體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元的研究進(jìn)展

鄭媛媛綜述，翁曉濱，王躍嗣審校

0 引 言

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種以運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)癥狀為特征的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，主要病理表現(xiàn)為黑質(zhì)紋狀體中多巴胺能神經(jīng)元的喪失，其典型臨床癥狀為運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、震顫及一系列自主神經(jīng)、認(rèn)知功能障礙等[1]。當(dāng)前PD的治療措施包括藥物及手術(shù)治療，藥物治療(如左旋多巴制劑)可通過補(bǔ)充多巴胺(Dopamine，DA)進(jìn)而有效緩解PD患者的運(yùn)動(dòng)功能，但藥物療效隨疾病進(jìn)展而消失[2]。目前，深部腦刺激(deep brain stimulation，DBS)是治療PD的最常見和有效的手術(shù)方法，可改善PD的運(yùn)動(dòng)障礙，但DBS不能阻止步態(tài)/平衡障礙和癡呆的進(jìn)展[3]。目前，基于干細(xì)胞生物學(xué)蓬勃發(fā)展，細(xì)胞替代療法應(yīng)運(yùn)而生。細(xì)胞替代療法是指將細(xì)胞直接作為藥物，并通過運(yùn)用細(xì)胞移植技術(shù)，將有功能的正常細(xì)胞替代病變細(xì)胞或衰老死亡的細(xì)胞，從而達(dá)到對多種疾病進(jìn)行治療的目的，相關(guān)基礎(chǔ)研究、臨床試驗(yàn)和部分細(xì)胞藥物已經(jīng)取得巨大治療進(jìn)展。因此，通過移植細(xì)胞來替代受損的DA神經(jīng)元在治療PD癥狀方面具有巨大潛力[4]。

細(xì)胞重編程作為一種新技術(shù)，為治療PD提供了新的方向，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用和發(fā)展前景。能將分化細(xì)胞的基因組從一種細(xì)胞類型表達(dá)譜轉(zhuǎn)化為另一種類型表達(dá)譜。研究證明通過在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的條件下引入四種因子OCT3/4、SOX2、C-MYC和KLF4，能夠?qū)⑿∈笈咛セ虺审w的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞[5]。2007年，Yu等[6]通過轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的OCT3/4、SOX2、KLF4和C-MYC或慢病毒介導(dǎo)的四種因子OCT4、SOX2、NANOG和LIN28在人體皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，成功生成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。iPSCs能夠避免免疫系統(tǒng)對異體干細(xì)胞的排斥，因此在細(xì)胞治療與再生醫(yī)學(xué)等方面具備重要的發(fā)展前景[7]。然而，iPSCs衍生的神經(jīng)干細(xì)胞和多巴胺神經(jīng)元可能含有一些殘留的未分化細(xì)胞和外源腫瘤相關(guān)基因整合，因此iPSC治療PD可能存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)[8]。細(xì)胞直接重編程技術(shù)，也叫細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[9]，是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一項(xiàng)新技術(shù)，可使一種成熟細(xì)胞在所需組織中原位轉(zhuǎn)化為另一種成熟細(xì)胞，不需經(jīng)過誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(induced neural stem cells，iNSCs)或iPSCs的過程，能夠克服iPSCs治療PD的局限性。體細(xì)胞直接重編程主要通過不同的表觀遺傳修飾改變原始細(xì)胞譜系特異性基因的表達(dá)，而不改變基因組序列[4]。本文主要闡述iPSCs和iNSCs治療PD的局限性，總結(jié)體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)直接重編程為誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元(induced dopamine neurons，iDNs)的方法，并探討體細(xì)胞直接重編程為iDNs的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 iPSCs治療PD的局限性

iPSCs具備無限自我更新能力，能夠誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞類型[10]，其被廣泛應(yīng)用于疾病造模和移植治療等方面[11]。研究證明通過在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的條件下引入四種因子OCT3/4、SOX2、C-MYC和KLF4，能夠?qū)⑿∈笈咛セ虺审w的成纖維細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞[5]。2007年，Takahashi等[12]又利用上述4種轉(zhuǎn)錄因子將人成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs，因此能為患者提供個(gè)性化的治療干細(xì)胞。隨著研究的不斷深入，科研人員通過非病毒方法也產(chǎn)生了iPSCs，奠定了其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)[13]。

