微米級(jí)靈菌紅素的制備及在織物染色中的研究

屠成超，劉曉俠，任佳棟,胡博遠(yuǎn)

(嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001)

在全球綠色環(huán)保浪潮的影響下，天然染料因安全性高、無(wú)毒且有一定的藥理保健作用而深受關(guān)注.[1]目前，天然染料主要從植物中獲取，但由于植物中色素含量較少，大量采摘和砍伐必然對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞.[2]因此，開(kāi)發(fā)新型高性能、高附加值的染料，探索新的天然染料來(lái)源，開(kāi)發(fā)染料的清潔生產(chǎn)工藝，逐步建立節(jié)能減排的技術(shù)支撐體系，已成為紡織行業(yè)發(fā)展中迫切需要解決的問(wèn)題.

靈菌紅素(prodigiosin，PG)是多種微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括來(lái)自土壤和海洋的細(xì)菌、放線菌等.[3-4]靈菌紅素具有三吡咯環(huán)甲氧基的基本結(jié)構(gòu)，具有抗癌、免疫抑制、抗菌及抑藻等重要的生物活性.[5-8]近年來(lái)，靈菌紅素作為生態(tài)染料在紡織染色方面也有報(bào)道，[9-10]初步研究表明，靈菌紅素對(duì)羊毛、腈綸等織物具有較好的染色效果.但因靈菌紅素菌株產(chǎn)量較低，生產(chǎn)和使用過(guò)程需要使用有機(jī)溶劑，限制了它的推廣和應(yīng)用.本文采用高產(chǎn)靈菌紅素的菌株，通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化制備微米級(jí)生態(tài)染料，對(duì)紡織品直接進(jìn)行染色，有利于加快靈菌紅素作為生態(tài)染料的應(yīng)用進(jìn)程.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌 (EscherichiacoliATCC 8099)、白色念球菌(CandidaalbicansATCC 10231)以及金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中心，沙雷氏菌(SerratiamarcescensGX-1)由本課題組實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，瓊脂粉18 g·L-1，pH值為6.5；

原培養(yǎng)基：蛋白胨13.0 g·L-1，甘油20.0 g·L-1，甘氨酸2.0 g·L-1，硫酸鎂 1.2 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，pH值為6.5；

廢蛋白培養(yǎng)基：甘油20 g·L-1，蛋白胨8 g·L-1，廢蛋白 40 g·L-1，硫酸鎂1.2 g·L-1，甘氨酸2.0 g·L-1，脯氨酸1.0 g·L-1，乙酸鈉0.1 g·L-1，硫酸錳0.25 g·L-1，pH值為6.5；

花生培養(yǎng)基：花生20 g·L-1，廢蛋白10 g·L-1，硫酸鎂1.2 g·L-1，甘氨酸2.19 g·L-1，甘油24.3 g·L-1.

1.1.3 織物

標(biāo)準(zhǔn)滌綸織物、真絲織物(浙江嘉欣絲綢股份有限公司贈(zèng)).

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

首先考察3種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基，[11]進(jìn)而考察培養(yǎng)條件：pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5；裝液量分別為25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、75 mL/250 mL和100 mL/250 mL；不同濃度的表面活性劑脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)、仲烷基磺酸鈉(SAS)和聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫-80)在150 rpm、200 rpm和250 rpm搖床轉(zhuǎn)速下對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響.

1.2.2 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

采用平板劃線法活化菌種S.marcescensGX-1，挑選單菌落接入液體培養(yǎng)基，放入37 ℃、180 rpm搖床中培養(yǎng)12 h得到擴(kuò)大培養(yǎng)液.按發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量的5%將其接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 ℃的搖床中培養(yǎng)48 h.

1.2.3 靈菌紅素產(chǎn)量的測(cè)定

用pH值為3的酸性丙酮適當(dāng)稀釋發(fā)酵液，在波長(zhǎng)535 nm下測(cè)定其吸光度.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0326 Ax計(jì)算靈菌紅素的產(chǎn)量，其中y代表靈菌紅素產(chǎn)量(g·L-1)，A代表稀釋倍數(shù)，x代表波長(zhǎng)535 nm下的吸光度.

1.2.4 色素膠束粒徑的測(cè)定

在上述最高產(chǎn)量的發(fā)酵液中添加表面活性劑后，放入Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理，再使用Litesizer 500 nm粒度及Zeta電位分析儀測(cè)量其粒徑的大小和分布.

1.2.5 染色工藝

稱取1 g織物投入pH值為8.0的微米靈菌紅素的染液中，浴比為1∶50，調(diào)整染色溫度至100 ℃，染色10 min后，將織物取出，在60 ℃溫水中清洗兩次，最后將其晾干備用.

1.2.6 染色性能測(cè)定

取染色后的織物試樣50 mm×200 mm兩塊，標(biāo)準(zhǔn)摩擦棉布50 mm×50 mm一塊，用銅環(huán)固定在摩擦頭上，參照國(guó)標(biāo)GB/T3920-2008測(cè)定其耐摩擦色牢度.

取染色后的織物試樣50 mm×70 mm與兩塊標(biāo)準(zhǔn)貼襯織物50 mm×70 mm沿一短邊縫合，參照國(guó)標(biāo)GB/T3921-2008測(cè)定其耐皂洗色牢度.

