EZH2抑制劑(GSK-126)對小鼠肝纖維化的保護(hù)作用

劉志丹，王金麗，金勝潔，王俏鈴，韓嬌嬌，金倩儀，阮群超，鄭永霞

(嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興314001)

肝纖維化是所有慢性肝臟疾病形成的共同病理反應(yīng)過程，它是肝臟損傷與修復(fù)反應(yīng)失衡的結(jié)果，可導(dǎo)致肝硬化.它的特征是肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分過度增生與沉積.臨床認(rèn)為：在適當(dāng)手段干預(yù)下，肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的，但患者一旦發(fā)展到肝硬化階段，則很難治愈.肝纖維化的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞的活化，[1]肝星狀細(xì)胞活化后獲得了成纖維細(xì)胞的表型，使其由儲存維生素A的儲脂細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，它具有強(qiáng)大的增殖、收縮和纖維化發(fā)生的能力.

果蠅Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2(EZH2)是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，使組蛋白H3的第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化修飾 (H3K27me3)，[2]H3K27me3是一類重要的轉(zhuǎn)錄抑制性標(biāo)記.近年來研究發(fā)現(xiàn)：EZH2具有調(diào)節(jié)肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并參與多個組織的纖維化，包括腎纖維化、肺纖維化等，[3]目前EZH2與肝纖維化的關(guān)系也逐漸得到證實.研究顯示，EZH2可通過提高Wnt通路的活性促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和肝纖維化.[4-5]EZH2抑制劑(下文簡稱GSK-126)作為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的競爭性抑制劑，對EZH2的選擇性比其他20種人甲基轉(zhuǎn)移酶高1000多倍，[6]且GSK-126在2014年已進(jìn)入I期臨床試驗，用于治療晚期實體瘤或者B細(xì)胞淋巴瘤.[7-9]盡管已有研究顯示：GSK-126可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的可塑性和改善肝衰竭小鼠的疾病嚴(yán)重程度，然而在肝纖維化方面的研究尚未見諸報道.

為了探討GSK-126在肝纖維化保護(hù)中的作用，本文利用不同劑量(5mg/kg和15mg/kg)的GSK-126(EZH2的抑制劑)處理CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，并從病理染色、肝功能等方面來觀察GSK-126對肝纖維化保護(hù)的作用.

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級Balb/c小鼠(24只)，由嘉興學(xué)院動物實驗中心培育，體重21±3.5 g，雌雄各半；GSK-126(上海陶素生化科技有限公司)、CCl4(上海聯(lián)試化工試劑有限公司)、花生油(益海糧油工業(yè)有限公司)、蘇木精及伊紅(南昌雨露實驗器材有限公司)、天狼猩紅染液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)、酶標(biāo)儀(上海沛歐分析儀器有限公司)、小鼠ALT酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)、Masson染色試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)、天狼猩紅染色試劑盒(北京索萊寶生物有限公司).

1.2 CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化

將小鼠分為4組，每組6只，實驗周期為20天.

1)正常對照組：按5mL/kg的劑量皮下注射食用油，每3天1次，共注射6次；

2)肝纖維化組：按5 mL/kg的劑量皮下注射體積分?jǐn)?shù)為20% 的CCl4油劑溶液(CCl4∶橄欖油=1∶4)，每3天1次，共注射6次；

3)CCl4+ GSK-126 5mg/kg組：按5 mL/kg的劑量皮下注射體積分?jǐn)?shù)為20% CCl4的油劑溶液(CCl4∶橄欖油=1∶4)的同時，按5mg/kg的劑量皮下注射GSK-126，每3天1次，共注射6次；

4)CCl4+GSK-126 15 mg/kg組：按5mL/kg的劑量皮下注射體積分?jǐn)?shù)為20% CCl4的油劑溶液(CCl4∶橄欖油=1∶4)的同時，按15 mg/kg的劑量皮下注射GSK-126，每3天1次，共注射6次.

20天培養(yǎng)周期結(jié)束后，腹腔注射5%水合氯醛溶液麻醉，心臟取血，解剖取出小鼠的肝臟，稱重并記錄.同時觀察小鼠肝臟的大體形態(tài)，將取出的肝臟組織放置在甲醛溶液中固定，用于制作石蠟包埋塊，血清則于冰箱內(nèi)保存?zhèn)溲逯笜?biāo)檢測.

1.3 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測定

用1.5 mL 5%的水合氯醛對小鼠進(jìn)行腹腔注射，小鼠麻醉后，打開胸腔，暴露心臟，用針頭刺入右心室，吸取0.5～0.6 mL血液，置于含有肝素的試管中，靜置30 min，離心，取上清.谷丙轉(zhuǎn)氨酶的測定按照小鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作：在包被板上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔以及待測樣品孔的設(shè)置與加樣；然后用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min；洗滌，加酶，置37 ℃溫育30 min，洗滌；加顯色劑后避光顯色15 min后，終止反應(yīng).以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行).計算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算其直線回歸方程式，然后根據(jù)樣品值用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度.