盡管iPSCs治療PD已經(jīng)進(jìn)入早期臨床實(shí)驗(yàn)階段，但目前依舊存在諸多問題，仍需對其進(jìn)行優(yōu)化和解決。第一，致瘤性。因?yàn)閕PSCs的增殖能力，形成腫瘤的幾率很高[14]。Yamashita等[15]證明未分化的iPSCs具有較高的致瘤性；第二，異質(zhì)性。Samata等[16]表明人iPSCs在產(chǎn)生過程中，存在轉(zhuǎn)染的不均一性，不可避免的含有異質(zhì)性細(xì)胞；第三，分化的不確定性。由于iPSCs的分化機(jī)制尚待研究，導(dǎo)致產(chǎn)生iPSCs的效率較低，細(xì)胞純度不夠，往往需通過再次增殖，但是在增殖過程中其分化過程具有不確定性[17]；第四，基因突變。iPSCs能夠進(jìn)行自體細(xì)胞移植，但所需的成本和時(shí)間在很大程度上阻礙了基于患者特異性iPSCs方法的使用，且來自PD患者的自體iPSCs，可能含有影響移植治療預(yù)后的致病基因突變[18-19]。

2 iNSCs治療PD的局限性

iNSCs可進(jìn)行自我更新和多向分化[20]，由成體細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞重編程過程獲得。2014年，Monni等[21]將人胎兒NSCs移植到大鼠6-羥基多巴胺(6-OHDA)損傷的大腦中，可以緩解動(dòng)物模型PD大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，并發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞在宿主大腦中存活。研究表明將小鼠的成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為iNSCs后，將iNSCs移植到小鼠6-OHDA病變部位，移植的iNSCs分化為iDNs并遷移到6-OHDA損傷小鼠的黑質(zhì)中，能夠改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)缺陷[22]。

雖然相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明移植iNSCs可以緩解PD的運(yùn)動(dòng)行為，但仍存在局限性，包括倫理、體內(nèi)追蹤iNSCs的困難等方面的問題[14]。并且目前尚不清楚iNSCs是否能產(chǎn)生適應(yīng)病理環(huán)境的功能性神經(jīng)元，誘導(dǎo)過程中是否導(dǎo)致神經(jīng)元中其它關(guān)鍵神經(jīng)元基因的異常表達(dá)[23]。此外，還需驗(yàn)證經(jīng)體外重編程獲得的細(xì)胞能否在體內(nèi)存活，并發(fā)揮其正確的生理功能等[23]。

3 體細(xì)胞直接重編程為iDNs

細(xì)胞直接重編程技術(shù)，可使細(xì)胞在所需組織中原位轉(zhuǎn)化，而無需經(jīng)過中間的多能狀態(tài)。轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞表現(xiàn)出與多能細(xì)胞及其體細(xì)胞分化而來的細(xì)胞相同的功能，在體內(nèi)移植后也不顯示致瘤性[24]，且效率更高，為治愈PD方面帶來新曙光。現(xiàn)在有多種細(xì)胞類型可以誘導(dǎo)分化形成iDNs，最常見的有成纖維細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。

