外泌體在重要臟器缺血再灌注損傷中的治療作用研究進(jìn)展

曾可君 楊煜輝 胡喆

1.廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東湛江 524000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科，廣東湛江 524000

外泌體是一類(lèi)獨(dú)特的細(xì)胞外囊泡，是細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜顆粒，可以在血液中向全身傳遞信號(hào)，其內(nèi)部的信息主要包括蛋白質(zhì)和RNA 有效載荷，通過(guò)內(nèi)陷形成包裹細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物，當(dāng)這些多泡內(nèi)泌體融合到細(xì)胞表面后，外泌體被釋放到細(xì)胞外空間，并在細(xì)胞間傳遞信息，這種載物分子的傳遞能夠調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能，從而調(diào)節(jié)疾病的過(guò)程[1]。外泌體作為細(xì)胞間通訊的強(qiáng)大載體，一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。除了研究最為廣泛的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體，其在重要器官缺血再灌注損傷中的作用及其靶向修飾治療顯示出良好臨床應(yīng)用前景，本文將對(duì)其最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的生物發(fā)生與組成

1.1 外泌體的生物發(fā)生

細(xì)胞外囊泡是由所有細(xì)胞分泌的膜囊泡，包括凋亡小體、脫落微囊泡和外泌體[1]。外泌體是從多種細(xì)胞和組織中產(chǎn)生的納米級(jí)（30～100 nm）膜性胞外小泡，其由細(xì)胞膜連續(xù)內(nèi)陷包裹DNA、RNA、脂質(zhì)、代謝物及胞漿和細(xì)胞表面蛋白等各類(lèi)信號(hào)分子所形成[2-3]。外泌體在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)一直被認(rèn)為是細(xì)胞清理廢棄物的“垃圾袋”[4]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)外泌體能夠介導(dǎo)細(xì)胞之間的通訊及物質(zhì)傳遞，并在疾病的診斷、預(yù)后與治療中發(fā)揮重要作用。

1.2 外泌體的組成

外泌體的釋放及其介導(dǎo)的信號(hào)傳遞和交叉對(duì)話存在于多種病理生理狀態(tài)下，因此，外泌體具有應(yīng)用于特定疾病的診斷、預(yù)后和治療的潛力。外泌體富含能夠傳遞細(xì)胞間通信信息的生物活性基因組和非基因組生物分子，生物化學(xué)上，其具有其特征性蛋白，包括CD63、CD14、TSG101、熱休克蛋白等[5]。除此之外，由于可被釋放到細(xì)胞外空間，外泌體還可以通過(guò)旁分泌或自分泌的方式運(yùn)輸脂質(zhì)、mRNA 和蛋白質(zhì)等信號(hào)分子，結(jié)合不同的組織微環(huán)境及外泌體含量，可改變受體細(xì)胞的生物學(xué)行為，這種外泌體介導(dǎo)的反應(yīng)既可促進(jìn)也可抑制疾病[6]。除了治療潛力外，外泌體還具有幫助疾病診斷的潛力。外泌體能夠準(zhǔn)確體現(xiàn)其“發(fā)生細(xì)胞”的來(lái)源及其生理病理狀態(tài)，由于其存在于所有生物體液中，通過(guò)采集體液樣本，可以很容易地獲得其中內(nèi)容物的組成，并進(jìn)行多組分分析，可幫助癌癥或其他疾病的診斷和預(yù)后判斷。

2 外泌體的藥物裝載與靶向修飾

外泌體的治療作用取決于封裝在其中的藥物成分及遞送效率。首先一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是如何有效地將藥物打包成外泌體。一般來(lái)說(shuō)，裝載治療藥物的主要策略有3 種：①操縱母細(xì)胞中的基因表達(dá)，從而間接改變外顯體或外顯體模擬物中的蛋白質(zhì)或RNA；②將治療性成分導(dǎo)入母細(xì)胞中，以便將其釋放到外泌體中；③直接向外泌體裝載藥物或分子。目前，具有應(yīng)用前景的裝載藥物包括低分子化學(xué)藥物，如純化蛋白、短肽及核酸等[7]，超聲處理、電穿孔、轉(zhuǎn)染、孵育、擠出、皂苷輔助裝載、轉(zhuǎn)基因、凍融循環(huán)、熱沖擊、pH 梯度法和低滲透析等方法被用于將這些藥物裝載到外泌體中[8]。