1.4 組織病理分析

對肝臟組織切片進(jìn)行HE染色、Masson染色、天狼猩紅染色并在光鏡下觀察.

1.4.1 HE染色

取新鮮肝臟組織塊(厚度0.5 cm)投入10%福爾馬林中固定12 h后，依次將其放入 60%乙醇(1 h)→70%乙醇(1h)→80%乙醇(1 h) →90%乙醇(45 min)→95%乙醇(30 min)→95%乙醇(15 min)→100%乙醇(15 min)→100%乙醇(15 min)→二甲苯溶液(15 min)→二甲苯溶液(15 min)→60 ℃石蠟I (1.5 h) →60 ℃石蠟II(2 h)；然后將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋，并切成4μm厚的切片；再將切片依次放入二甲苯(I)25 min→二甲苯(Ⅱ)25 min→100%酒精 2 min→95%的酒精 2 min→80%酒精 2 min→75%酒精2 min→蒸餾水洗2 min，脫去切片中的石蠟；再放入蘇木素染色5 min，自來水沖洗；鹽酸酒精分色10 s；流水緩慢沖洗15 min后分別放入70%和90%酒精中各脫水10 min；伊紅溶液染色2～3 min；用常規(guī)梯度酒精進(jìn)行脫水后再用二甲苯透明，最后用中性樹脂封片即可.

1.4.2 Masson染色

先將肝組織切片(4 μm)、脫臘；用Weigert鐵蘇木素染色8 min，酸性乙醇分化，蒸餾水洗；再用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色5～10 min；以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸溶液分化3～5 min；不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)或光綠液染5 min.以0.2% 冰醋酸水溶液浸洗片刻；再用95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固.

1.4.3 天狼猩紅染色

用10%的福爾馬林固定肝臟組織,常規(guī)脫水包埋，切成6μm厚的切片；用二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,蒸餾水浸泡；weigert鐵蘇木素染色液染色10～20 min；用自來水洗5～10 min，蒸餾水洗1次；天狼猩紅染色液滴染1 h，流水沖洗，去除切片表面的天狼猩紅染色液，再常規(guī)脫水至透明，最后用中性樹膠封固.

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肝臟形態(tài)圖

為了觀察GSK-126對小鼠肝纖維化的影響，我們基于CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，[10]觀察不同劑量的GSK-126對肝臟形態(tài)的影響.結(jié)果顯示：正常對照組(圖1A)小鼠肝臟體積正常，表面光滑質(zhì)軟，肝組織紅潤、呈紅褐色，邊緣銳利；肝纖維化模型組(圖1B)小鼠肝臟體積明顯增大，表面粗糙，失去光澤，有較多灰白色小結(jié)，質(zhì)地變硬，邊緣鈍圓，表明其肝纖維化模型成功.GSK-126 5 mg/kg組(圖1C)和15 mg/kg組(圖1D)相比，小鼠肝臟體積有不同程度的縮小，色澤得到一定恢復(fù)、質(zhì)地變軟、邊緣變薄，但仍存在病變現(xiàn)象，且GSK-126 15mg/kg組小鼠肝臟狀態(tài)較好.該結(jié)果提示，GSK-126可能具有減輕肝纖維化的作用.

A.對照組

B.CCl4處理組

C.GSK-126 5mg/kg組

D.GSK-126 15mg/kg組

2.2 肝重指數(shù)

模型組與對照組相比較，采用t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.304,p=0.0298)，模型組的肝重指數(shù)(5.94±0.449)明顯高于對照組(4.59±0.547)，說明CCl4誘導(dǎo)小鼠發(fā)生了肝纖維化.利用方差分析的方法對GSK-126 5 mg/kg組、GSK-126 15 mg/kg組以及模型組的肝重指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：GSK-126 5 mg/kg組、GSK-126 15 mg/kg組的肝重指數(shù)與模型組的肝重指數(shù)存在顯著差異(F=8.443,p=0.0073)，GSK-126低、高劑量組的肝重指數(shù)均低于模型組(p<0.05)，由此說明，GSK-126對肝纖維化的發(fā)生具有一定的抑制作用.

