期尚無定論。基于土撥鼠和鴨HBV感染模型的研究[27-28]提示，cccDNA的半衰期為33 d和57 d；盡管在靈長類動物黑猩猩上的研究[29]發(fā)現(xiàn)，急性感染時cccDNA半衰期約為3 d，但仍有少量cccDNA可持續(xù)數(shù)年。遺憾的是，目前尚無法獲悉人感染肝細胞中單個cccDNA分子確切的生命周期。早期有數(shù)學模型推算在核苷和核苷酸類藥物持續(xù)治療下，機體完全清除肝內(nèi)cccDNA至少需15年[30]；而Huang等[31]一項研究推測肝內(nèi)cccDNA的半衰期在6個月左右。

解析cccDNA的降解機制，對于設(shè)計和評估抗病毒治療策略十分重要。但目前對于cccDNA降解機制認識十分有限。2014年的一項研究[32]首次報道了胞苷脫氨酶APOBEC3A在促進cccDNA降解中的作用。2021年德國的研究者[33]進一步發(fā)現(xiàn)，干擾素刺激蛋白20與APOBEC3A協(xié)同作用，可有效降解HBV cccDNA。同時，本團隊的研究[34]發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶UBE2L3通過泛素-蛋白酶體途徑加速APOPEC3A的降解，從而有利于維持HBV cccDNA高穩(wěn)定性。上述研究充分說明了胞苷脫氨酶APOBEC3A在cccDNA降解中的重要作用。但其他調(diào)控cccDNA降解的分子機制尚需探索，解析cccDNA降解機制仍是目前亟待解決的難點。

2 靶向cccDNA的藥物研發(fā)進展

隨著對cccDNA形成、轉(zhuǎn)錄和降解3個重要生物學過程調(diào)控機制的認識加深，以靶向清除cccDNA為目標的抗病毒治療策略也日益增多。靶向HBV cccDNA的治療策略被認為是最有可能清除HBV的手段。

2.1 抑制cccDNA形成藥物研發(fā)進展 從理論上講，抑制cccDNA形成的方式有兩種，即阻斷HBV感染和抑制rcDNA修復(fù)形成cccDNA。在病毒復(fù)制周期中，HBV通過表面preS1與肝細胞特異性受體NTCP結(jié)合進入肝細胞?；诖颂匦裕琈YR Pharma公司等研發(fā)了一種合成肽Myrcludex B，通過與HBV preS1競爭性結(jié)合NTCP，從而阻斷HBV感染肝細胞[35]。此類通過靶向NTCP阻斷HBV感染從而抑制cccDNA形成的藥物還有hzVSF(Ⅱ期)、A2342(臨床前)等。目前，Myrcludex B已經(jīng)進Ⅱb期臨床試驗，其臨床主要針對HBeAg陰性CHB患者，共納入40例，每日使用1次Myrcludex B，皮下注射0.5、1、2、5、10 mg治療12周(每種劑量8例受試者)。臨床數(shù)據(jù)顯示Myrcludex B耐受性良好，并觀察到8例接受10 mg Myrcludex B治療的患者中有6例(75%)在第12周出現(xiàn)HBV DNA下降>1 log10，40例患者中有22例(55%)ALT恢復(fù)正常。盡管Myrcludex B是一個很有希望的新型抗乙型肝炎藥物，但仍存在幾點問題有待進一步解決：(1)Myrcludex B只能抑制HBV再感染，而對已感染肝細胞中的cccDNA沒有影響，肝人源化小鼠模型中顯示一旦停用Myrcludex B，HBV復(fù)制出現(xiàn)反彈[36]。(2)研究[37]發(fā)現(xiàn)HepG2細胞模型中NTCP S267F突變會導(dǎo)致肝細胞對HBV易感性喪失，同時基因分析發(fā)現(xiàn)部分CHB患者為NTCP S267F變體純合子[38-39]。以上數(shù)據(jù)提示NTCP可能不是HBV感染的唯一途徑，針對NTCP的治療策略可能無法完全阻斷HBV感染。(3)NTCP的正常生理功能是運輸膽汁酸，Myrcludex B并不能將病毒進入的抑制與膽汁酸轉(zhuǎn)運的抑制完全分離，長期治療可能會對患者產(chǎn)生不同程度的副作用。

