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    磷酸三(2-丁氧基乙基)酯及其代謝產物在大鼠體內的排泄動力學研究

    2022-11-22 06:34:44鄧臣劉云浪胡蓉陳建義王金玲齊秀娟申芝芝謝林伸蒙艷朱婷婷
    生態(tài)毒理學報 2022年4期
    關鍵詞:排泄量染毒母體

    鄧臣,劉云浪,胡蓉,陳建義,王金玲,齊秀娟,申芝芝,謝林伸,蒙艷,朱婷婷,*

    1. 深圳市環(huán)境科學研究院國家環(huán)境保護飲用水水源地管理技術重點實驗室,深圳市水環(huán)境中新型污染物檢測與控制重點實驗室,深圳 518001 2. 中國地質大學(武漢)環(huán)境學院,武漢 430074 3. 深圳市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站寶安分站,深圳 518001

    隨著全球逐步禁止使用溴系阻燃劑,新型有機磷系阻燃劑(organophosphate flame retardants, OPFRs)在國內外得到越來越廣泛的應用[1]。由于OPFRs主要以摻雜混合而非化學鍵合方式加入材料,且部分OPFRs具有半揮發(fā)性,較容易進入土壤、水和大氣環(huán)境中[2]。磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(tris(2-butoxyethyl) phosphate, TBOEP)是目前環(huán)境暴露的主要的OPFRs之一,在環(huán)境介質和生物體內廣泛檢出,含量最高可達mg·kg-1級別。如歐洲國家、新西蘭、科威特和中國北京的粉塵樣品TBOEP含量范圍為0.36~6 836 ng·g-1[3-7],珠江淡水魚樣本中檢測到的TBOEP濃度范圍則達1 647~8 840 ng·g-1[8]。

    目前TBOEP對生物的內分泌系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等以及遺傳和基因表達的影響逐漸成為當前TBOEP生物毒性研究的主要內容,其潛在毒性是目前的研究熱點。當前關于TBOEP的毒代實驗主要分為體內代謝和體外代謝實驗。體內實驗方面,V?lkel等[9]探究了人體單次口服給藥TBOEP后的毒代動力學。體外代謝的研究主要集中在細胞清除率、代謝物及其影響等方面,如經試驗觀察,TBOEP在干細胞的光滑線粒體的體外清除率存在物種差異,人類的體外代謝速率最快,魚類次之,最后是鳥類。當前有關于TBOEP的毒代動力學數(shù)據(jù)研究還比較缺乏,其研究對象樣本單一、暴露時間短,數(shù)據(jù)不足以探究其毒代動力學規(guī)律[10]。毒物排泄研究是構成毒代動力學的關鍵。為此,本研究以雄性SD大鼠為觀察對象,建立液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀測定尿液和糞便中TBOEP及其代謝物含量的方法,探究TBOEP及其代謝物在尿液、糞便中的排泄規(guī)律,為其毒代動力學研究提供參考。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 試劑與儀器

    磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(tris(2-butoxyethyl) phosphate, TBOEP)和雙(2-丁氧基乙基)-2-(3-羥丁氧基)乙基磷酸三酯(tris(2-(3-hydroxy)butoxyethyl) phosphate, 3-OH-TBOEP)標準品購于德國Dr. Ehrenstorfer公司。雙(2-丁氧基乙基)-2-羥基乙基磷酸三酯(bis(2-butoxyethyl)-(2-hydroxyethyl) phosphate, BBOEHEP)、雙(丁氧基乙基)磷酸酯(bis(2-butoxyethyl) phosphate, BBOEP)標準品和回收率指示物磷酸三正丁酯-d27(tri-n-butyl phophate-d27, TBP-d27)購于加拿大Toronto Research Chemicals Inc.公司。

    1260-6460液相色譜儀-三重四極桿串聯(lián)質譜儀(美國Agilent公司);固相萃取裝置(24位,CNW,中國);Milli-Q Direct8超純水儀(美國Millipore公司);微量注射器(1 000 μL、100 μL、10 mL,CNW);WAX Plus固相萃取柱(3 mg, OASIS,美國)。標準品、甲醇和乙腈(色譜純,默克,德國),甲酸、親水PTFE針式濾器(雙層膜)0.22 μm和1 mL無菌連針注射器均購于上海安譜實驗科技股份公司(中國)。

    1.2 實驗動物

    健康雄性SD大鼠42只,SPF級;體質量范圍為(100±25) g;動物來源于北京維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證及動物質量合格證號為11400700270978。實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境:溫度22~24 ℃,相對濕度60%~65%。