表1 肝重指數(shù) (x±s)

2.3 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定結(jié)果

由表2可知，模型組小鼠的ALT活性顯著升高，可見肝纖維化小鼠模型造模成功；利用方差分析的方法對GSK-126 5 mg/kg組、GSK-126 15 mg/kg組以及模型組的ALT活性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：GSK-126 5 mg/kg組、GSK-126 15 mg/kg組的ALT活性與模型組存在顯著差異(F=8.443,p=0.0073).GSK-126 5 mg/kg組、GSK-126 15 mg/kg組的肝重指數(shù)均低于模型組(p<0.05)，由此說明，GSK-126對肝纖維化的發(fā)生具有一定的抑制作用.

表2 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性(x±s)

2.4 HE染色圖

HE染色能較直觀地發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟細(xì)胞的損傷情況，進(jìn)而判斷GSK-126在肝纖維化進(jìn)程中是否能夠改善肝細(xì)胞損傷.[11-12]由HE染色圖譜(圖2)可見，對照組(圖2A)小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，較少出現(xiàn)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，無病變或壞死.模型組(圖2B)小鼠肝臟局部灶性壞死，細(xì)胞核溶解，伴有脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象.GSK-126 5 mg/kg組(圖2C)小鼠肝細(xì)胞排列較為整齊，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常少見，輕度肝細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞病變或壞死癥狀少見.GSK-126 15 mg/kg組(圖2D)小鼠肝細(xì)胞形態(tài)、排列接近對照組小鼠，無明顯病變現(xiàn)象，僅存在輕度的水腫現(xiàn)象，說明GSK-126對肝纖維化有一定的保護(hù)作用.

A.對照組

B.CCl4處理組

C.GSK-126 5mg/kg組

D.GSK-126 15mg/kg組

2.5 Masson染色圖

Masson染色可直接顯示匯管區(qū)周邊纖維增生情況，經(jīng)Masson染色后所得的圖片顯示，對照組(圖3A)小鼠的肝臟組織基本無纖維化現(xiàn)象；而模型組(圖3B)小鼠的肝纖維化程度嚴(yán)重，血管與血管之間存在明顯的交聯(lián)；GSK-126 5 mg/kg組(圖3C)小鼠的肝纖維化程度相對于模型組來說明顯降低；GSK-126 15 mg/kg組(圖3D)小鼠的纖維化程度較GSK-126 5 mg/kg組改善更加明顯，說明GSK-126對改善小鼠肝纖維化確實有作用.

A.對照組

B.CCl4處理組

C.GSK-126 5mg/kg組

D.GSK-126 15mg/kg組

2.6 天狼猩紅染色圖

天狼猩紅染色是將小鼠的肝臟組織中的膠原纖維染成紅色，細(xì)胞核染成藍(lán)色，由此判斷小鼠的肝纖維化程度.[13]在各組小鼠的天狼猩紅染色結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，對照組(圖4A)小鼠的肝臟中幾乎無膠原纖維分布，僅靜脈區(qū)域有少量的膠原纖維分布.模型組(圖4B)小鼠的肝臟在靜脈與靜脈之間形成明顯的膠原纖維，并且將肝臟平面分割開來，同時伴有嚴(yán)重的壞死癥狀.GSK-126 5 mg/kg組(圖4C)、GSK-126 15 mg/kg(圖4D)組能明顯看見膠原纖維增生現(xiàn)象，但相對模型組來說，癥狀明顯減輕，并且GSK-126 15 mg/kg組癥狀最輕，因此，GSK-126對肝纖維化具有較好的保護(hù)作用.

A.對照組

B.CCl4處理組

C.GSK-126 5mg/kg組

D.GSK-126 15mg/kg組

3 結(jié)語

本文就GSK-126對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型是否具有保護(hù)作用進(jìn)行了探究，通過病理學(xué)、HE染色、天狼猩紅染色及Masson染色等分析肝臟形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組存在較嚴(yán)重的病變現(xiàn)象，表明其肝損模型建立成功.而GSK-126低、高劑量組小鼠在GSK-126干預(yù)下其病變結(jié)構(gòu)較少見，各項指標(biāo)均有不同程度的好轉(zhuǎn)，GSK-126 15 mg/kg組保護(hù)效果更佳.該結(jié)果與DNZep抑制肝纖維化的結(jié)論是一致的，而DNZep以SD大鼠為模型，DNZep的藥物濃度是2 mg/kg，本研究中GSK-126的濃度是5 mg/kg，且15 mg/kg的GSK-126有更好的保護(hù)效果.因此，DNZep和GSK-126的劑量還值得進(jìn)一步研究.

本實驗中GSK-126是預(yù)防性用藥，在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化過程中就同時給藥GSK-126，而GSK-126作為治療性用藥治療肝纖維化的研究仍需要探討其劑量、給藥方式以及聯(lián)合用藥的方案，由于GSK-126已用于治療腫瘤的臨床試驗，因此具有一定的安全性.