場(chǎng)地實(shí)際重金屬?gòu)?fù)合污染土壤生態(tài)毒性效應(yīng)定量評(píng)價(jià)

馬喆，王美娥，姜瑢?zhuān)愋l(wèi)平

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，城市與區(qū)域國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)調(diào)整和經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)方式轉(zhuǎn)變，城鎮(zhèn)工業(yè)企業(yè)搬遷遺留場(chǎng)地的土壤污染問(wèn)題日益突出[1]。原環(huán)境保護(hù)部2014年調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)工業(yè)廢棄地點(diǎn)位超標(biāo)率為34.9%，主要涉及礦山開(kāi)采、有色金屬冶煉、電鍍、制革、化工生產(chǎn)和加工等行業(yè)[2]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，電鍍污染場(chǎng)地中鎘（Cd）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、銅（Cu）、鋅（Zn）和鎳（Ni）復(fù)合污染嚴(yán)重[3-4]。復(fù)合污染的聯(lián)合毒性效應(yīng)定量評(píng)價(jià)是污染土壤生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵內(nèi)容，尤其在場(chǎng)地風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，場(chǎng)地特異性（site-specific）是必須要考慮的重要因子。

目前對(duì)復(fù)合污染生態(tài)效應(yīng)的評(píng)價(jià)通常采用“自下而上”效應(yīng)評(píng)價(jià)（bottom-up evaluation）方法，即根據(jù)污染物的作用方式，基于單一污染物毒性數(shù)據(jù)，采用濃度加合模型（concentration addition, CA）、獨(dú)立作用模型（independent action, IA）或復(fù)合指數(shù)模型（combination index, CI）進(jìn)行毒性效應(yīng)定量估算。然而，這種方法需要大量毒性數(shù)據(jù)，并且由于毒性數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)大多來(lái)自實(shí)驗(yàn)室模擬試驗(yàn)，在外推到野外實(shí)際污染土壤中往往會(huì)出現(xiàn)數(shù)量級(jí)的誤差[5]。與之相比，“自上而下”效應(yīng)評(píng)價(jià)（top-down evaluation）方法通過(guò)原位污染土壤生物試驗(yàn)，結(jié)合生物致毒機(jī)理的分析，基于主導(dǎo)污染物識(shí)別結(jié)果，進(jìn)行基質(zhì)整體毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)，與實(shí)際土壤污染特征相關(guān)性較強(qiáng)，能夠符合場(chǎng)地風(fēng)險(xiǎn)中場(chǎng)地特異性的要求[6-7]。盡管如此，“自上而下”效應(yīng)評(píng)價(jià)方法由于較難定量估算復(fù)合污染聯(lián)合生態(tài)效應(yīng)，同時(shí)缺乏統(tǒng)一的分析程序，其實(shí)際應(yīng)用較少。

蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有分布廣、數(shù)量大和對(duì)污染物足夠敏感等特點(diǎn)，常被用作土壤污染物毒性評(píng)價(jià)的模式生物[8]。蚯蚓的污染物暴露通常是通過(guò)皮膚或者與皮膚相似的腸道暴露，暴露途徑簡(jiǎn)單，毒性效應(yīng)與蚯蚓體內(nèi)暴露及土壤環(huán)境暴露有關(guān)[9]，同時(shí)，蚯蚓體內(nèi)多種生物標(biāo)志物如丙二醛（MDA）、金屬硫蛋白（MT）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和還原型谷胱甘肽（GSH）等，與污染物暴露之間的脅迫-響應(yīng)關(guān)系明顯[10-13]。目前蚯蚓的毒理試驗(yàn)在場(chǎng)地土壤污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、污染物土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與基準(zhǔn)制定、污染場(chǎng)地修復(fù)效果評(píng)估等方面均有廣泛應(yīng)用[14]。

