阿克曼氏菌緩解胰腺炎所致腸道損傷的研究

黃伊雯，任正楠，宋東筱，潘禮龍，孫 嘉*

（1 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院 江蘇無錫 214122）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是一類急性消化類疾病，發(fā)病原因主要有酗酒、膽結(jié)石、代謝異常等。據(jù)估計(jì)，全球每10 萬人中AP 的發(fā)病率達(dá)33.74 例，死亡率達(dá)1.6 例，表明AP 具有很高的發(fā)病率與死亡率[1]。根據(jù)嚴(yán)重程度，AP 可分為輕癥胰腺炎（Mild acute pancreatitis，MAP）與重癥胰腺炎（Severe acute pancreatitis，SAP），主要取決于胰腺及其周圍局部損傷的程度，同時(shí)也取決于對(duì)遠(yuǎn)端器官的全身性損傷[2]。在MAP 發(fā)生時(shí)，沒有嚴(yán)重的局部和全身性并發(fā)癥，而約20%的MAP 患者會(huì)發(fā)展為更嚴(yán)重的SAP，并伴有壞死等明顯的局部并發(fā)癥，以及全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合癥[3]。

在SAP 動(dòng)物模型和臨床患者中均發(fā)現(xiàn)腸屏障損傷。在大鼠中，SAP 誘導(dǎo)后的早期，腸道通透性增加，腸道吸收能力降低，并伴有系統(tǒng)性血容量不足和腸道局部缺血[4]。腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α） 等炎性因子的瀑布式釋放，會(huì)導(dǎo)致腸黏膜缺血再灌注損傷，最終產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）途徑的激活和腸黏膜的嚴(yán)重凋亡[5-6]。同時(shí)，腸道生物屏障也遭到破壞，并進(jìn)一步引起腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素發(fā)生移位。這不僅會(huì)加速敗血癥的進(jìn)程，引起壞死組織感染，還會(huì)誘發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)綜合癥及多器官功能障礙，甚至引起死亡[7]。有研究證明，SAP 疾病發(fā)生前使用益生菌保護(hù)腸道屏障，可有效緩解SAP 發(fā)病進(jìn)程[8]，因此在治療原發(fā)病的同時(shí)，對(duì)腸道損傷的保護(hù)至關(guān)重要。

人體和動(dòng)物腸道內(nèi)存在數(shù)量龐大的微生物群，它們黏附在腸黏膜表面，構(gòu)成生物屏障，宿主與腸道微生物群之間的相互作用一直是生命健康領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9]。腸道菌群主要由專性厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌組成，其中專性厭氧菌占99%以上[10]。阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila，A.muciniphila）是一種革蘭氏陰性的嚴(yán)格厭氧菌，可在降解宿主黏蛋白的同時(shí)釋放氨基酸或單糖，產(chǎn)生短鏈脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs），為腸道中共生菌群提供營(yíng)養(yǎng)[11]，這提示阿克曼氏菌攝入對(duì)腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用。此外，阿克曼氏菌可調(diào)節(jié)Toll 樣受體（TLR）通路，通過增強(qiáng)腸道屏障減少內(nèi)毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）泄露進(jìn)入循環(huán)[12-13]。有研究表明，阿克曼氏菌在緩解或治療肥胖、2 型糖尿病和酒精性脂肪肝等疾病時(shí)，具有顯著作用[13-16]。還有研究表明，外源給予SCFAs 及生產(chǎn)SCFAs 的益生菌，可緩解小鼠AP發(fā)病進(jìn)程[8，17]。作為SCFAs 生產(chǎn)菌，阿克曼氏菌是否對(duì)AP 具有潛在調(diào)節(jié)作用，尚不清楚。此外，有大量研究證明巴氏消毒后的阿克曼氏菌，可以保留一些阿克曼氏菌活菌中活性分子的有益作用。例如，阿克曼氏菌的外膜蛋白Amuc_1100 在70 ℃加熱處理后仍有熱穩(wěn)定性，它幾乎能夠復(fù)制所有的阿克曼氏菌活菌的作用[18-19]。本文旨在探究阿克曼氏菌活菌及滅活菌制劑對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠SAP 的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、菌株與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6J，江蘇集萃藥康生物科技公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得江南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)JN.No20190915c0401020[204]），并嚴(yán)格遵循國(guó)家以及國(guó)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則，由江南大學(xué)提供飼養(yǎng)條件。阿克曼氏菌（A.muciniphila）MucT（ATTC BAA-835），美國(guó)的模式培養(yǎng)物集存庫；腦心浸液培養(yǎng)基，中國(guó)青島海博公司；Ⅲ型粘蛋白、雨蛙素、異硫氰酸酯-葡聚糖，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；α-淀粉酶測(cè)試盒、脂肪酶測(cè)試盒，中國(guó)南京建成生物研究所；AB-PAS 染色試劑盒，北京索萊寶公司；TRIzol 試劑、Super Script Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶，加拿大Invitrogen 公司；SYBR Green Supermix 染料，上海翌圣生物科技有限公司；蘇木精、伊紅染色劑，中國(guó)南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司；p-NF-κB p65 抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；NF-κB p65 抗體，美國(guó)Bioss 公司；乙醇、氯仿、異丙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