    1.3 實驗動物暴露劑量與染毒

    SD大鼠21只,雄性,分別置于21只代謝籠中,給藥前12 h禁食,不禁水,收集空白尿液、糞便。而后灌胃染毒,劑量為750 mg·kg-1TBOEP。

    1.4 取材

    染毒后,分別收集0~24 h、24~48 h、48~72 h、72~96 h、96~120 h、120~144 h和144~168 h的尿液和糞便,共設7個采樣時間段。

    1.5 樣品前處理

    1.5.1 樣品預處理

    新鮮尿液經采集后冰上運輸,送回實驗室-80 ℃冰箱保存。將尿液完全解凍后,取1 mL于特氟龍管中,加入標準替代物,使其濃度為50 ng·mL-1。

    新鮮糞便經采集后冰上運輸,送回實驗室-80 ℃冰箱保存。而后經冷凍干燥、研磨后,取0.5 g糞便于離心管中,加入標準替代物,使其濃度為150 ng·g-1,將加標后的糞便放置在-20 ℃冰箱冷凍過夜,次日對糞便樣品進行前處理;在樣品中加入0.5 mL甲醇,1粒陶瓷均質子,渦旋振蕩5 min后,離心分離取上清液,將上清液轉移至干凈試管中,再重復上述步驟2次,將3次的上清液合并,并用純水稀釋至3 mL。

    1.5.2 固相萃取

    對經過前處理的樣品尿液/糞便提取液進行固相萃取,步驟如下。在固相萃取裝置上將WAX Plus萃取小柱安裝好后,將2 mL含5%的氨水甲醇溶液加入小柱,讓溶液自然滴落,待溶液與小柱內物質持平,再加入2 mL含8‰的甲酸的超純水進行同樣的操作。而后將已經過前處理的樣品過已活化好的小柱,流出液棄去。用2 mL含有8‰甲酸的超純水淋洗小柱。淋洗后,用真空泵抽吸約15 min左右,保證固相萃取小柱干燥。對干燥后的小柱,依次用300 μL(糞便0.75 mL)含5%氨水的甲醇溶液,700 μL(糞便0.75 mL)乙腈洗脫,洗脫液先浸泡柱子2 min,再使洗脫液自然滴落,收集洗脫液。用超純水定容至1 mL(糞便1.5 mL),冷凍后過0.22 μm濾膜,上機檢測。

    1.6 標準溶液配制

    1.6.1 給藥TBOEP溶液的配制

    量取適量TBOEP液體,溶于食用油,配制濃度為750 mg·mL-1的溶液,臨用前配制。

    1.6.2 標準溶液的配制

    準確稱量各目標化合物、回收率指示物,分別溶解于甲醇中,各配制成濃度為10 mg·L-1的標準使用溶液。

    1.7 色譜質譜條件

    使用Agilent 1260系列液相色譜用于目標化合物的分離,色譜柱為Agilent ZORABX SB-C18,柱溫35 ℃,進樣量10 μL,流動相為甲醇(A)和0.002 mol·L-1的乙酸銨溶液(B),流動相流量250 μL·min-1。流動相梯度洗脫如表1所示。

    質譜條件:電噴霧電離源(ESI);多反應監(jiān)測模式(MRM);離子源電離模式Positive。毛細管電壓為3 500 V,霧化器壓力為310.2 kPa,載氣為高純氮氣,載氣溫度為330 ℃,流量9.5 L·min-1,用MRM檢測,分析物的濃度均配制為50 μg·L-1。通過連接注射針泵注入離子源(注射流量為10 μL·min-1,色譜泵流量200 μL·min-1),樣品帶電后進入質量分析器,通過總離子流圖和相應的質譜圖結果確定每種化合物的母離子和子離子,并根據(jù)響應情況優(yōu)化碰撞能和碎裂電壓,每種分析物的保留時間、監(jiān)測離子、輸入電壓和碰撞能如表2所示。

    1.8 數(shù)據(jù)處理

    按如下公式計算結果:每24 h尿液(糞便)排泄量=每24 h尿液(糞便)總量×尿液(糞便)中濃度;累積排泄量=0~24 h、24~48 h、48~72 h、72~96 h、96~120 h、120~144 h、144~168 h共7個采樣時間段的排泄量之和;排泄速率=每個采樣時間段排泄量/進入體內化學品總量×100%;累積排泄率=累積采樣時間段排泄量/進入體內化學品總量×100%。

    表1 流動相梯度洗脫Table 1 Gradient elution of mobile phase

    2 結果(Results)

    2.1 標準曲線與檢出限

    利用TBP-d27作為標準替代物,配制2、5、10、50、100和500 μg·L-1曲線點,繪制配制濃度的目標物標準曲線。目標化合物的線性回歸方程、相關系數(shù)和檢出限如表3所示。