與此同時(shí)，傳統(tǒng)基因運(yùn)送載體（如質(zhì)粒、病毒）具有載體毒性、運(yùn)送效率低、炎癥反應(yīng)等諸多缺陷，而天然的外泌體載體保留了其尺寸小、無(wú)毒、親細(xì)胞等特性，與生物體具有高度的生物相容性，更適合作為藥物運(yùn)送載體。然而，天然外泌體進(jìn)入體內(nèi)后優(yōu)先分布于肝、腎、脾等器官，很快被清除[9]。因細(xì)胞膜的空間走向與外泌體質(zhì)膜極為相似，若利用目的細(xì)胞膜上的特異跨膜蛋白，如心肌歸巢肽，將其修飾于外泌體膜表面，可使外泌體獲得靶向性，提高治療效果。Kanki等[10]利用噬菌體展示技術(shù)篩選出一個(gè)組分為9 個(gè)氨基酸的歸巢肽，其可特異性地靶向到缺血后恢復(fù)灌流的心肌細(xì)胞中。但是，修飾于外泌體表面的歸巢肽有被蛋白酶降解而失去其靶向性的自身缺點(diǎn)。最近的改良方法是在歸巢肽的N 端融合1 個(gè)由5 個(gè)氨基酸殘基組成的糖基化序列，保護(hù)歸巢肽不被降解，同時(shí)增強(qiáng)歸巢肽在胞內(nèi)及外泌體上的表達(dá)，從而提高其靶向運(yùn)送的能力[11]。近年來(lái)，外泌體的裝載多樣化與不同器官靶向修飾不斷有突破，未來(lái)有一定的臨床應(yīng)用前景。

3 外泌體應(yīng)用于缺血再灌注損傷治療的研究進(jìn)展

缺血和再灌注引起的組織損傷會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，包括心肌梗死、缺血性腦卒中、急性腎損傷、外傷、循環(huán)停止、睡眠呼吸暫停綜合征。缺血再灌注損傷也是器官移植，心胸、血管及普通外科手術(shù)的主要挑戰(zhàn)。缺血器官內(nèi)代謝供需失衡導(dǎo)致嚴(yán)重的組織缺氧和微血管功能障礙。隨后的再灌注進(jìn)一步增強(qiáng)了先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)及細(xì)胞程序死亡的激活[12]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，外泌體治療應(yīng)對(duì)心、腦、腎等重要器官缺血和再灌注損傷有很好的效果。

3.1 外泌體與心肌缺血再灌注損傷

急性心肌梗死是世界范圍內(nèi)心血管疾病死亡的主要原因。及時(shí)再灌注一直被認(rèn)為是治療缺血性心臟病最有效的方法。然而，再灌注本身可能導(dǎo)致心肌損傷的加重。隨著藥物溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等再灌注療法的廣泛應(yīng)用，找到預(yù)防缺血再灌注損傷的有效手段已成為當(dāng)務(wù)之急。