3.1成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs

3.1.1 利用轉(zhuǎn)錄因子將成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs2011年，Pfisterer等[25]通過在慢病毒載體中過表達(dá)三種轉(zhuǎn)錄因子ASCL1、BRN2和MYT1L與兩個(gè)基因FOXA2和LMX1A，首次將人胚胎和出生后成纖維細(xì)胞直接重編程為功能性iDNs，但效率較低，TH+的iDNs只占Tuj1+的神經(jīng)元總數(shù)的10%左右。2011年，Caiazzo等[26]表明3種轉(zhuǎn)錄因子ASCL1、NURR1和LMX1A能夠?qū)⑿∈蠛腿祟惓衫w維細(xì)胞直接重新編程為功能性iDNs，TH+的iDNs占Tuj1+的神經(jīng)元總數(shù)的80%，其釋放DA并表現(xiàn)出規(guī)律的電活動(dòng)。然而，在這些研究中，重編程iDNs的基因表達(dá)譜與原有中腦iDNs存在不同[27]。2011年，Kim等[27]通過6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子LMX1A、NURR1、FOXA2、EN1、ASCL1、PITX3以及兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子SHH和FGF8組合，將小鼠尾尖的成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs，將其移植入PD小鼠模型中可以改善動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)缺陷。2014年，Hong等[28]通過兩種轉(zhuǎn)錄因子ASCL1和NURR1以及兩種神經(jīng)營養(yǎng)因子SHH和FGF8b的組合，將小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs，iDNs的重編程效率約為(33±0.62%)。2015年，Zheng等[29]通過利用3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子BRN2、SOX2和FOXA2，將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人類成纖維細(xì)胞直接重編程為多巴胺能前體(DPs)，移植結(jié)果表明，DPs分化為iDNs，并緩解了PD小鼠模型的運(yùn)動(dòng)缺陷，在小鼠大腦中未檢測到腫瘤。以上研究結(jié)果顯示，利用轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)⑿∈蠛腿祟惖某衫w維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為功能性iDNs，其移植到動(dòng)物模型中能長期存活，且能改善動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)癥狀。

3.1.2利用小分子和細(xì)胞因子將成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs小分子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程不會使基因組受到破壞，其可使體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為其他種類的細(xì)胞[30]。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)特定的小分子可代替轉(zhuǎn)錄因子，使用方便快捷，且小分子無載體，可避免從病毒載體引入轉(zhuǎn)基因，其安全性較高，研究者可通過精確調(diào)整小分子的最佳濃度以提供最佳的效果[31]。2020年，Qin等[32]利用小分子和細(xì)胞因子的組合，即丙戊酸(valproic acid，VPA)，Respox，kenpaullon，forskolin，Y-27632，purmorphamine，SHH和雞尾酒(FGF-8b，bFGF，Wnt1及Wnt5a)，成功將人成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs樣細(xì)胞，而無需轉(zhuǎn)染外源基因，且該細(xì)胞表現(xiàn)iDNs樣形態(tài)和標(biāo)記物，并具有神經(jīng)元的電生理特性。其研究結(jié)果顯示，大約87.9%的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為TUJ1+/TH+神經(jīng)元，表明在小分子和細(xì)胞因子誘導(dǎo)后可能產(chǎn)生高產(chǎn)量的DA神經(jīng)元樣細(xì)胞。與將體細(xì)胞重編程為iPSCs再誘導(dǎo)分化為iDNs的方法相比，利用小分子和細(xì)胞因子將人成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs的方法簡單且效率高。綜上所述，通過利用小分子和細(xì)胞因子直接重編程產(chǎn)生iDNs的方法，避開轉(zhuǎn)錄因子對基因組的整合，為治療PD帶來新進(jìn)展。

3.1.3利用轉(zhuǎn)錄因子和小分子將成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs2014年，Pereira等[33]使用轉(zhuǎn)錄因子ASCL1、BRN2、MYT1L、LMX1A、LMX1B、FOXA2、OTX2與小分子化合物(CHIR99021、SB431542、Noggin、LDN193189)的組合，有效地將人胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為特定的iDNs，表達(dá)TH的神經(jīng)元的平均數(shù)量為(503.4±205.5)。轉(zhuǎn)錄因子與小分子的結(jié)合可減少直接重編程所需轉(zhuǎn)錄因子基因的數(shù)量，并且可降低將外源基因整合到體細(xì)胞染色體中而引起的基因突變和致瘤性的潛在風(fēng)險(xiǎn)[34]。