1.2.7 抗菌性測(cè)試

參照國(guó)標(biāo)GB/T20944.1-2007，取未經(jīng)染色的布樣與染色后的布樣，裁取直徑為5 mm的圓形試樣，用無(wú)菌鑷子將其分別放在含有大腸桿菌、白色念球菌及金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿中，并均勻按壓使兩者接觸良好，再放入37 ℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察其抑菌效果.

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果與分析

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)靈菌紅素含量的影響

分別考察3種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基配方、初始pH值和裝液量對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果分別見(jiàn)圖1、圖2和圖3.

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

圖2 初始pH值對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

圖3 裝液量對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

由圖1可知，花生培養(yǎng)基為最優(yōu)培養(yǎng)基，在成本上相比原培養(yǎng)基降低60%，同時(shí)，由于花生中含有大量的不飽和脂肪酸，為靈菌紅素的合成提供了前體，[12-13]大大提高了靈菌紅素的產(chǎn)量.

由圖2可知，pH值在5.5～7.5之間，對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量影響不顯著，這與重組大腸桿菌靈菌紅素縮合酶PigC表達(dá)所需的最優(yōu)pH值有所不同，[14]這可能與宿主菌不同有關(guān).由圖3可知，最優(yōu)的裝液量為25 mL/250 mL，這與靈菌紅素合成途徑中的相關(guān)酶在有氧條件下活性較高有關(guān).[15]

表面活性劑可以改變膜的通透性，在一定程度上解除反饋調(diào)節(jié).本文考察了表面活性劑的種類、濃度以及搖床轉(zhuǎn)速對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5.

圖4 表面活性劑對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)靈菌紅素產(chǎn)量的影響

如圖4所示，添加不同濃度的3種表面活性劑AEO、SAS、吐溫-80，對(duì)靈菌紅素的產(chǎn)量均有影響.其中添加8 mL·L-1(V/V)吐溫-80和2 mL·L-1(V/V) SAS，靈菌紅素產(chǎn)量較高，但隨著表面活性劑添加量的增大，產(chǎn)量反而有所下降，可能菌體生長(zhǎng)受到影響，這有待進(jìn)一步研究；當(dāng)吐溫-80添加量為8 mL·L-1時(shí)，靈菌紅素產(chǎn)量可達(dá)6.54 g·L-1.由圖5可知，采用花生培養(yǎng)基，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 rpm，在裝液量為25 mL/250 mL、pH值為6.5、吐溫-80為8 mL·L-1時(shí)，靈菌紅素產(chǎn)量可高達(dá)7.62 g·L-1.

2.1.2 超聲處理對(duì)色素膠束粒徑的影響

在發(fā)酵液中添加適量的表面活性劑，有望制備微米級(jí)靈菌紅素分散液.微米級(jí)的色素分散液可以保證分散液的穩(wěn)定性，進(jìn)而保證染色織物染色均勻.[16]在轉(zhuǎn)速為200 rpm的發(fā)酵液中添加8 mL·L-1吐溫-80，所測(cè)靈菌紅素的平均粒徑為2249.7 nm；放入輸出功率為240 W的超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，工作5 s，間歇3 s，共處理5 min，色素的粒徑明顯降低，達(dá)到718.7 nm.

2.2 染色性能的測(cè)定

使用真絲織物和滌綸織物進(jìn)行染色測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 納米級(jí)靈菌紅素染色織物的表觀顏色

由表1可見(jiàn)，兩種織物均具有較好的色深度，且有明顯的紅光和較弱的藍(lán)光.

由表2可知，在耐皂洗色牢度和耐摩擦色牢度測(cè)試中，染色的真絲織物和滌綸織物均有良好表現(xiàn)，皂洗色牢度和摩擦牢度均為4～5級(jí).

表2 微米級(jí)靈菌紅素染色織物的色牢度

2.3 抗菌性測(cè)試

靈菌紅素染色后真絲對(duì)大腸桿菌(ATCC 8099)、白色念球菌(ATCC 10231)以及金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)的抑菌效果如圖6所示.

圖6 染色真絲織物對(duì)多種微生物的抑制結(jié)果

由圖6可以看出，染色后的真絲織物均有抑菌圈(直徑<1 mm)且在染色試樣下無(wú)微生物生長(zhǎng)，而未染色對(duì)照織物試樣下有微生物生長(zhǎng)，說(shuō)明靈菌紅素染色的真絲織物抑菌效果良好，這與已報(bào)道的結(jié)果一致.[16]

3 結(jié)論

花生培養(yǎng)基在發(fā)酵條件為裝液量25 mL/250 mL、pH值為 6.5、轉(zhuǎn)速為200 rpm時(shí)，添加8 mL·L-1(V/V)表面活性劑吐溫-80，靈菌紅素產(chǎn)量最高可達(dá)7.62 g·L-1，較優(yōu)化前提高80.14%；采用該微米級(jí)染色液對(duì)滌綸、真絲織物進(jìn)行染色，染色后的滌綸、真絲織物鮮艷亮麗，耐摩擦及耐皂洗色牢度均達(dá)4～5級(jí)，且對(duì)多種微生物具有優(yōu)良的抑菌效果，該研究表明靈菌紅素具有廣闊的應(yīng)用前景.