    2.2 加標回收率與基質效應

    制備樣品基質加標樣(混標濃度10 μg·L-1(樣品基質))各6個,不加標基質樣品3個,超純水不加標空白對照樣品3個,按照1.5節(jié)方法進行前處理,計算加標回收率。各目標物回收率范圍在65%~126%之間,平行樣的相對標準偏差<15%。

    2.3 尿液樣品的排泄情況

    大鼠經口灌胃750 mg·kg-1TBOEP后,尿液中TBOEP及其代謝物不同時間段排泄量測定數(shù)據(jù)如圖1所示,累積排泄速率數(shù)據(jù)如圖2所示。由圖1可知,0~168 h,母體化合物尿液排泄量為(3.61±0.92) μg,代謝物BBOEP為(5.88±1.41) μg,BBOEHEP為(9.86±1.53) μg,代謝物BBOEHEP主要經過尿液排泄。大鼠經口染毒后,隨著時間的增加而排泄量增加,母體化合物TBOEP暴露后24 h在尿液中排泄量最大,168 h后依然可以檢出??芍?,母體化合物TBOEP在第1天排泄量較高,證明通過飲食途徑攝入的TBOEP可以被大鼠通過循環(huán)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)快速排出體外,而后續(xù)的波動可能說明了大鼠排除體內TBOEP的速度受到多重因素的影響,具體的影響則需要結合器官中的毒物殘留數(shù)據(jù)來進行分析。代謝物方面,除3-HO-TBOEP在尿液中未檢出外,BBOEP和BBOEHEP在尿液中均能檢測到。由圖1可知,代謝物BBOEP在0~24 h的排泄量為(1.01±0.21) μg,第2天(24~48 h)的排泄量升至(2.74±0.52) μg,之后的數(shù)據(jù)呈下降趨勢。代謝物BBOEHEP在0~24 h的排泄量最大,達到了(8.67±1.22) μg,第2天(24~48 h)的排泄量出現(xiàn)了大幅度下降,僅為(0.039±0.013) μg,呈現(xiàn)了較大的波動,在第3天(48~72 h)和第5天(96~120 h)出現(xiàn)比前日樣本讀數(shù)高的情況,分別為(0.88±0.23) μg和(0.23±0.05) μg,可以看出BBOEHEP在大鼠體內生成的速率較快,因此第1天的尿液中檢出量遠高于后續(xù)檢出量。

    表2 ESI-MS/MS保留時間、監(jiān)測離子、碎裂電壓和碰撞能Table 2 ESI-MS/MS retention time, monitoring ion, fragment and collision energy

    圖1 不同時間段TBOEP及其代謝物尿液排泄量Fig. 1 Urine excretion of TBOEP and its metabolites at different time periods

    圖2 大鼠灌胃750 mg·kg-1 TBOEP后尿液中TBOEP及其代謝物排泄率Fig. 2 The excretion rate of TBOEP and its metabolites in the urine of rats after intragastric administration of 750 mg·kg-1 TBOEP

    168 h內TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP的尿液累積排泄率分別為0.0043%、0.0069%和0.0114%。根據(jù)圖2尿液中TBOEP及其代謝物不同時間段的排泄率可知,在TBOEP的代謝物中BBOEP和BBOEHEP的生成量明顯多于3-HO-TBOEP。根據(jù)van den Eede等[11]的研究,人類肝細胞在體外實驗的情況下,將TBOEP轉化為BBOEHEP的速率約為2 560 pmol·min-1·mg-1(蛋白質),而BBOEP的轉化速率則會根據(jù)TBOEP的濃度發(fā)生改變[12]。本研究發(fā)現(xiàn)染毒初期大鼠體內BBOEHEP的生成速率非常快,但是相應的代謝速度也較快,第2天的大鼠尿樣相比第1天的尿樣的BBOEHEP的排泄率降低了90%以上。這與V?lkel等[9]探究了人體單次口服給藥TBOEP后的毒代動力學(選取3名男性和女性志愿者單次口服TBOEP),發(fā)現(xiàn)尿液樣品中7 h尿液中BBOEHEP的含量最高,本文與其結論一致。而BBOEP的濃度在前3 d的大鼠尿樣中都未呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢,直到暴露第5天才出現(xiàn)降低。由此來看,BBOEP在大鼠體內不僅生成速率較慢,還會受到TBOEP濃度的影響,但是排出體外的速度也相對較慢。由圖2可知。尿液內母體物質TBOEP和代謝產物BBOEHEP呈現(xiàn)了一定程度同步的峰谷趨勢,出現(xiàn)了較為統(tǒng)一的變化趨勢??赡苁怯捎贐BOEHEP作為TBOEP較為主要的代謝產物和TBOEP存在著最高的相關性,當某一組織內TBOEP濃度高時,產生的BBOEHEP也較多,而這些母體化合物和代謝產物被同時排出,因此出現(xiàn)這種情況。

