甘肅省玉米品種DNA 指紋庫構(gòu)建進(jìn)展

孟思遠(yuǎn)

（甘肅省種子總站，甘肅 蘭州 730020）

隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化建設(shè)的推進(jìn)，農(nóng)作物良種在農(nóng)業(yè)增產(chǎn)中的科技份額不斷提高。種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最重要的有生命的生產(chǎn)資料，種子檢驗(yàn)是良種繁育的重要環(huán)節(jié)，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化和品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化是種子安全的重要保證。但由于我國現(xiàn)代種業(yè)仍存在產(chǎn)業(yè)集中度低、品種多亂雜散、行業(yè)監(jiān)管能力不強(qiáng)、國際競爭能力弱等問題，加之種子企業(yè)活力尚未充分發(fā)揮、種子產(chǎn)銷與育種科研銜接尚不緊密，難以適應(yīng)我國種業(yè)競爭力的客觀要求。《中華人民共和國種子法》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》頒布實(shí)施以來，對種子質(zhì)量監(jiān)管又提出新的要求，常規(guī)4 項(xiàng)檢測已無法滿足現(xiàn)階段的種子發(fā)展要求，種子質(zhì)量監(jiān)管不斷將轉(zhuǎn)基因成分鑒定、品種真實(shí)性分子檢測等項(xiàng)目納入質(zhì)量監(jiān)管要求。其中，DNA 指紋圖譜就是品種真實(shí)性分子檢測的重要判定依據(jù)，DNA 指紋相當(dāng)于給每一玉米品種頒發(fā)一個(gè)身份證，通過玉米DNA 指紋圖譜分析，一方面可以用于真實(shí)性檢測，打擊套牌品種的侵權(quán)違法行為，維護(hù)種子市場健康發(fā)展，保障農(nóng)民的基本權(quán)益，助力我國糧食安全；另一方面DNA 指紋庫的建成可以為育種家提供DNA 層面的數(shù)據(jù)支持，促進(jìn)科技創(chuàng)新能力的持續(xù)提升，持續(xù)增強(qiáng)種業(yè)競爭實(shí)力，充分發(fā)揮種子企業(yè)的積極作用，推進(jìn)育繁推一體化的現(xiàn)代種業(yè)健康發(fā)展，為實(shí)現(xiàn)“供種數(shù)量安全、種子質(zhì)量安全、品種種植安全、種子產(chǎn)業(yè)安全”提供有力的政策支持和堅(jiān)實(shí)的技術(shù)和數(shù)據(jù)保障，助力我國種業(yè)實(shí)現(xiàn)自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)型性跨越，為我國解決種業(yè)“卡脖子問題”提供思路。

構(gòu)建玉米標(biāo)準(zhǔn)DNA 指紋庫立足于種業(yè)振興，著眼于當(dāng)前全省玉米種業(yè)發(fā)展的短板問題，以凈化種業(yè)市場和保障全省種子質(zhì)量安全為目標(biāo)，通過構(gòu)建省級玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫，既可以避免無對照樣品導(dǎo)致無法檢測的問題，還可以解決反復(fù)檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品造成的浪費(fèi)；同時(shí)還能快速根據(jù)圖譜查找相似品種，提供直觀有效的對比數(shù)據(jù)，助力完善全省種子質(zhì)量檢測體系和市場監(jiān)管體系。督促制種企業(yè)提升質(zhì)量控制意識，繼而提高企業(yè)自主創(chuàng)新能力、知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)能力、企業(yè)的市場競爭能力和供種保障能力，從而實(shí)現(xiàn)甘肅省由種業(yè)大省向種業(yè)強(qiáng)省的良好跨越。