本研究耦合“自下而上”與“自上而下”2種方法，采用多元統(tǒng)計(jì)分析手段，構(gòu)建了既能夠進(jìn)行定量估算，又具有場(chǎng)地特異性的野外實(shí)際場(chǎng)地污染土壤的生態(tài)效應(yīng)定量評(píng)價(jià)方法。并以江蘇省某廢棄電鍍場(chǎng)地為研究對(duì)象，采用蚯蚓土壤微宇宙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行野外實(shí)際重金屬?gòu)?fù)合污染土壤的毒性效應(yīng)定量評(píng)價(jià)。本研究旨在建立一套統(tǒng)一的野外實(shí)際污染土壤生態(tài)效應(yīng)評(píng)價(jià)程序，為土壤污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 研究場(chǎng)地描述及土壤樣品采集

本研究土壤取自江蘇省某廢棄電鍍場(chǎng)地，該電鍍廠是長(zhǎng)三角地區(qū)典型的電鍍加工、金屬和非金屬表面處理企業(yè)，1985年建廠，包括電鍍車(chē)間、硝酸鋅生產(chǎn)車(chē)間及廢水處理池，2014年關(guān)停，廠區(qū)廢棄至今，現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境較差，廠區(qū)呈正方形，邊長(zhǎng)50 m，面積2 500 m2，土地利用類(lèi)型屬于建設(shè)用地。依據(jù)《建設(shè)用地土壤污染狀況調(diào)查技術(shù)導(dǎo)則》（HJ 25.1—2019）[15]，采用分區(qū)布點(diǎn)法，考慮場(chǎng)地功能分布，在電鍍車(chē)間、廢水處理池和硝酸銀生產(chǎn)車(chē)間均布設(shè)樣點(diǎn)，選取不同重金屬污染程度的13個(gè)樣點(diǎn)（S1～S13）進(jìn)行研究。

每個(gè)土樣采用五點(diǎn)混合采樣法采集表層土壤（0～20 cm），將土壤樣品裝入自封袋中做好標(biāo)記帶回實(shí)驗(yàn)室。將帶回實(shí)驗(yàn)室的土樣置于干燥通風(fēng)處自然晾干，土樣去除石塊及植物根系等雜物后碾磨，分別過(guò)10目和100目尼龍篩備用。

1.2 蚯蚓毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)的受試蚯蚓為赤子愛(ài)勝蚓（Eiseniafoetida），購(gòu)自天津惠裕德生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)前先將蚯蚓在人工培養(yǎng)箱里預(yù)培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)箱溫度設(shè)為（20±1） ℃，濕度75%，光照20%。預(yù)培養(yǎng)后選取體質(zhì)量200～300 mg發(fā)育好具有明顯環(huán)帶的成蚓進(jìn)行微宇宙實(shí)驗(yàn)。

本研究采用室內(nèi)土壤微宇宙實(shí)驗(yàn)。首先取500 g干土，加入一定量的去離子水使其含水量為35%，混合均勻后放入塑料燒杯中。然后在每個(gè)燒杯中放置15條蚯蚓，用保鮮膜封口，將保鮮膜上扎幾個(gè)小孔，保證蚯蚓可正常呼吸同時(shí)減少土壤水分蒸發(fā)。將每個(gè)燒杯編號(hào)，放置于人工氣候箱中（培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為（20±1） ℃，濕度為75%，光照為20%，白天∶黑夜=12 h∶12 h。根據(jù)采集到的土壤量，實(shí)驗(yàn)共設(shè)置13個(gè)處理（S1～S13），每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)14 d后，隨機(jī)取出8～10條蚯蚓，經(jīng)24 h濾紙清腸洗凈后，測(cè)定蚯蚓體內(nèi)重金屬含量（干重）和酶活。本實(shí)驗(yàn)暴露過(guò)程中各土樣蚯蚓的存活率均在80%以上。