    2.4 糞便樣品中的排泄情況

    大鼠經口灌胃750 mg·kg-1TBOEP后,糞便中TBOEP及其代謝物糞便排泄量如圖3所示,糞便排泄率數(shù)據(jù)如圖4所示。由圖3可知,0~168 h,母體化合物糞便排泄量為(65.71±6.5) μg,代謝物BBEOP為(89.13±25.58) μg,BBOEHEP為(5.87±2.25) μg,母體化合物TBOEP主要通過老鼠糞便排泄。大鼠經口染毒168 h后,在糞便中均能檢測到母體化合物TBOEP的存在,且在0~24 h內排泄量最大,在第3天呈現(xiàn)快速下降,說明母體化合物TBOEP在體內排泄快。代謝物方面,3-HO-TBOEP在0~24 h的糞便有所檢出之外,其余均未檢出,雖然并不是最主要的代謝產物,卻是重要的代謝路徑。由圖3可知,代謝物BBOEP排泄量的峰值在第2天(24~48 h),達到(50.98±11.38) μg,代謝物BBOEHEP的排泄量峰值在0~24 h,之后呈下降趨勢,可以看出BBOEP和BBOEHEP在大鼠體內生成的速率較快。

    圖3 不同時間段TBOEP及其代謝物糞便排泄量Fig. 3 Fecal excretion of TBOEP and its metabolites at different time periods

    圖4 大鼠灌胃750 mg·kg-1 TBOEP后糞便中TBOEP及其代謝物排泄率Fig. 4 The excretion rate of TBOEP and its metabolites in the feces of rats after intragastric administration of 750 mg·kg-1 TBOEP

    通過實驗發(fā)現(xiàn),168 h內TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP的糞便累積排泄率分別為0.4221%、0.3931%和0.0434%。與尿液排泄不同的是,染毒初期糞便中BBOEP的生成速率較快,0~24 h的排泄率遠高于BBOEHP。由圖4可知,與尿液一樣,糞便中BBOEP排泄率的峰谷與母體化合物TBOEP相比,有一定的滯后性,可能是由于TBOEP在大鼠體內轉換為BBOEP需要一定的轉化時間,導致排出體外的時間較慢。此外,與尿液一致,尿液內母體物質TBOEP和代謝產物BBOEHEP出現(xiàn)了較為統(tǒng)一的變化趨勢。

    3 討論(Discussion)

    本試驗建立了大鼠糞便、尿液中TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP、3-OH-TBOEP的LC-MS/MS測定方法。TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP、3-OH-TBOEP在2~500 μg·L-1濃度范圍內呈良好的線性關系(r>0.99),回收率范圍在65%~126%之間。方法的選擇性、殘留、精密度、準確度、基質效應和樣品穩(wěn)定性等均符合生物樣品分析要求,表明本方法適合于糞便、尿液中TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP、3-OH-TBOEP的分析。

    本研究表明,除代謝物3-OH-TBOEP僅在糞便樣品中0~24 h時間段檢出外,TBOEP及其代謝物BBOEP、BBOEHEP均在尿液和糞便樣品中有較高檢出。大鼠經口灌胃單次染毒750 mg·kg-1TBOEP后,0~168 h,母體化合物尿液排泄量為(3.61±0.92) μg,代謝物BBOEP為(5.88±1.41) μg,BBOEHEP為(9.86±1.53) μg,而母體化合物糞便排泄量為(65.71±6.5) μg,代謝物BBOEP為(89.13±25.58) μg,BBOEHEP為(5.87±2.25) μg,代謝物BBOEHEP主要經過尿液排泄。染毒后168 h內,TBOEP尿液和糞便累積排泄率為0.004%、0.422%。BBOEP尿液和糞便累積排泄率為0.007%、0.3931%。BBOEHEP尿液和糞便累積排泄率為0.011%、0.0434%。在0~168 h內,TBOEP和代謝物BBOEP主要通過糞便排泄,BBOEHEP通過尿液和糞便排泄。根據(jù)尿液和糞便中TBOEP及其代謝物的不同時間點的排泄量分布,BBOEP和BBOEHEP在TBOEP的代謝物中生成量明顯多于3-HO-TBOEP。由此推測,BBOEP和BBOEHEP是TBOEP在大鼠體內主要的代謝產物。TBOEP在大鼠體內僅有極少部分轉化成了3-HO-TBOEP,除了尿液和糞便排泄外可能存在其他的生物轉化途徑。該結果對TBOEP尿液和糞便的排泄規(guī)律研究有一定意義,可為闡明TBOEP體內的代謝過程提供一定依據(jù)。

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