1 甘肅省玉米制種產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀

甘肅省已發(fā)展成為全國最大的雜交玉米種子產(chǎn)區(qū)，特別是以河西走廊為主的玉米種子生產(chǎn)基地，具有地勢平坦、氣候干燥、降雨量少、光照充足、晝夜溫差大、灌溉便利的自然優(yōu)勢，是“天然的種子生產(chǎn)車間”和“天然的倉庫”，河西地區(qū)年產(chǎn)種量占全國玉米生產(chǎn)用種量的60%左右，是全國現(xiàn)代農(nóng)作物種業(yè)三大核心基地之一。近年來，甘肅省玉米種子生產(chǎn)基地綜合能力提高顯著，種業(yè)發(fā)展迅速，所生產(chǎn)的玉米種子質(zhì)量指標(biāo)好，籽粒飽滿，生活力強(qiáng)，千粒重、發(fā)芽率高，種子色澤鮮亮，商品性好，在市場上具有較強(qiáng)的競爭力。2020 年全省玉米制種面積86 400 hm2，產(chǎn)種5.46 億kg，分別占全國總面積和總產(chǎn)量的55.6%和59.7%，保障了全國50%以上的大田玉米用種。“張掖玉米種子”已獲得全國唯一的種子國家地理商標(biāo)證書。甘肅省的玉米制種產(chǎn)業(yè)已形成規(guī)模，對全國的糧食生產(chǎn)起到舉足輕重的作用。

農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化，種子是基礎(chǔ)，“種業(yè)翻身仗”更是把種業(yè)安全、種子質(zhì)量提到新高度。作為制種大省，為提升甘肅省種子質(zhì)量水平，加大假劣種子監(jiān)管力度，嚴(yán)厲打擊套牌品種侵權(quán)違法，甘肅省率先在全國開展省級DNA 指紋庫和國家指紋庫的對接工作，并著手構(gòu)建甘肅省審定玉米品種DNA 指紋圖譜庫和標(biāo)準(zhǔn)樣品庫。

通過對審定的玉米品種構(gòu)建省級標(biāo)準(zhǔn)樣品庫，并對入庫品種進(jìn)行DNA 指紋圖譜構(gòu)建，推進(jìn)品種信息多元化應(yīng)用，為品種準(zhǔn)入、驗(yàn)證、追溯提供基礎(chǔ)信息。同時(shí)持續(xù)推進(jìn)與國家DNA 標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋庫對接，形成國家、省、市、縣4 級數(shù)據(jù)共享平臺，推動種業(yè)信息數(shù)據(jù)共享事業(yè)的快速發(fā)展。

通過構(gòu)建省級標(biāo)準(zhǔn)樣品庫及標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫，能有效解決因甘肅省玉米DNA 指紋庫品種數(shù)據(jù)不全、信息不完善導(dǎo)致種子品種侵權(quán)生產(chǎn)、套牌銷售的種子無法及時(shí)檢測的問題。項(xiàng)目的實(shí)施為品種鑒定提供及時(shí)有效的種子樣品，為育種家品種維權(quán)提供權(quán)威有效的技術(shù)服務(wù)，為侵權(quán)案件真實(shí)性檢測縮短了檢測周期。

新《種子法》頒布實(shí)施后，甘肅省的品種審定工作出現(xiàn)了新變化，隨著試驗(yàn)單位的范圍擴(kuò)大，甘肅省每年審定通過的品種也在不斷增加，單玉米而言，2015 年至2021 年甘肅省審定通過的品種分別為33個(gè)、8 個(gè)、35 個(gè)、83 個(gè)、9 個(gè)、132 個(gè)、145 個(gè)，共計(jì)445個(gè)。玉米標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫的構(gòu)建，為加強(qiáng)育種家的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)，調(diào)動企業(yè)的自主研發(fā)積極性，提供了數(shù)據(jù)保障和技術(shù)支持。

隨著種子質(zhì)量檢測技術(shù)的提升，傳統(tǒng)的常規(guī)4項(xiàng)（水分、發(fā)芽率、凈度、純度檢測）已不能滿足現(xiàn)階段種子市場的需求，未審定品種冒充審定品種、套牌品種侵權(quán)違法等現(xiàn)象，擾亂了正常的種子市場秩序。隨著種子品種增多，同質(zhì)化嚴(yán)重，肉眼無法判斷品種差異，分子檢測技術(shù)就至關(guān)重要，DNA 分子片段檢測，具有周期短、耗時(shí)少且靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，填補(bǔ)了常規(guī)DUS 測試所不能發(fā)現(xiàn)的性狀差異，同時(shí)從基因?qū)用媾袛嗥贩N差異，通過檢測技術(shù)升級，實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確鑒定品種的真實(shí)性，為市場監(jiān)管提供強(qiáng)有力判別證據(jù)。