1.3 土壤理化性質(zhì)及重金屬含量分析

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤pH測(cè)定采用土水比1∶2.5混合后用pHS-3C型pH計(jì)（上海儀電，中國(guó)）測(cè)定[16]。土壤總有機(jī)碳采用鹽酸預(yù)處理后，用元素分析儀ElementarVario ELⅢ（Hanau，德國(guó)）直接測(cè)定[17]。土壤陽(yáng)離子交換量依據(jù)《土壤 陽(yáng)離子交換量的測(cè)定 三氯化六氨合鈷浸提-分光光度法》（HJ 889—2017）[18]測(cè)定。土壤重金屬有效態(tài)依據(jù)《土壤8種有效態(tài)元素的測(cè)定 二乙烯三胺五乙酸浸提-電感耦合等離子體發(fā)射光譜法》（HJ 804—2016）[19]，對(duì)2 mm風(fēng)干土采用二乙烯三胺五乙酸（DTPA）浸提法測(cè)定。

1.3.2 重金屬測(cè)定

土壤重金屬測(cè)定：土壤重金屬含量的測(cè)定采用HNO3-HF-HClO4-HCl四酸消解法[20]，采用ICP-MS（7500A，安捷倫，美國(guó)）測(cè)定樣品中Cd、Ni、Cr和Pb含量，采用ICP-OES（Optima 8300，珀金埃爾默，美國(guó)）測(cè)定樣品中Zn含量。每批樣品設(shè)置3個(gè)空白對(duì)照組、10%樣品的重復(fù)和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)土壤物質(zhì)GSS-27進(jìn)行質(zhì)量控制，回收率為83.0%～119%之間。

蚯蚓重金屬累積含量測(cè)定：將待測(cè)蚯蚓放入有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行24 h吐泥，后用去離子水沖洗干凈，冷凍干燥48 h，使用研缽磨碎后采用微波消解法（GB 5009.268—2016）[21]在微波消解儀（Multiwave PRO, Anton Paar，奧地利）中進(jìn)行消解，采用ICP-MS（7500A，安捷倫，美國(guó)）測(cè)定樣品中Cd、Ni、Cr、Pb和Zn含量。每批樣品設(shè)置3個(gè)空白對(duì)照組、10%樣品的重復(fù)和3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)豬肝GBW10051（GSB-29）進(jìn)行質(zhì)量控制，回收率為85.1%～123%之間。

1.4 蚯蚓生物標(biāo)志物響應(yīng)測(cè)定

取清腸后蚯蚓3～4條，稱(chēng)量質(zhì)量，液氮迅速冷凍，按照樣品質(zhì)量（g）∶緩沖液體積（mL）=1∶9的比例加入PBS緩沖液（pH=7.4），4 ℃冰浴下使用組織研磨器充分研磨，將研磨好的10%組織勻漿經(jīng)離心機(jī)2 000 r·min-1離心10～15 min，離心后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。

蚯蚓生物標(biāo)志物均使用試劑盒測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明進(jìn)行操作。總蛋白選用BCA法，SOD選用WST-1法，CAT選用可見(jiàn)光法，GSH選用微板法，MDA和MT選用酶聯(lián)免疫分析（ELISA法）?？偟鞍锥繙y(cè)定試劑盒（A045-3-2）、SOD測(cè)定試劑盒（A001-3-2）、CAT測(cè)定試劑盒（A007-1-1）和GSH測(cè)定試劑盒（A006-2-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所，昆蟲(chóng)MDA酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（CD92025）和昆蟲(chóng)MT酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（CD92144）購(gòu)自武漢純度生物有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 有效生物標(biāo)志物篩選

首先對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）檢驗(yàn)和Bartlett檢驗(yàn)，判斷對(duì)其進(jìn)行主成分分析（principal component analysis, PCA）的可行性。然后對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行多元分析，通過(guò)PCA分析和聚類(lèi)分析將不同樣點(diǎn)分成多個(gè)組，并通過(guò)相似性分析（analysis of similarities, ANOSIM）檢驗(yàn)分組是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最后，采用BVSTEP方法篩選有效生物標(biāo)志物，并對(duì)所篩選的有效生物標(biāo)志物與第一主成分進(jìn)行回歸分析，得到有效生物標(biāo)志物與蚯蚓健康狀況的關(guān)系。