值得一提的是李文輝教授團隊研發(fā)出全人源性單克隆抗體HH-003。該藥物直接靶向HBV表面大包膜蛋白的前S1(PreS1)區(qū)，阻斷病毒與受體NTCP結(jié)合。一項基于64例慢性HBV感染者的 Ⅰ b期臨床試驗中，未觀察到與藥物相關(guān)的嚴重不良事件以及與藥物相關(guān)的3級及以上不良事件。該藥物目前已進入Ⅱ 期臨床試驗，HH-003抗病毒活性、安全性和藥代動力學等，有待進一步評估。

而在抑制rcDNA修復(fù)形成cccDNA這一策略中，目前研究發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)構(gòu)相關(guān)的二取代磺酰胺類(DSS)藥物CCC-0975和CCC-0346能有效干擾rcDNA轉(zhuǎn)化為cccDNA，從而阻斷cccDNA形成[40]。但是該類藥物抗病毒效能僅在培養(yǎng)細胞和原代鴨肝細胞中進行了驗證。

2.2 失活cccDNA新藥研發(fā)進展 RNAi是一種利用小分子雙鏈RNA特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA，從而關(guān)閉靶基因表達的技術(shù)[41]，是目前全球用于開發(fā)乙型肝炎創(chuàng)新藥物技術(shù)之一。siRNA通過和HBV RNA相互作用，從而促進HBV所有轉(zhuǎn)錄本的降解?，F(xiàn)有多項采用RNAi技術(shù)的新藥進入人體臨床試驗。ARO HBV(JNJ-3989)是由Arrowhead與Janssen Pharmaceuticals公司共同開發(fā)用于CHB治療的RNAi療法藥物。該藥物由兩種靶向HBV RNA的siRNA組成并經(jīng)N-乙酰半乳糖胺修飾，通過與脫唾液酸糖蛋白受體結(jié)合進入肝細胞，誘導(dǎo)HBV RNA降解，實現(xiàn)失活cccDNA的目標。目前JNJ-3989已經(jīng)完成Ⅱa期臨床試驗，其納入40例CHB患者。受試者在使用核苷類藥物的基礎(chǔ)上，需接受3次皮下注射JNJ-3989，注射劑量分別為100 mg(n=8)、200 mg(n=8)、300 mg(n=16)或400 mg(n=8)，每4周用藥1次。研究結(jié)果顯示，JNJ-3989聯(lián)合核苷類藥物治療使39例患者實現(xiàn)了>1 log10IU/mL的HBsAg降低，且在392 d的試驗過程中，未報告嚴重的不良事件或終止治療事件。此外，目前在研的RNAi藥物還有VIR-2218(Ⅱ期)、RG6346(Ⅱ期)、AB729(Ⅱ期)、RBD1016(Ⅰ期)和BB-103(臨床前)等。但基于RNAi技術(shù)藥物研發(fā)有以下幾點值得注意。(1)靶向性：siRNA不具備對肝組織或細胞的靶向能力，且穿透細胞膜的能力極差。(2)穩(wěn)定性：siRNA在人體循環(huán)系統(tǒng)中易被血液核酸酶降解，穩(wěn)定性較差。(3)脫靶效應(yīng)：siRNA可能依靠部分堿基與非靶基因結(jié)合，從而誘發(fā)與靶基因無關(guān)的脫靶效應(yīng)。如果以上技術(shù)障礙取得突破，將推動RNAi藥物更快地走向臨床。

病毒蛋白HBx在啟動和維持cccDNA轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此靶向HBx蛋白是實現(xiàn)cccDNA轉(zhuǎn)錄關(guān)閉的重要手段，而以HBx為靶點的藥物研發(fā)近年也在不斷進展。EYP001(Vonafexor)是ENYO Pharma公司研發(fā)的非膽汁酸第二代FXR激動劑，數(shù)據(jù)顯示Vonafexor通過干擾核受體FXR與HBx的相互作用從而有效抑制HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄。其Ⅱb期的臨床結(jié)果顯示，EYP001聯(lián)合聚乙二醇干擾素治療CHB患者16周后，HBsAg平均降低≥1 log10。本課題組也發(fā)現(xiàn)雙香豆素可靶向HBx并促進其降解，進而顯著抑制HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄，并在HBV感染細胞和小鼠模型中展現(xiàn)了較好的抗病毒效果，但目前尚缺乏臨床研究數(shù)據(jù)[42]。