2 甘肅省玉米品種DNA 指紋庫構(gòu)建情況

2.1 指紋庫構(gòu)建準(zhǔn)備工作

為構(gòu)建甘肅省玉米標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫，省種子總站（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部玉米種子質(zhì)量監(jiān)督檢測中心（蘭州）、甘肅省農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心）不斷提升檢測能力，兩個(gè)“中心”分別通過了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部及國家認(rèn)監(jiān)委、省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳的資質(zhì)認(rèn)定和機(jī)構(gòu)考核，先后獲得了檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)證證書（CMA），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部審查認(rèn)可證書、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測機(jī)構(gòu)考核合格證書（CATL）、農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)合格證書（CASL）。在中心技術(shù)人員的共同努力下，中心每年一次性通過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心、全國農(nóng)技中心等單位組織的轉(zhuǎn)基因、品種真實(shí)性和種子常規(guī)項(xiàng)目的能力驗(yàn)證檢測工作并取得優(yōu)秀等次。中心為實(shí)現(xiàn)建庫需求，在聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測種子真實(shí)性的基礎(chǔ)上，購置高通量PCR 儀、高速冷凍離心機(jī)、凝膠成像系統(tǒng)、ABI3500 基因測序儀和自動化工作站等多臺（套）高端進(jìn)口儀器設(shè)備，具備了建設(shè)DNA 標(biāo)準(zhǔn)指紋庫的硬性條件；同時(shí)多次派遣具有分子生物學(xué)背景的專業(yè)技術(shù)人員前往全國農(nóng)技中心、北京農(nóng)林科學(xué)院等單位進(jìn)行真實(shí)性檢測、DNA 指紋圖譜建庫、SSR 檢測方法探究等相關(guān)培訓(xùn)；中心還得到上級主管部門的大力支持，在2016 年聯(lián)合國家相關(guān)單位成功對接國家標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫，成為全國首家與國家指紋庫對接的省級檢測平臺，真正做到省檢測中心檢測的樣品和國家數(shù)據(jù)庫內(nèi)的樣品無差異對接，實(shí)現(xiàn)了分子檢測數(shù)據(jù)共享的跨越式發(fā)展。指紋庫對接后，甘肅省的DNA 指紋在中心檢測完成后就能同步與國家指紋庫比對，大大提高了甘肅省玉米種子的檢測效率和檢測能力，實(shí)現(xiàn)了檢驗(yàn)檢測技術(shù)的新突破。

2.2 指紋庫構(gòu)建現(xiàn)狀

甘肅省的指紋庫樣品要具有本地代表性，同時(shí)確保樣品是來源可靠的親本家種子。自2015 年中心平臺搭建完善后，檢測中心與農(nóng)作物評審委員會聯(lián)合實(shí)施，將每年甘肅省審定通過的玉米品種標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行DNA 指紋庫建庫工作。檢測中心使用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)開展指紋庫構(gòu)建工作。SSR 即簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也稱微衛(wèi)星DNA，是目前最常用的微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)。玉米品種的鑒別分析就是通過不同玉米品種遺傳組成不同，基因組DNA 中簡單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)存在差異，這種差異可以通過PCR 擴(kuò)增及電泳進(jìn)行片段大小測定進(jìn)行檢測的原理實(shí)現(xiàn)的。由于SSR 重復(fù)數(shù)目變化較大，所以通過SSR 分子標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)較高的多態(tài)性。依據(jù)現(xiàn)階段的種子檢測主要方法及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)——《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR 標(biāo)記法》（NT/T 1432-2014），選用一套（40 對）多態(tài)性高的SSR 引物進(jìn)行指紋庫構(gòu)建工作。