1.5.2 主導(dǎo)污染物識(shí)別

采用典范對(duì)應(yīng)分析（canonical correspondence analysis, CCA）確定生物標(biāo)志物和污染物暴露指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系，采用方差膨脹因子法（variance inflation factor, VIF）對(duì)CCA建模中冗余環(huán)境因子進(jìn)行選擇[22]，最后根據(jù)CCA結(jié)果篩選出主導(dǎo)污染物。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析

本研究采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 24.0對(duì)土壤理化性質(zhì)和土壤重金屬含量進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)性描述，對(duì)蚯蚓生物標(biāo)志物進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA）；采用Origin 2018軟件對(duì)蚯蚓生物標(biāo)志物響應(yīng)進(jìn)行多元分析；采用R語(yǔ)言進(jìn)行ANOSIM分析和BVSTEP分析；采用Canoco5軟件進(jìn)行VIF和CCA分析；采用SPSS 24.0進(jìn)行多元回歸分析；采用Origin 2018軟件完成作圖。

2 結(jié)果與討論（Results and discussion）

2.1 土壤理化性質(zhì)及重金屬含量

如表1所示，13個(gè)場(chǎng)地土壤樣品的Cd、Cr、Cu、Ni、Pb和Zn等6種重金屬總量和DTPA提取態(tài)含量變異較大，變異系數(shù)分別為93.8%～309%和114%～315%之間，其中土壤Cd和Zn的總量及DTPA提取態(tài)含量均較高。土壤pH值和CEC的變異較小，有機(jī)質(zhì)含量整體較低，大多在1%以下。

表1 供試土壤關(guān)鍵理化性質(zhì)、重金屬總量和DTPA提取態(tài)含量Table 1 The total and DTPA extracted heavy metal concentration and the key physical-chemical properties of the tested soils

2.2 蚯蚓組織重金屬生物累積特征

蚯蚓組織重金屬生物累積特征如圖1所示，與以往研究結(jié)果一致[23-24]，蚯蚓對(duì)不同重金屬的吸收和富集能力不同，對(duì)6種重金屬的平均富集系數(shù)的大小順序?yàn)椋篊d>Cu>Zn>Ni>Pb>Cr。其中，Cu和Zn的富集系數(shù)接近，這一現(xiàn)象與多數(shù)報(bào)道結(jié)果[25-26]一致，這是因?yàn)镃u和Zn元素均為生物必需元素；Cr、Ni和Pb的生物富集系數(shù)之間的差異也較小，并且這3種元素與Cd、Cu和Zn相比均明顯較低，這主要是由于這3種元素在土壤中的生物有效性含量較低。同時(shí)，蚯蚓對(duì)Cd的BCF均值為4.00，而其他元素BCF均值均<1，這是因?yàn)橥寥乐蠧d具有較強(qiáng)的遷移性，易被蚯蚓吸收富集[27-28]。譬如，本研究中Cd的DTPA浸提率為7.71%～22.0%，明顯高于其他5種元素；并且蚯蚓能夠通過(guò)取食攝入和皮膚直接吸收2種方式吸收累積土壤中的Cd，對(duì)于其他元素，取食攝入與土壤成分結(jié)合的重金屬，是其進(jìn)入蚯蚓組織的最主要方式[29]。

此外，本研究采用了野外實(shí)際污染土壤，存在多金屬?gòu)?fù)合污染現(xiàn)象，復(fù)合污染元素之間的相互作用能夠影響生物的吸收和累積。Traudt等[30]在植物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，重金屬Ni、Cu和Cd復(fù)合污染下，植物L(fēng)emnaminor對(duì)這3種重金屬的吸收均存在競(jìng)爭(zhēng)作用，但是進(jìn)入植物組織內(nèi)以后只有Cu與Cd之間存在著競(jìng)爭(zhēng)作用。因此，在復(fù)合污染生態(tài)效應(yīng)評(píng)價(jià)中必須考慮污染物的生物累積特征。