3.1.4利用miRNA和轉(zhuǎn)錄因子將成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNsmiRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，其可作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子[35]。其在大腦發(fā)育方面有著至關(guān)重要的作用，如神經(jīng)形成、神經(jīng)元成熟、突觸形成、軸突導(dǎo)向和神經(jīng)元可塑性[36]。miRNA不改變基因組且不引發(fā)致瘤性，其進(jìn)行細(xì)胞重編程時(shí)不存在小分子化合物的毒性和外源基因的參與。既往研究證明，miRNA的特異性缺失，導(dǎo)致中腦iDNs進(jìn)行性丟失[37]，證明miRNA在中腦iDNs形成、存活和功能中起關(guān)鍵作用。研究證明，使用兩種轉(zhuǎn)錄因子(MYT1L和BRN2)與miR-124相結(jié)合，有可能將人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元，盡管這些神經(jīng)元具有功能性，但它們的亞型并未明確定義[38]。Jiang等[39]將三種轉(zhuǎn)錄因子ASCL1、NURR1、LMX1A與miR124和p53-shRNA結(jié)合，協(xié)同抑制p53并誘導(dǎo)人胚胎肺成纖維細(xì)胞生成iDNs，其結(jié)果表明抑制p53可以使細(xì)胞周期停滯在G1期，可顯著提高人成纖維細(xì)胞向iDNs的轉(zhuǎn)化，Tuj1+神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化效率從17.9%提高到31.1%，TH+神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到15.4%。Gregorio等[36]使用miR-34b/c結(jié)合兩種轉(zhuǎn)錄因子ASCL1、NURR1可將成纖維細(xì)胞直接重編程為iDNs，其與人類中腦DA神經(jīng)元的電生理特性一致，效率為19.5%。結(jié)果表明miR-34b/c可調(diào)節(jié)Wnt1信號通路的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期退出并誘導(dǎo)DA分化，miR-34b/c使轉(zhuǎn)分化的效率加倍。因此，miRNA與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子具備聯(lián)合作用，可增強(qiáng)iDNs體外生成的能力。

3.2星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為iDNs

3.2.1 利用miRNA和轉(zhuǎn)錄因子將星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為iDNs2017年，Romanov等[40]將miR218和三種轉(zhuǎn)錄因子ASCL1、NEUROD1、LMX1A聯(lián)合使用，將體外人類星形膠質(zhì)細(xì)胞和體內(nèi)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為iDNs，重編程效率高達(dá)16%。其能表達(dá)中腦特異性轉(zhuǎn)錄因子和典型DA標(biāo)記物，可緩解PD小鼠的步態(tài)障礙。將星形膠質(zhì)細(xì)胞在PD小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)分化為功能性iDNs，而不需要經(jīng)過細(xì)胞移植，因此生成功能性iDNs的過程得到簡化[41]。

3.2.2利用CRISPR-CasRx系統(tǒng)將星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為iDNsCRISPR-CasRx基因編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)改變了修飾核酸的能力，CRISPR/Cas13系統(tǒng)已被用于靶向RNA[42]。研究表明，在動(dòng)物模型PD小鼠體內(nèi)利用CRISPR-CasRx系統(tǒng)敲降PTBP1，可將星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為iDNs且效率高，并減輕了PD小鼠模型中的運(yùn)動(dòng)缺陷[43]。CasRx是Cas13d家族的成員，其表現(xiàn)出較高的效率以及靶向特異性，并顯示出巨大的治療潛力[44-45]。相比于利用轉(zhuǎn)錄因子直接重編程的方法，該技術(shù)可提高直接重編程的效率；相比于敲降RNA的方法，該技術(shù)可顯著降低脫靶效應(yīng)；CasRx不會引起DNA的改變且安全性更高[43]。