厭氧工作站，英國(guó)DWS 公司；4 ℃冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；切片電子掃描儀，匈牙利3DHISTECH 公司；超聲波破碎儀，美國(guó)Sonics 公司；電子數(shù)顯恒溫水浴鍋，中國(guó)深儀科技公司；高通量組織研磨機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；石蠟包埋機(jī)、手動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)，德國(guó)徠卡公司；多功能酶標(biāo)儀Infinite M200 儀器，瑞士Tecan 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株制備 阿克曼氏菌MucT（ATTC BAA-835） 被嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)在添加20 g/L Ⅲ型粘蛋白的腦心浸液培養(yǎng)基中。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，4℃，8 000×g 離心10 min，去上清，用無菌生理鹽水將菌泥洗滌2 次，重懸菌泥于30%甘油中，-80 ℃冰箱保存。使用前將菌液用無菌生理鹽水稀釋至含3%甘油的5×109CFU/mL 的菌液后水浴鍋37℃，活化30 min 備用。滅活阿克曼氏菌制劑于灌胃前進(jìn)行70 ℃，30 min 巴氏殺菌處理。

1.3.2 動(dòng)物模型 將8 周齡左右的雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、活菌和滅活菌組。每組6 只。為了驗(yàn)證阿克曼氏菌的生物學(xué)作用，在建立SAP 模型前，采用連續(xù)10 d 灌胃的方式給予活菌組小鼠200 μL 含3%甘油的5×109CFU/mL阿克曼氏菌液，滅活菌組小鼠200 μL 含3%甘油的5×109CFU/mL 經(jīng)70 ℃，30 min 巴氏殺菌處理的阿克曼氏菌液。其余兩組每日灌胃200 μL 含3%甘油的無菌生理鹽水。第11 天建立SAP 模型：小鼠連續(xù)13 次腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg），每次注射間隔1 h，注射完第13 針雨蛙素后立即注射1 針LPS（20 mg/kg）。3 h 后處死小鼠，并迅速收集血液、胰腺、結(jié)腸等樣本。

1.3.3 胰腺組織水腫測(cè)定 取部分胰腺組織，稱量新鮮胰腺樣品濕重（Wet weight，ww）及80 ℃烘干48 h 后胰腺樣品干重（Dry weight，dw），評(píng)估胰腺組織水腫程度。計(jì)算胰腺組織水含量的百分比（ww/dw）。

1.3.4 血清淀粉酶、脂肪酶測(cè)定 收集新鮮血液于采血管，室溫靜置1 h，經(jīng)3 000×g，15 min 離心后得到血清樣品，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。血清淀粉酶采用?淀粉酶測(cè)試盒進(jìn)行測(cè)定。使用比色法在660 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光值，根據(jù)給定公式計(jì)算血清淀粉酶的含量。血清脂肪酶按說明書步驟測(cè)定，使用酶標(biāo)儀于420 nm 波長(zhǎng)處比濁，測(cè)定脂肪酶的活性。