2.3 有效生物標(biāo)志物篩選

對(duì)不同污染程度土壤樣品培養(yǎng)下的蚯蚓生物標(biāo)志物毒性響應(yīng)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表2所示，6種蚯蚓生物標(biāo)志物響應(yīng)均呈顯著差異（P<0.01）。對(duì)蚯蚓生物標(biāo)志物毒性響應(yīng)數(shù)據(jù)采用KMO檢驗(yàn)和Bartlett檢驗(yàn)，結(jié)果表明，KMO為0.503（>0.5）且Bartlett檢驗(yàn)顯著（P<0.01），表明該數(shù)據(jù)可以采用PCA進(jìn)行分析。PCA和聚類(lèi)分析結(jié)果（圖2（a））表明，PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為30.1%和23.6%；不同樣點(diǎn)土壤處理下生物標(biāo)志物響應(yīng)可以分為3個(gè)組，第1組（G1）包括S3、S7、S8和S9，第2組（G2）包括S2和S13，第3組（G3）包括S1、S4、S5、S6、S10、S11和S12。對(duì)分組結(jié)果進(jìn)行ANOSIM分析，結(jié)果表明3個(gè)分組的樣點(diǎn)之間存在顯著差異（P<0.01）。而對(duì)3個(gè)組之間土壤重金屬總量、DTPA提取態(tài)含量以及蚯蚓生物累積濃度之間的污染物生物體內(nèi)和體外暴露量進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，重金屬Cd和Zn在G1的3類(lèi)暴露指標(biāo)與G3相比均顯著較高（P<0.05），與G2相比升高程度不顯著；而其他的重金屬在3個(gè)組之間均無(wú)顯著差異（圖3）。因此可以認(rèn)為，在3個(gè)組的樣點(diǎn)土壤培養(yǎng)下蚯蚓健康狀況由好到差的次序如下：G3>G2>G1；PC1從左到右也因此體現(xiàn)了蚯蚓健康狀況由差至好的趨勢(shì)。

圖1 蚯蚓組織重金屬的生物累積量（a）和生物富集系數(shù)（BCF）（b）注：圖（a）中Cd、Cr、Cu、Ni和Pb采用左邊的縱坐標(biāo)，Zn采用右邊的縱坐標(biāo)。Fig. 1 The concentrations （a） and the bioconcentration factors （BCF） （b） of heavy metals in earthwormsNote: In Fig.（a）, Cd, Cr, Cu, Ni and Pb correspond to the ordinate on the left, and Zn corresponds to the ordinate on the right.

通過(guò)BVSTEP法進(jìn)行有效生物標(biāo)志物篩選，結(jié)果表明，GSH、MDA和CAT的組合與其他所有生物標(biāo)志物的組合顯著相關(guān)，因此，它們的組合可以視為所有生物標(biāo)志物響應(yīng)的最小數(shù)據(jù)集。通過(guò)3個(gè)有效生物標(biāo)志物響應(yīng)與主成分1（PC1）的回歸分析結(jié)果（圖2（b）～（d））發(fā)現(xiàn)，GSH和MDA含量隨著蚯蚓健康狀況的增加而顯著降低（P<0.01），而CAT活性隨著健康狀況的增加而顯著增加（P<0.01）。