3.2.3利用敲降RNA結(jié)合蛋白PTB將星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為iDNs2020年，F(xiàn)u等[46]證明在PD模型小鼠的中腦敲降RNA結(jié)合蛋白PTB，可將小鼠和人類的星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為iDNs，重建黑質(zhì)-紋狀體回路，并可有效恢復(fù)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。然而，2021年，Wang等[47]證明了體內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞不能通過過表達(dá)NEUROD1或敲降PTBP1直接重編程為神經(jīng)元，其直接重編程的神經(jīng)元實(shí)際上是大腦的內(nèi)源性神經(jīng)元。因此，對星形膠質(zhì)細(xì)胞通過敲降或過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子重編程為iDNs有待進(jìn)一步研究。

4 體細(xì)胞直接重編程為iDNs的優(yōu)缺點(diǎn)

將體細(xì)胞直接重編程為iDNs具有以下幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：第一，相比于iPSCs，體細(xì)胞直接重編程為iDNs無需經(jīng)過中間的多能狀態(tài)，致瘤性降低；第二，與iPSCs相比，體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iDNs所需要的時(shí)間更短，效率更高[48]；第三，與iNSCs相比，體細(xì)胞可在PD小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)分化為iDNs，但沒有研究報(bào)道在PD小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)分化形成的iNSCs可誘導(dǎo)分化為iDNs；第四，可在患者體內(nèi)將自身體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iDNs，避免免疫排斥反應(yīng)[41]。

雖然將體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iDNs優(yōu)點(diǎn)居多，但目前仍存在以下問題：第一，將體細(xì)胞直接重編程獲得的iDNs不能持續(xù)保持其性狀，若提前結(jié)束重編程技術(shù)，iDNs會轉(zhuǎn)為其前性狀[49]；第二，經(jīng)體內(nèi)轉(zhuǎn)分化獲得的iDNs的安全問題沒有在人體內(nèi)驗(yàn)證[40]；第三，進(jìn)行人體內(nèi)iDNs重編程，需要開發(fā)特定于細(xì)胞類型的有效重編程方法，以選擇性的靶向所需細(xì)胞類別，同時(shí)避免可能對其它細(xì)胞造成損害[50]；第四，細(xì)胞已經(jīng)過有絲分裂，因此可用性有限[51]。

5 結(jié)語與展望

近年來，細(xì)胞重編程技術(shù)為治療神經(jīng)退行性疾病帶來新的期望。目前，應(yīng)用于PD治療的細(xì)胞主要有：iPSCs、iNSCs和iDNs。其中iPSCs治療PD的方法是最經(jīng)典的，但無法避免移植到大腦或其它器官后形成腫瘤等極端問題；iNSCs則具備自我更新及多向分化的能力，因而可提供充足的細(xì)胞來源，但存在體內(nèi)追蹤iNSCs的困難等問題；而iDNs治療PD無需經(jīng)過多能干細(xì)胞的中間過程，所需時(shí)間更短，效率更高，在體內(nèi)移植后也不顯示致瘤性等問題，可在患者體內(nèi)將自身體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iDNs，不存在免疫排斥反應(yīng)。利用體細(xì)胞直接重編程為iDNs來治療PD已成為科學(xué)發(fā)展的必然選擇。

體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)可通過利用轉(zhuǎn)錄因子、小分子、miRNA、CRISPR-CasRx系統(tǒng)等直接重編程為iDNs。但目前仍存在一些問題需要探討：首先，采用病毒轉(zhuǎn)染的方法可能出現(xiàn)基因整合及腫瘤發(fā)生；其次，雖然小分子不會引起基因整合，但小分子潛在的安全性問題有待研究，其臨床應(yīng)用是否會受限制目前尚不清楚；最后，將患者的體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iDNs后，將其注射入患者大腦內(nèi)可能出現(xiàn)安全問題。未來可對以下兩方面進(jìn)行研究：一是尋找安全有效的轉(zhuǎn)染方法，以期將直接重編程獲得的iDNs成功應(yīng)用于臨床；二是采用在體內(nèi)誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元原位再生的方法，改善將iDNs注射入患者大腦內(nèi)可能會存在的安全問題。這一系列問題一旦得到解決，體細(xì)胞直接重編程技術(shù)在PD治療中將具有不可估量的應(yīng)用價(jià)值。