1.3.5 組織形態(tài)學(xué)分析 剪取一定大小、長(zhǎng)度的新鮮胰腺組織，迅速置于4%的中性多聚甲醛中固定12～24 h 左右，經(jīng)常規(guī)流程對(duì)組織使用濃度梯度乙醇脫水和二甲苯透明。然后用切片石蠟進(jìn)行包埋后制成蠟塊，隨后將組織進(jìn)行切片，逐級(jí)脫蠟復(fù)水后進(jìn)行續(xù)染色。本實(shí)驗(yàn)采用蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，H&E）法來觀察結(jié)腸及胰腺組織形態(tài)，觀察腺泡細(xì)胞損失及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。使用阿利新藍(lán)-過碘酸雪夫氏染色（Alcian blue-periodic acid Schiff，AB-PAS） 觀察結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞及黏液層情況。

1.3.6 腸道通透性測(cè)定 小鼠腸道通透性檢測(cè)通過熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖 （Fluorescein isothiocyanate-Dextran，F(xiàn)ITC-Dextran）來檢測(cè)。小鼠處死前，禁食4 h，隨后灌胃500 mg/kg 的FITC-Dextran。灌胃4 h 后處死，避光快速收集血液并離心得到血清。使用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)492 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 下測(cè)定吸光度。通過連續(xù)稀釋FITC-Dextran 溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并換算血清中的FITC-Dextran 濃度。

1.3.7 胰腺RNA 提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析 采用TRIzol 提取方法提取小鼠胰腺、結(jié)腸中的總RNA，使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA，測(cè)定RNA 和cDNA 的濃度。以cDNA 為模板，骨架蛋白β-actin 為內(nèi)參，F(xiàn)ast SYBR Green Master Mix 混合體系，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)。引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Supermix，10 μL；上游引物（10 μmol/L）、下游引物（10 μmol/L），1 μL；模板1 μL；ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸2 min；2～4步循環(huán)40 次，4 ℃降溫5 min。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用的特異性引物Table 1 Specific primers for qRT-PCR

1.3.8 Western blot 分析 將胰腺組織置于RIPA裂解液中制備組織勻漿，4 ℃，14 000×g 條件下離心15 min，取上清液用于免疫印跡分析。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度分析。等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，封閉后，用NF-κB p65、p-NF-κB p65 抗體進(jìn)行過夜孵育。隨后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗兔抗體室溫孵育1.5 h，采用ECL 試劑盒進(jìn)行顯色，于Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)中曝光觀察。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。使用單因素方差分析（One-way ANOVA）對(duì)各組之間的顯著性差異進(jìn)行評(píng)估，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prime 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行專業(yè)統(tǒng)計(jì)分析（*.P＜0.05，**.P＜0.01，***.P＜0.001）。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿克曼氏菌保護(hù)重癥急性胰腺炎引起的腸屏障損傷