源自干細(xì)胞的外泌體已被證明具有促進(jìn)血管生成和組織修復(fù)的強(qiáng)大能力。然而，天然外泌體的短半衰期和清除速率過(guò)快導(dǎo)致病變區(qū)域的治療劑量不足。有研究發(fā)現(xiàn)，一種導(dǎo)電水凝膠可結(jié)合源自人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體，將此結(jié)合物注射到大鼠缺血再灌注損傷心臟后，水凝膠有效延長(zhǎng)了外泌體在缺血心肌中的滯留時(shí)間，心臟功能得到了顯著改善[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，用單核細(xì)胞模擬物修飾間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體，可利用單核細(xì)胞的募集特征，提高對(duì)受損心肌的靶向效率，在血管生成過(guò)程中促進(jìn)內(nèi)皮成熟并在缺血再灌注損傷后調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞亞群[14]。而用FNDC5預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌更多的外泌體，且其處理所得外泌體在體內(nèi)抗炎、抗凋亡、極化M2巨噬細(xì)胞等方面具有更好的治療效果[15]。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)常從老年或患病患者身上采集，且分離的外泌體通常含有較多雜質(zhì)。Takov等[16]研究發(fā)現(xiàn)，人胎兒羊水干細(xì)胞來(lái)源的外泌體的心臟保護(hù)和促血管生成活性優(yōu)于間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體，在灌注前注射高純度的人胎兒羊水干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可使大鼠梗死面積減少（38±9）%。同時(shí)該研究結(jié)果還顯示，在體外模擬缺血再灌注損傷模型中，人胎兒羊水干細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)分離的原代心肌細(xì)胞無(wú)保護(hù)作用，表明其具有間接的心臟保護(hù)作用。脂肪細(xì)胞分泌的外泌體同樣可減輕小鼠心臟缺血/再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn)，能量緊張狀態(tài)的脂肪細(xì)胞能夠釋放含有氧化受損線粒體的外泌體，其在心臟組織中誘導(dǎo)短暫的線粒體氧化應(yīng)激，導(dǎo)致心臟產(chǎn)生補(bǔ)償性抗氧化信號(hào)以保護(hù)心肌細(xì)胞免受急性氧化應(yīng)激，從而減輕心臟缺血再灌注損傷[17]。這項(xiàng)研究表明，外泌體能夠介導(dǎo)組織之間的功能性線粒體轉(zhuǎn)移，這些脂肪細(xì)胞外泌體可能提供了有效的心臟保護(hù)生理途徑以對(duì)抗缺血應(yīng)激。除細(xì)胞器外，外泌體中的非編碼RNA 也是重要的遞送分子。研究認(rèn)為，來(lái)自間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體中的miR-25-3p通過(guò)靶向促凋亡蛋白和EZH2 減輕了缺血再灌注損傷[18]。在小鼠原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體上發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的LINC00174，其介導(dǎo)外泌體抑制心肌細(xì)胞的凋亡、空泡形成和自噬，改善了缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[19]。外泌體對(duì)心肌保護(hù)或損傷的分子機(jī)制并未完全闡明，仍需結(jié)合多組學(xué)研究以進(jìn)行更深入的探討。

3.2 外泌體與腦缺血再灌注損傷

缺血性卒中是由于大腦動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致流向大腦的血液減少所致，溶栓劑已被用于臨床誘導(dǎo)閉塞的腦動(dòng)脈再灌注。然而，腦損傷在再灌注后可繼續(xù)發(fā)展為缺血再灌注損傷。大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型已被廣泛應(yīng)用于研究腦缺血再灌注損傷。由于未修飾的外泌體靶向性較差，將其靜脈注射到缺血腦區(qū)中仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，近期研究發(fā)現(xiàn)，利用連接晚期糖基化終末產(chǎn)物受體結(jié)合肽的外泌體可作為低氧特異性的載體，用于抗miR-181a 寡核苷酸（AMO181a）的鼻腦給藥，比未修飾的外泌體更有效地將AMO181a 運(yùn)送到小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞，下調(diào)異常增高的miR-181a 表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，顯著抑制梗死面積[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在該模型下生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43 表達(dá)增加，負(fù)載槲皮素的單克隆抗體生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43 偶聯(lián)外泌體可以通過(guò)外源性生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43 與受損神經(jīng)元表達(dá)的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43 相互作用而特異性地靶向作用于受損神經(jīng)元，比單純負(fù)載槲皮素的外泌體治療的大鼠腦梗死體積更小，神經(jīng)功能恢復(fù)更明顯[21]。Tian等[22]發(fā)現(xiàn)，由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-4C 肽與乳膠黏附素融合的重組融合蛋白可自動(dòng)結(jié)合到外泌體膜上，通過(guò)大鼠尾靜脈注射人神經(jīng)祖細(xì)胞來(lái)源的天冬氨酸-乳膠黏附素融合外泌體能靶向作用于缺血腦區(qū)，并顯示出較強(qiáng)的抗炎作用。然而在臨床患者當(dāng)中，腦缺血或再灌注的損傷無(wú)可避免，因此，如何應(yīng)對(duì)缺血后腦功能恢復(fù)也是目前重點(diǎn)研究方向。利用來(lái)源于干細(xì)胞的具有修復(fù)功能的外泌體是一種新的康復(fù)策略，如Dumbrava等[23]報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)老年大鼠大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端閉塞后的神經(jīng)功能恢復(fù)和大腦重塑，有效地減少了年輕和老年大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)缺陷，促進(jìn)幼年和老年大鼠腦梗死周?chē)苌?。星形膠質(zhì)細(xì)胞則可以通過(guò)釋放包含在細(xì)胞外囊泡中的細(xì)胞介質(zhì)來(lái)加速中風(fēng)后的基礎(chǔ)恢復(fù)[24]，人羊水干細(xì)胞來(lái)源外泌體在腦缺血再灌注模型中能夠激活促生存和抗凋亡途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[25]。