檢測中心通過標(biāo)準(zhǔn)樣品收集、樣品登記及編制溯源信息、樣品預(yù)處理、樣品粉碎、DNA 提取、DNA 濃度測定、PCR 體系配置、PCR 擴(kuò)增、毛細(xì)管電泳、數(shù)據(jù)分析、校驗(yàn)核對、數(shù)據(jù)上傳等環(huán)節(jié)完成建庫工作。其中每一個(gè)樣品均通過2～3 組平行試驗(yàn)，40 對核心引物擴(kuò)增，最終篩選出最優(yōu)條帶，形成40 個(gè)指紋圖譜并上傳至指紋圖譜庫。近年來，正是通過大量實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)分析及人員比對，逐步構(gòu)建完善了甘肅省玉米標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫。

隨著甘肅省玉米標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫建設(shè)工作的深入，參與建庫的檢驗(yàn)人員已可以通過圖譜峰值及圖譜形態(tài)，分析出玉米品種的特異性及甘肅省審定品種的圖譜特點(diǎn)，為下一步開展大規(guī)模的建庫及其他作物的建庫工作積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

3 指紋庫構(gòu)建展望

建庫至今，甘肅省已將2015 至2020 年審定通過的300 個(gè)品種悉數(shù)入庫，形成12 000 余份數(shù)據(jù)圖譜，無論是品種數(shù)量還是數(shù)據(jù)完整性，都位于全國前列。甘肅省玉米標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 指紋庫的建成，極大提升了甘肅省種子質(zhì)量檢測隊(duì)伍的檢測能力，調(diào)動了育種家的育種積極性，震懾了造假套牌行為的發(fā)生，確保了農(nóng)民的用種安全，進(jìn)一步保障了國家的糧食安全。

目前中心的人員配置及建成的轉(zhuǎn)基因檢測平臺，真實(shí)性檢測平臺，均在全國處于領(lǐng)先地位。其中尤為突出的是2018 年中心順利通過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的甘肅省農(nóng)作物品種登記認(rèn)證檢測分中心建設(shè)項(xiàng)目。該項(xiàng)目通過使用LGC 平臺，SNP 的技術(shù)手段開展品種登記認(rèn)證工作。SNP 的檢測手段是目前種子檢測領(lǐng)域最先進(jìn)的技術(shù)方式，會在現(xiàn)有SSR 的技術(shù)上，大大提高檢測通量和檢測能力，縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率。甘肅省作為全國第一批省級農(nóng)作物品種登記認(rèn)證檢測分中心，是國內(nèi)最早驗(yàn)收并投入使用的檢測平臺，現(xiàn)已開展相關(guān)圖譜驗(yàn)證工作。2020 年以來，中心通過SNP 平臺有效參與國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“七大農(nóng)作物育種”重點(diǎn)專項(xiàng)“主要農(nóng)作物種子分子指紋檢測技術(shù)研究與應(yīng)用”項(xiàng)目驗(yàn)證工作，完成SNP驗(yàn)證試驗(yàn)198 份，標(biāo)記位點(diǎn)18 045 個(gè)。隨著審定品種的增多、技術(shù)手段的提升和檢驗(yàn)人員技術(shù)的提高，甘肅省的標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋庫將會不斷完善，省級檢測中心將通過提升自身檢測水平，開展基層檢驗(yàn)員培訓(xùn)、助力市州一級檢測中心技術(shù)提升，其中臨澤縣建成的張掖國家級玉米種子生產(chǎn)基地種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心已成為玉米種子檢測項(xiàng)目全覆蓋的檢測機(jī)構(gòu)，2017年該中心成功對接國家玉米DNA 指紋庫，成為我國唯一一家縣級對接成功的檢測機(jī)構(gòu)。同時(shí)，中心也將引導(dǎo)有分子檢測能力的基層檢測中心積極擴(kuò)展分子檢測項(xiàng)目等，為提高種子市場監(jiān)管水平，打擊套牌侵權(quán)品種的生產(chǎn)銷售，促進(jìn)種子生產(chǎn)，促使經(jīng)營者增強(qiáng)質(zhì)量意識；科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)支撐和服務(wù)，為推進(jìn)我國非主要農(nóng)作物品種更新和市場監(jiān)管，確保品種的真實(shí)性和生態(tài)的適應(yīng)性提供保障；提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)，提高市場競爭力，增加農(nóng)民收入；提升種業(yè)自主創(chuàng)新能力、知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)能力、企業(yè)的市場競爭能力，為國家種業(yè)安全提供技術(shù)保障。