3D 打印“生物活性支架”過(guò)程中細(xì)胞損傷的研究進(jìn)展

余海洋 趙紅斌 劉純 賈中芝

【提要】 近年來(lái)，3D 打印“生物活性支架”已成為研究的熱點(diǎn)。雖然3D 打印生物活性支架取得了巨大的進(jìn)步，但在生物活性支架打印過(guò)程中，多種因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至細(xì)胞死亡，主要包括以下幾種原因：①不同的打印方式產(chǎn)生的細(xì)胞損傷方式及損傷的程度各不相同，如熱損傷、擠壓損傷、剪切和拉伸應(yīng)力損傷等；②接收基板是否有涂層，以及涂層的厚度和原材料種類等。接收基板的涂層可以起到細(xì)胞培養(yǎng)液和碰撞緩沖的雙重作用，會(huì)對(duì)細(xì)胞損傷產(chǎn)生一定程度的影響，細(xì)胞損傷的程度直接影響了3D 打印生物活性支架的生物活性。本文對(duì)生物活性支架打印過(guò)程中的細(xì)胞損傷的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

3D 打印“生物活性支架”是使用活細(xì)胞與支架材料混合成“生物墨水”，然后通過(guò)3D 打印的方式獲得生物活性支架，如皮膚支架、骨支架、軟骨支架等[1-4]。隨著3D 打印技術(shù)和材料學(xué)的快速發(fā)展，3D 打印生物活性支架取得了巨大的進(jìn)步[5]，但在3D 打印過(guò)程中，細(xì)胞將承受擠壓、高溫及碰撞等多重因素作用，如果損傷超越細(xì)胞承受能力，就會(huì)引起細(xì)胞的死亡[6]。因此，如何降低3D 打印過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損傷，維持細(xì)胞的活性，是目前3D 打印“生物活性支架”過(guò)程中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[7]。

在生物活性支架的3D 打印過(guò)程中，有多種因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。本文對(duì)生物活性支架3D 打印過(guò)程中細(xì)胞損傷研究的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 3D 打印方式對(duì)細(xì)胞損傷的影響

目前，適用于生物活性支架的3D 打印方式主要有擠壓式3D 生物打印、噴墨3D 生物打印、激光輔助3D 生物打印和聲控3D 生物打印。其工作原理各不相同，但在生物活性支架3D 打印過(guò)程中，均會(huì)對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷。

1.1 擠壓式3D 生物打印

擠壓式3D 生物打印是以機(jī)械力或氣壓等為驅(qū)動(dòng)力，從噴頭擠壓出“生物墨水”，從而構(gòu)建生物活性支架。該方式打印速度較快，有利于控制支架的孔隙結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的密度，適用于高黏度和高細(xì)胞密度的生物墨水打印。該技術(shù)在墨水材料種類、生物相容性、三維成型能力等方面具有綜合優(yōu)勢(shì)，是使用最為廣泛的生物活性支架打印方式[9]。

擠壓式3D 生物打印的壓力驅(qū)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至細(xì)胞死亡[10]。打印過(guò)程中，生物墨水從墨水倉(cāng)被擠壓至噴嘴、平臺(tái)，管道內(nèi)壁會(huì)對(duì)生物墨水產(chǎn)生一定的剪切力[11]。這種印刷機(jī)制會(huì)使細(xì)胞承受持續(xù)的剪切力和拉伸應(yīng)力，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞受損，且細(xì)胞損傷程度與剪切力的大小相關(guān)[12]。通常情況下，剪切力與距管道內(nèi)壁的距離呈負(fù)相關(guān)；另外，生物墨水的黏度、擠壓力的大小、噴嘴的內(nèi)徑也直接影響剪切力的強(qiáng)度，從而影響細(xì)胞的損傷程度[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，擠壓式3D 生物打印墨水的溫度對(duì)細(xì)胞的損傷也有一定的影響[14]。

因此，剪切力是擠壓式3D 生物打印過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素。在擠壓式生物打印過(guò)程中，如何在保持細(xì)胞活性（降低細(xì)胞損傷）和打印速度的同時(shí)，又能降低壓力并減小噴嘴尺寸是該打印方式的主要研究?jī)?nèi)容。此外，3D 生物打印過(guò)程中控制好生物墨水的黏度（不宜過(guò)高或過(guò)低），尋找合適的黏彈性區(qū)間，也是實(shí)現(xiàn)良好3D 生物打印的重要步驟。