2.3 誘導(dǎo)cccDNA降解藥物研發(fā)進展 除抑制cccDNA形成或失活cccDNA的藥物研發(fā)外，通過細胞因子介導(dǎo)或基因編輯技術(shù)等誘導(dǎo)cccDNA降解也被認為是HBV新藥發(fā)展的重要方向。研究[43]發(fā)現(xiàn)淋巴毒素-β受體(LTβR)激動劑可刺激肝細胞內(nèi)APOBEC3B的表達，并通過誘導(dǎo)cccDNA脫氨基觸發(fā)其非細胞溶解性降解，且在停止藥物處理后仍具有抑制病毒的作用。但LTβR激動劑僅在HBV感染肝細胞和小鼠模型上進行了驗證，其抗病毒作用仍然需要長期的臨床試驗去進一步證實。

基因編輯技術(shù)既可通過對cccDNA引入插入或缺失突變導(dǎo)致HBV病毒蛋白異常表達從而影響病毒復(fù)制，同時也可誘導(dǎo)部分cccDNA降解實現(xiàn)cccDNA的清除?；谛蛄刑禺愋院怂崦傅幕蚓庉嫹椒ㄒ驯谎芯繎?yīng)用于治療病毒感染。PBGENE-HBV是Precision BioSciences開發(fā)的一種利用ARC核酸酶靶向HBV cccDNA的基因編輯藥物，其通過脂質(zhì)納米顆粒傳遞至肝細胞并靶向cccDNA。臨床前研究數(shù)據(jù)顯示PBGENE-HBV可有效降解HBV感染的原代人肝細胞中的cccDNA，其有效率達75%，并伴隨HBsAg水平的降低。小鼠實驗也顯示，單次給藥后，PBGENE-HBV可對70%的HBV DNA靶標進行編輯。類似的基于基因編輯的藥物還有EBT107、Undisclosed等，均處于臨床前研究階段。雖然基因編輯藥物研發(fā)是一個高度活躍的研究領(lǐng)域，但也存在一些風險和限制，首先基因編輯系統(tǒng)對目標基因識別不是絕對特異性的，通過對基因編輯技術(shù)處理過的細胞進行基因組深度測序，可以明顯觀察到脫靶效應(yīng)[44]；其次暫沒有研究證明基因編輯技術(shù)可有效識別整合線性HBV DNA和游離的cccDNA，如果整合在染色體上的HBV DNA被切割，將極大可能導(dǎo)致宿主細胞染色體受損；此外，基因編輯治療的選擇壓力會導(dǎo)致HBV產(chǎn)生耐藥突變，因此應(yīng)針對cccDNA設(shè)計多個編輯靶點，以盡量減少耐藥變體的出現(xiàn)[45]。

3 小結(jié)與展望

尋找清除或失活cccDNA的最終方案，是一個系統(tǒng)問題，既涉及基礎(chǔ)科學問題，也涉及臨床問題。目前，HBV cccDNA研究仍面臨許多挑戰(zhàn)，包括：(1)HBV具有宿主特異性，目前仍缺少理想的研究cccDNA的細胞和動物模型。(2)cccDNA數(shù)量少，且易受rcDNA的干擾，目前尚缺乏標準的高敏感性cccDNA檢測方法。(3)缺乏可直接表征cccDNA功能狀態(tài)的新方法與新模型。(4)發(fā)展靶向失活或清除cccDNA的策略，有利于最終治愈HBV感染，但關(guān)于cccDNA活性調(diào)控和清除的機制目前尚未完全闡明。(5)臨床上，迫切需要能夠指示肝內(nèi)cccDNA活性的新型血清標志物。(6)結(jié)合免疫治療的多途徑、多靶點藥物聯(lián)合阻斷HBV的生物學合成并促進cccDNA清除將可能成為治愈CHB的重要途徑。但是新型免疫治療策略能否重建HBV特異性T淋巴細胞功能，并有效清除或失活cccDNA，也需要進一步明確。圍繞以上諸多問題的多維度研究，將為尋找清除或失活HBV cccDNA的最終方案奠定基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：陳娟負責收集資料并撰寫文章；黃愛龍負責文稿修訂并最終定稿。