3.3 外泌體與腎缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷是急性腎損傷的主要原因。近年來(lái)對(duì)缺血再灌注所致急性腎損傷的病理生理學(xué)研究表明，免疫反應(yīng)對(duì)腎臟缺血再灌注損傷和修復(fù)有重要影響。最近研究指出，小鼠靜脈注射負(fù)載核因子κB 抑制劑的外泌體后，可降低其缺血后腎臟的核因子κB活性，并顯著降低腎缺血再灌注術(shù)后的血清尿素氮、肌酐和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂鈣蛋白水平，減少細(xì)胞凋亡，與單純抑制組比較，負(fù)載核因子κB 抑制劑的外泌體治療還顯著影響了缺血后腎臟免疫細(xì)胞的數(shù)量，降低了中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞的比例[26]。干細(xì)胞來(lái)源的外泌體同樣是腎缺血再灌注損傷的前沿防治方式。研究發(fā)現(xiàn)，人尿源性干細(xì)胞可通過(guò)其外泌體中miR-146a-5p 靶向核因子κB 信號(hào)[27]。在大鼠腎缺血再灌注模型中，尿源性干細(xì)胞可以通過(guò)外體miR-146a-5p 靶向白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶1 的3’端非編碼區(qū)，抑制核因子κB p65 的核轉(zhuǎn)位和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而保護(hù)腎功能。Cao等[28]發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體能有效地向缺血腎歸巢，并主要聚集在近曲小管，其中高度富集的miR-125b-5p 可通過(guò)抑制腎小管上皮細(xì)胞中p53 蛋白的表達(dá)靶向腎小管上皮細(xì)胞的周期阻滯和凋亡，改善急性缺血性腎損傷，促進(jìn)腎小管修復(fù)。外泌體在腎缺血性損傷后血管愈合中同樣發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可促進(jìn)大鼠腎缺血再灌注損傷后的血管愈合，外泌體涂層支架在植入28 d 后可加速再內(nèi)皮化，減少支架內(nèi)再狹窄[29]。

4 總結(jié)與展望

綜上，臨床對(duì)于延長(zhǎng)外泌體的循環(huán)時(shí)間、提高靶向性及優(yōu)化外泌體來(lái)源細(xì)胞都有了新的研究進(jìn)展。由于外泌體是細(xì)胞天然來(lái)源而產(chǎn)生的，與脂質(zhì)體比較，能更有效地進(jìn)入靶細(xì)胞，并且在循環(huán)中的保留率更高，從而延長(zhǎng)了治療性物質(zhì)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。研究表明[30]，外切體上的CD47 會(huì)產(chǎn)生一個(gè)“自我保護(hù)”的信號(hào)，保護(hù)其不被吞噬，并限制其從循環(huán)中清除。這些穩(wěn)定且循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)的內(nèi)源性納米載體為藥物運(yùn)輸提供了保護(hù)，使其免于降解，并增加了藥物向靶組織的傳遞。工程外泌體上富集的配體可用于誘導(dǎo)或抑制受體細(xì)胞中的某些信號(hào)傳導(dǎo)，或?qū)⑼饷隗w靶向特定的細(xì)胞類(lèi)型，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)地治療。與此同時(shí)，外泌體RNA 可以被血源性核糖核酸酶保護(hù)而不被降解，再加上其與脂質(zhì)體比較，系統(tǒng)保留性更好，這可以使外泌體在較遠(yuǎn)的位點(diǎn)發(fā)揮功能。除了用于治療心、腦、腎缺血再灌注損傷，外泌體在脊髓[31]、肝臟[32]、肺[33]、腸道[34]缺血再灌注損傷的治療中同樣發(fā)揮一定的作用，但目前相關(guān)報(bào)道仍較少，仍需要進(jìn)一步分析探索其詳細(xì)作用機(jī)制。除此之外，目前還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的外泌體分離純化技術(shù)及包裝技術(shù)，且包裝后的外泌體能否被機(jī)體耐受、廣泛用于臨床治療，仍需反復(fù)研究。