1.2 噴墨生物打印

噴墨生物打印是通過(guò)使用計(jì)算機(jī)控制，然后將生物墨水以液滴的形式精確打印在接收基板上，然后利用紫外光層固化，最終獲得3D 生物活性支架[15]。該打印方式獲得的3D 生物活性支架內(nèi)的細(xì)胞活性比較高，而且成本相對(duì)較低，但無(wú)法打印黏度較高的生物墨水，并且細(xì)胞在培養(yǎng)液中的分散程度也很難控制，且打印效率較低[16]。

噴墨打印主要采用微熱泡或壓電驅(qū)動(dòng)器噴射液滴來(lái)實(shí)現(xiàn)生物活性支架的3D 打印。熱氣泡的產(chǎn)生和壓電的變形會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷，因此控制打印工藝參數(shù)是降低細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素[17]。熱噴墨打印時(shí)，加熱元件迅速達(dá)到高溫，使噴嘴處的生物墨水形成氣泡，氣泡就會(huì)產(chǎn)生壓力使一定量的生物墨水液滴克服表面張力被擠壓出孔口，然后從孔口噴射出來(lái)，噴嘴的最高溫度在300 ℃以上，極易造成生物墨水中細(xì)胞的熱損傷；另外，在氣泡形成與噴射過(guò)程中，生物墨水中的細(xì)胞還會(huì)受到擠壓損傷[15]。反之，壓電驅(qū)動(dòng)器噴射方法，打印脈沖在10～25 μs 時(shí)，細(xì)胞的存活率高達(dá)96%，表明壓電噴射對(duì)細(xì)胞的損傷較微熱泡驅(qū)動(dòng)方式小[18]。

噴墨打印的噴射速度不同，產(chǎn)生的剪切應(yīng)力也不同，導(dǎo)致的細(xì)胞損傷程度也不同[19]。當(dāng)噴射速度為5～8 m/s 時(shí)，細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力的數(shù)值比較穩(wěn)定，當(dāng)噴射速度達(dá)到10 m/s時(shí)，細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力增幅逐漸變大，尤其是在40 m/s 之后，細(xì)胞受到的剪切應(yīng)力增長(zhǎng)越來(lái)越快[17]。還有研究表明，適當(dāng)增加打印時(shí)間的間隔，也可以有效減少細(xì)胞在著落過(guò)程中的受力，從而降低細(xì)胞的機(jī)械性損傷[17]。

1.3 激光輔助生物打印

基于激光誘導(dǎo)正向移動(dòng)的技術(shù)，利用聚焦激光脈沖產(chǎn)生的高壓氣泡，將生物墨水推向接受基板，從而構(gòu)建生物活性支架。該打印技術(shù)在維持細(xì)胞活性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了生物墨水的精確和高分辨率3D 打印，常用于高黏度的生物墨水和含有高濃度細(xì)胞的3D 生物打印，但是成本相對(duì)高，效率較低，且不利于多種細(xì)胞的混合生物打印[20-21]。

通過(guò)激光束使局部產(chǎn)生高溫，進(jìn)而使細(xì)胞懸浮液氣化并產(chǎn)生氣泡，最后噴射出細(xì)胞液滴，該過(guò)程中細(xì)胞同樣會(huì)受到一定程度的熱損傷[18]。另外，其噴射速度高（50～1 000 m/s），噴射時(shí)細(xì)胞承受的壓力大（8～15 MPa），在細(xì)胞著落在接受基板上時(shí)，細(xì)胞與接收基板的物理碰撞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞剪切損傷（如細(xì)胞膜破裂等），甚至細(xì)胞死亡[23]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞損傷程度隨著激光能量密度的增加而增大（85～1 500 MJ/cm2）[23]；即使對(duì)于耐受力較強(qiáng)的酵母細(xì)胞，仍有10%～55%的細(xì)胞在噴射后發(fā)生死亡[23]。