腸道菌群紊亂與多種胃腸道相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制都存在一定關(guān)聯(lián)性，例如，腸炎疾病和腸易激綜合征[20]，以及一些其它疾病，如代謝綜合征、肥胖、糖尿病和胰腺相關(guān)的疾病，腸道菌群的干預(yù)可以作為預(yù)防或治療這些疾病的有效方法[21-24]。以往研究已經(jīng)表明，SAP 小鼠的腸道屏障會(huì)發(fā)生一定程度的損傷。結(jié)腸病理學(xué)切片顯示（圖1a），SAP 組小鼠腸黏膜上皮變寬，絨毛頂端上皮脫落。這種結(jié)腸損傷在阿克曼氏菌干預(yù)的活菌及滅活菌小鼠中得到緩解。通過灌胃FITC-dextran 檢測(cè)小鼠結(jié)腸黏膜通透性。如圖1b 所示，模型小鼠血清中FITC-dextran 濃度大幅度增加，活菌和滅活菌組與模型組小鼠相比，小鼠血清中FITC-dextran 濃度則顯著降低。表明阿克曼氏菌的干預(yù)可以保護(hù)屏障，減少泄露。此外也通過測(cè)定小鼠結(jié)腸上皮中緊密連接（Tight junctions，TJs）蛋白ZO-1（Tjp1）和ZO-2（Tjp2）的表達(dá)，探究阿克曼氏菌是否能調(diào)節(jié)小鼠SAP 模型中的腸屏障功能。結(jié)果表明（圖1c 和圖1d），ZO-1 和ZO-2 在雨蛙素誘導(dǎo)的SAP小鼠中的基因表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的降低。阿克曼氏菌活菌干預(yù)后，大幅度上調(diào)了ZO-1 和ZO-2 的表達(dá)，滅活的阿克曼氏菌也使得ZO-2 的基因水平上升。這些結(jié)果表明，阿克曼氏菌可以增強(qiáng)SAP 結(jié)腸中小鼠的TJs，保護(hù)腸道機(jī)械屏障損傷。

圖1 阿克曼氏菌干預(yù)對(duì)SAP 相關(guān)的腸屏障影響Fig.1 Effect of A.muciniphila treatment on the SAP-associated intestinal barrier

2.2 阿克曼氏菌恢復(fù)腸道黏液層破壞

阿克曼氏菌能刺激杯狀細(xì)胞，增加黏蛋白MUC2 和三葉因子 （Recombinant trefoil factor 2，TFF2）的表達(dá)，同時(shí)增加腸黏液層的厚度[25]。本實(shí)驗(yàn)使用AB-PAS 染色結(jié)腸組織（圖2），結(jié)果顯示SAP 造模組杯狀細(xì)胞和黏液層破壞嚴(yán)重。阿克曼氏菌活菌干預(yù)后，可增加杯狀細(xì)胞數(shù)量，恢復(fù)黏液層含量。滅活菌也具有一定的作用，活菌組效果更為顯著。

圖2 阿克曼氏菌干預(yù)對(duì)結(jié)腸黏液層影響Fig.2 Effects of A.muciniphila treatment on colonic mucous layer

2.3 阿克曼氏菌無法緩解重癥急性胰腺炎癥狀

發(fā)生SAP 時(shí)，包括中性粒細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞的募集和浸潤(rùn)，引起胰腺組織水腫。為了探究阿克曼氏菌預(yù)處理在SAP 發(fā)生時(shí)是否發(fā)揮作用，首先檢測(cè)了雨蛙素與LPS 聯(lián)合建立的SAP 小鼠模型中胰腺組織的水腫情況。利用H&E 染色觀察胰腺組織的形態(tài)（圖3a），發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠胰腺形態(tài)完整，實(shí)質(zhì)率高，未出現(xiàn)水腫、壞死及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的情況；與之相比，SAP 組小鼠胰腺組織間質(zhì)間隙增大，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，胰腺腺泡細(xì)胞明顯腫脹并出現(xiàn)部分壞死，組織間隙及實(shí)質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，胰腺組織損傷嚴(yán)重。阿克曼氏菌活菌與滅活菌預(yù)處理后，與模型組小鼠相比，腺泡細(xì)胞壞死程度、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及胰腺組織的間質(zhì)水腫均未得到改善。如圖3b 所示，使用胰腺組織濕重與干重比值，評(píng)估胰腺組織水腫程度。模型組小鼠與對(duì)照組相比，胰腺水腫程度顯著增加，阿克曼氏菌活菌與滅活菌干預(yù)均無法改善小鼠的水腫程度。

同時(shí)，由于胰蛋白酶原異常激活，胰腺腺泡細(xì)胞遭到破壞，胰腺分泌的淀粉酶和脂肪酶大量進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清淀粉酶和脂肪酶升高。圖3c 和3d 所示，在SAP 模型建立后，血清淀粉酶及脂肪酶活力顯著升高，活菌和滅活菌組較模型組而言，并未降低二者在血清中的水平?？傊芯空J(rèn)為阿克曼氏菌的活菌與滅活菌預(yù)處理均不能緩解SAP的癥狀。