2.4 土壤主導(dǎo)污染物識(shí)別

進(jìn)一步采用CCA分析生物標(biāo)志物響應(yīng)與土壤重金屬總量、DTPA提取態(tài)含量和蚯蚓重金屬生物累積量之間的相關(guān)性。采用VIF法對(duì)CCA建模中的冗余環(huán)境因子進(jìn)行選擇，結(jié)果表明只有DTPA-Cu和DTPA-Pb的VIF值>10（表3），說(shuō)明兩者之間存在顯著自相關(guān)關(guān)系（P<0.01），而土壤重金屬總量和蚯蚓生物累積量在6種重金屬之間不存在多種共線性。因此僅對(duì)土壤重金屬DTPA提取態(tài)含量與生物標(biāo)志物響應(yīng)的CCA分析中剔除了DTPA-Cu。CCA分析結(jié)果表明，首先，土壤重金屬總量對(duì)生物標(biāo)志物響應(yīng)變化的相關(guān)性顯著的為Cu、Cd、Zn和Pb元素，貢獻(xiàn)率分別為3.90%、54.0%、17.3%和11.8%；土壤重金屬DTPA提取態(tài)相關(guān)性顯著的元素為Cr、Cd和Zn元素，貢獻(xiàn)率分別為5.40%、53.8%和22.7%；蚯蚓生物累積重金屬相關(guān)性顯著的元素為Cd、Cu和Zn元素，貢獻(xiàn)率分別為41.1%、14.6%和28.2%（圖4）。

表2 不同重金屬污染程度的樣點(diǎn)土壤中蚯蚓生物標(biāo)志物響應(yīng)的方差分析Table 2 ANOVA of biomarker responses in earthworms treated with different levels of heavy metal contaminated site soil

圖2 蚯蚓生物標(biāo)志物響應(yīng)的多元分析注：（a） PCA結(jié)合聚類(lèi)分析；（b～d） 有效生物標(biāo)志物GSH、MDA、CAT與第一主成分之間的回歸分析結(jié)果。Fig. 2 Multivariate analysis of biomarkers responses of earthwormsNote: （a） Principal component analysis （PCA） superimposed with cluster analysis; （b）～（d） Regression analysis between each effective biomarkers GSH, MDA and CAT and the first principle factor.

圖3 不同樣點(diǎn)分組（G1、G2、G3）之間重金屬含量的比較注：（a） 土壤總量；（b） DTPA提取態(tài)含量；（c） 蚯蚓體內(nèi)生物累積量的比較。Fig. 3 Comparison in heavy metal concentrations among the three divided groups （G1, G2, G3）Note: （a） Soil total heavy metal concentrations; （b） DTPA-extracted heavy metal concentrations; （c） Earthworm bioaccumulation of heavy metal concentrations.

由此可見(jiàn)，重金屬Cd和Zn對(duì)生物標(biāo)志物響應(yīng)變化的貢獻(xiàn)率在3類(lèi)暴露方式下均較高，綜合以上3個(gè)組（G1、G2和G3）體內(nèi)和體外重金屬暴露量比較結(jié)果，可以認(rèn)為重金屬Cd和Zn為引起蚯蚓生物標(biāo)志物響應(yīng)變化的主導(dǎo)污染物。

2.5 重金屬?gòu)?fù)合污染對(duì)蚯蚓生物標(biāo)志物的毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)

對(duì)3類(lèi)特征生物標(biāo)志物響應(yīng)，即，GSH、MDA和CAT分別進(jìn)行與主導(dǎo)污染物Cd和Zn的土壤總量、DTPA提取態(tài)含量以及蚯蚓生物累積量的逐步回歸，結(jié)果如表4所示，蚯蚓GSH含量的變化與土壤Cd總量及Zn的DTPA提取態(tài)含量之間存在多元線性關(guān)系；蚯蚓MDA含量的變化能夠通過(guò)土壤Cd的DTPA提取態(tài)含量進(jìn)行預(yù)測(cè)；CAT活性的變化能夠通過(guò)Zn的土壤總量及蚯蚓生物累積含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。