1.4 聲控生物打印

采用表面聲波控制，在壓電基板上周期性排列著一系列的聲控發(fā)生器，由圓形的傳感器組成，并組成二維陣列，同時(shí)需要打印的細(xì)胞懸浮液在壓電基體上。由于傳感器產(chǎn)生的聲波是圓形的，這些聲音就會(huì)在細(xì)胞懸浮液表面形成焦點(diǎn)，當(dāng)焦點(diǎn)處的聲壓超過(guò)液體表面張力時(shí)，在空氣與液滴的接口處就會(huì)產(chǎn)生聲控打印液滴。在打印過(guò)程中，雖然細(xì)胞液滴不會(huì)受到高溫、高壓的影響，但是在打印含單細(xì)胞液滴時(shí)，該技術(shù)有時(shí)會(huì)打印出不含細(xì)胞的液滴，其在打印單細(xì)胞時(shí)的可靠性較弱，重復(fù)性較差。

研究表明，細(xì)胞在聲控生物打印后的存活率高達(dá)89.9%[24-25]，可見(jiàn)該打印方式對(duì)細(xì)胞的損傷程度較小，但該打印方式損傷細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚，仍需深入研究。

2 接收基板對(duì)細(xì)胞損傷的影響

接收基板的作用是接受被打印的細(xì)胞、承載構(gòu)建的生物活性支架。接收基板上是否有涂層、涂層的厚度以及涂層的原材料，均會(huì)對(duì)細(xì)胞損傷產(chǎn)生一定的影響。目前，最常用的涂層是水凝膠，水凝膠可以起到細(xì)胞培養(yǎng)液和碰撞緩沖劑的雙重作用[26-27]。

2.1 接收基板的涂層及其厚度

對(duì)于高速3D 生物打印技術(shù)，接收基板有無(wú)涂層材料及其涂層材料的厚度均對(duì)細(xì)胞的受力有一定的影響[17]。在激光輔助生物打印過(guò)程中，使用不加涂層的石英接收基板，只能獲得5%的細(xì)胞存活率，當(dāng)在基板上涂抹了20 μm 的水凝膠時(shí)，細(xì)胞的存活率就提高到了50%，水凝膠的涂層為40 μm時(shí)，細(xì)胞的存活率就提高到了95%[27]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接收基板上沒(méi)有任何涂層時(shí)，即接收基板上無(wú)緩沖/培養(yǎng)物質(zhì)，生物墨水中的細(xì)胞被打印到接收基板時(shí)承受的應(yīng)力和剪切應(yīng)力均為最大；當(dāng)接收基板涂有水凝膠時(shí)，生物墨水中的細(xì)胞被打印到接收基板時(shí)承受的應(yīng)力和剪切應(yīng)力變小，且隨著水凝膠涂層厚度的增加，應(yīng)力和剪切應(yīng)力均逐漸減小，即使接收基板上只涂一層薄薄的水凝膠（20 μm），都可以顯著降低生物墨水中細(xì)胞承受的應(yīng)力和剪切應(yīng)力，降低細(xì)胞機(jī)械損傷的程度[18]。因此，接收基板上的涂層及其厚度均直接或間接影響細(xì)胞的損傷程度。

2.2 接收基板涂層的原材料

接收基板涂層的原材料對(duì)細(xì)胞的損傷也有一定的影響。在相同的3D 打印條件下，當(dāng)接收基板的涂層為液態(tài)培養(yǎng)液時(shí)，細(xì)胞的存活率為93%，而接收基板的涂層為半固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞的存活率增加至96%[18]。因此，接收基板涂層原材料的性質(zhì)也在一定程度上影響細(xì)胞的損傷。

3 結(jié)論

在生物活性支架打印過(guò)程中，多種因素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，不同的打印方式引起的細(xì)胞損傷程度各不相同，如熱損傷、擠壓損傷、剪切和拉伸應(yīng)力損傷等；接收基板是否有涂層以及涂層的厚度和原材料種類等。在生物活性支架打印過(guò)程中，如何減少細(xì)胞損傷，仍需要進(jìn)一步對(duì)打印方式、打印參數(shù)、細(xì)胞著落過(guò)程中的受力情況等展開(kāi)深入的研究。