圖3 阿克曼氏菌無法緩解重癥急性胰腺炎癥狀Fig.3 A.muciniphila cannot relieve severe acute pancreatitis symptoms

2.4 阿克曼氏菌無法調(diào)節(jié)重癥急性胰腺炎過程中炎癥因子的釋放

SAP 發(fā)生后引起一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在這個(gè)反應(yīng)過程中，受損的腺泡細(xì)胞釋放大量炎癥因子，并募集大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)至病灶中。而這些浸潤(rùn)的細(xì)胞則會(huì)產(chǎn)生更多的炎癥因子，加重局部和整體性的炎癥反應(yīng)[26-27]。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定了胰腺組織中幾種常見炎癥因子。如圖4所示，模型組小鼠胰腺組織中的炎癥因子白細(xì)胞介素-1β （Interleukin-1β，IL-1β）、TNF-α 和白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）基因表達(dá)水平顯著升高，約為對(duì)照組的4～10 倍，說明SAP 小鼠出現(xiàn)了明顯的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。兩組阿克曼氏菌的活菌與滅活菌預(yù)處理均無法調(diào)節(jié)胰腺局部炎癥因子。

圖4 小鼠胰腺組織中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的基因表達(dá)水平Fig.4 The levels of IL-1β，TNF-α and IL-6 in mouse pancreas tissue

2.5 阿克曼氏菌無法抑制胰腺組織中NF-κB 的激活

在AP 發(fā)生的早期階段，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）立即作出應(yīng)答，并導(dǎo)致下游炎癥因子大量釋放。組織中大量分泌的炎癥介質(zhì)同時(shí)又作為NF-κB 的誘導(dǎo)劑，由此形成惡性循環(huán)，加重胰腺損傷[28]。檢測(cè)了NF-κB（p-NF-κB p65）的表達(dá)情況，如圖5所示，模型組p-NF-κB p65 高表達(dá)，活菌和滅活組NF-κB p65 磷酸化水平較模型組沒有顯著性差異。這證明阿克曼氏菌的干預(yù)不能通過調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)胰腺的炎癥進(jìn)程。

圖5 阿克曼氏菌的干預(yù)對(duì)胰腺NF-κB 信號(hào)的影響Fig.5 The effect of A.muciniphila treatment on NF-κB in pancreas

3 結(jié)論

本文通過反復(fù)注射雨蛙素并佐以LPS 的方式建立模型，灌胃阿克曼氏菌活菌及滅活菌制劑。小鼠灌胃阿克曼氏菌后，與模型組相比，小鼠腸道屏障得到保護(hù)，緊密連接蛋白表達(dá)量增加，腸屏障泄露減少，杯狀細(xì)胞及黏液層增多，活菌的保護(hù)效果較滅活菌更為顯著。然而，胰腺的水腫情況、血清淀粉酶及血清脂肪酶升高的情況并未改善，也未能逆轉(zhuǎn)SAP 發(fā)生時(shí)，炎癥因子的增加及NF-κB 信號(hào)的激活。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)阿克曼氏菌雖然能夠增強(qiáng)腸道屏障功能，但未能表現(xiàn)出對(duì)SAP 的緩解作用。SAP 作為一種急性炎癥性疾病，已經(jīng)證明能通過腸道屏障的恢復(fù)以及SCFAs 的補(bǔ)充來緩解發(fā)病進(jìn)程。阿克曼氏菌作為一種可增加腸道黏液層厚度且產(chǎn)SCFAs 的益生菌，在T1D 及T2D 中已被驗(yàn)證有益效果，然而需要長(zhǎng)期干預(yù)才能發(fā)揮作用。延長(zhǎng)阿克曼氏菌的預(yù)防干預(yù)時(shí)間或干預(yù)慢性疾病，如慢性胰腺炎，或許能進(jìn)一步挖掘阿克曼氏菌的有益作用。