由于蚯蚓的GSH含量和CAT活性的變化涉及2種類(lèi)型的污染物暴露，因此基于表4的回歸方程，進(jìn)一步采用CA模型來(lái)綜合計(jì)算2類(lèi)暴露的復(fù)合半效應(yīng)濃度[31]，結(jié)果如圖5所示。以蚯蚓組織GSH含量變化為毒性效應(yīng)終點(diǎn)的土壤Cd總量及Zn的DTPA提取態(tài)含量的復(fù)合半效應(yīng)濃度（EC50mix）在各個(gè)樣點(diǎn)均低于實(shí)測(cè)濃度（圖5（a））；以MDA含量變化為毒性效應(yīng)終點(diǎn)的EC50值在S3、S7、S8和S9等4個(gè)樣點(diǎn)低于實(shí)測(cè)值（圖5（b））；以蚯蚓組織CAT為毒性效應(yīng)終點(diǎn)的土壤Zn總量及蚯蚓生物累積含量的EC50mix值在S2、S3、S4、S7、S8、S9和S10等7個(gè)樣點(diǎn)低于實(shí)測(cè)值。以上結(jié)果一方面表明，3類(lèi)有效生物標(biāo)志物的敏感性從高到低的順序?yàn)椋篏SH>CAT>MDA。這3類(lèi)生物標(biāo)志物都與生物的抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，其中GSH作為一種含有巰基基團(tuán)的三肽，易與重金屬離子結(jié)合，減輕重金屬污染物對(duì)蚯蚓組織的損傷；此外，重金屬污染物會(huì)造成蚯蚓體內(nèi)活性氧（ROS）升高，GSH作為一種重要的還原劑底物，在清除ROS的生化反應(yīng)中起重要作用，并被氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）[12,32]。當(dāng)GSH消耗量突然増高導(dǎo)致其含量下降時(shí)，作為一種對(duì)環(huán)境污染的應(yīng)激機(jī)制，生物體會(huì)誘導(dǎo)合成更多的GSH作為反饋[33]。另一方面，從主成分分析及多元回歸分析的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，不同元素以及不同類(lèi)型暴露之間（如，與GSH含量變化對(duì)應(yīng)的土壤總Cd與DTPA-Zn），以及同一元素不同暴露之間（如，與CAT活性變化對(duì)應(yīng)的土壤總Zn與蚯蚓組織生物累積Zn）都有可能存在交互作用，而這些污染物暴露之間不存在暴露量變化的相關(guān)性。尤其是土壤總Zn與生物累積Zn之間，由于Zn元素對(duì)生物的獨(dú)特作用，導(dǎo)致蚯蚓的生物累積Zn與土壤總Zn含量之間的相關(guān)性不顯著，但是2類(lèi)暴露均與CAT活性變化有關(guān)。

表3 方差膨脹因子分析（VIF）Table 3 Variance inflation factor （VIF） analysis

圖4 蚯蚓生物標(biāo)志物響應(yīng)與土壤重金屬（a）、土壤DTPA提取態(tài)含量（b）和蚯蚓重金屬累積量（c）的CCA分析結(jié)果Fig. 4 CCA analysis of biomarkers responses of earthworms and the concentration of heavy metals （a）, the concentration of DTPA-extracted in soils （b）, and the concentration of heavy metals in earthworms （c）

表4 有效生物標(biāo)志物響應(yīng)與重金屬暴露的回歸方程Table 4 Regression equations between the responses of effective biomarkers and heavy metal exposures

圖5 主導(dǎo)污染物暴露的EC50值及其實(shí)測(cè)值的比較Fig. 5 Comparison of calculated EC50 and measured concentration of dominant heavy metals

綜上所述，本研究結(jié)果表明，針對(duì)野外實(shí)際土壤重金屬?gòu)?fù)合污染，采用多元統(tǒng)計(jì)分析手段，通過(guò)有效生物標(biāo)志物響應(yīng)、主導(dǎo)污染物的篩選以及聯(lián)合效應(yīng)估算，能夠?qū)崿F(xiàn)生態(tài)效應(yīng)的定量評(píng)價(jià)。