柏參洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳麗京，高 璟，周偉瓊，劉艷敏

（1.暨南大學(xué)附屬順德醫(yī)院（順德第二人民醫(yī)院），廣東 佛山 528305；2.廣東和翔制藥有限公司，廣東 廣州 510385）

濕氣入侵及身體虛弱易導(dǎo)致婦女身體皮膚尤其是會陰部位出現(xiàn)濕疹、腫脹等癥狀，危害女性健康，引發(fā)一系列并發(fā)癥。臨床上除口服藥物治療外，也多使用各類中藥洗劑，起到提升預(yù)后、降低毒副作用和便于患者自行完成后續(xù)輔助治療等目的[1-2]?；谖以簩?shí)際臨床處方和診療情況，我們根據(jù)婦科臨床驗(yàn)方開發(fā)出柏參洗劑用于婦科相關(guān)疾病的治療。該制劑由黃柏、苦參、土茯苓、野菊花、紫花地丁、甘草等藥味組成，起祛濕、補(bǔ)氣虛的功效。由于其臨床療效好，患者預(yù)后較為理想，為將其開發(fā)為現(xiàn)代化院內(nèi)中藥制劑，有必要對其各藥味尤其是君藥進(jìn)行鑒別和含量測定研究，以更加科學(xué)地控制該制劑的質(zhì)量[3-5]。

柏參洗劑以黃柏、苦參為君藥，土茯苓為臣藥，其余藥味作為佐使藥。其中，黃柏、苦參含有多種生物堿，文獻(xiàn)報道具有殺菌消毒、增強(qiáng)免疫力、抗感染等藥理活性[6-7]。同時，中醫(yī)藥治療皮膚、婦科疾病的臨床和藥理研究表明，黃柏-苦參可作為藥對，與其他藥味組方治療相關(guān)疾病，研究經(jīng)驗(yàn)豐富，開發(fā)相關(guān)制劑具有較強(qiáng)的科學(xué)性、適應(yīng)性和可行性[8]。

鑒于此，本研究擬參考藥典標(biāo)準(zhǔn)及醫(yī)院制劑研發(fā)相關(guān)規(guī)范、文獻(xiàn)，對柏參洗劑進(jìn)行薄層色譜鑒別和高效液相色譜含量測定研究，科學(xué)、全面、規(guī)范地評價該制劑的質(zhì)量，為后續(xù)的制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和研究經(jīng)驗(yàn)。

1 儀器與材料

TLC鑒 別 使 用CAMAG REPROSTAR 3型 薄 層成像系統(tǒng)（瑞士CAMAG公司）和CAMAG TLC SAMPLER 4型自動點(diǎn)樣儀（瑞士CAMAG公司）；樣品和對照品稱量使用METTLER TOLEDO分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；含量測定使用Wa‐ters 2695e高效液相色譜儀，配備PDA檢測器、自動進(jìn)樣器和柱溫箱（美國Waters公司）?？鄥ⅲㄅ枺?21019-201708）、黃柏（批號：121510-201807）對照藥材，鹽酸黃柏堿對照品（批號：111895-201805）購自中國食品藥品檢定研究院。樣品制備用甲醇、乙醇等試劑為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；含量測定流動相用乙腈、磷酸為色譜純，購自Merck（德國）。黃柏、苦參、土茯苓、野菊花、紫花地丁、甘草等藥材飲片購自廣州至信藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別（1）黃柏的TLC鑒別方法：參考藥典標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行適當(dāng)修改，取柏參洗劑30mL，水浴蒸干后殘渣加入含1%醋酸的甲醇溶液40mL，超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至2mL，得供試品溶液；另取黃柏對照藥材0.1g，同法制成對照藥材溶液。吸取供試品溶液10μL，對照藥材溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，三氯甲烷-甲醇-水（30:15:4）的下層溶液為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。結(jié)果供試品與對照品有相同斑點(diǎn)對應(yīng)，且陰性對照無干擾。結(jié)果表明，本方法能夠成功鑒別柏參洗劑中的黃柏（圖1）。（2）苦參的鑒別方法：取本品30mL，水浴蒸干后，殘渣加濃氨水0.3mL，三氯甲烷25mL，放置過夜，濾過，濾液水浴蒸干，加1mL三氯甲烷復(fù)溶，制得供試品溶液。另取苦參對照藥材，同法制成對照藥材溶液。吸取供試品溶液10μL，對照藥材溶液5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板（2%氫氧化鈉溶液制備）上，以甲苯-丙酮-甲醇（8:3:0.5）為展開劑，展開，展距8cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2:4:2:1）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，依次噴以碘化鉍鉀試液和亞硝酸鈉乙醇試液。結(jié)果供試品與對照品有相同斑點(diǎn)對應(yīng)，且陰性對照無干擾。結(jié)果表明，本方法能夠成功鑒別柏參洗劑中的苦參（圖2）。（3）上述方法建立后，對其進(jìn)行方法學(xué)和耐用性考察，在低溫低濕（4℃、RH 25%），低溫高濕（4℃、RH 75%），常溫低濕（25℃、RH 25%）和常溫高濕（25℃、RH 75%）環(huán)境下考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，溫濕度變化對黃柏、苦參的TLC鑒別無明顯影響，表明方法耐用性和適應(yīng)性良好。

圖1 苦參薄層色譜鑒別結(jié)果

圖2 黃柏薄層色譜鑒別結(jié)果

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液制備方法 精密稱取黃柏堿對照品約10mg，加乙腈-0.1%磷酸水溶液（36:64，v/v）溶解，制得濃度為每mL含1mg黃柏堿的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備方法 精密吸取柏參洗劑1mL，置于10mL容量瓶中，加乙腈-0.1%磷酸水溶液（36:64，v/v）稀釋并加至刻度。所得溶液濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 含量測定方法 使用LiChrospher C18色譜柱（250×4.6mm，填料粒徑5μm），色譜條件為乙腈-0.1%磷酸水溶液（含2mg/mL的十二烷基磺酸鈉），比例為36:64；流速1.0mL/min，檢測波長284nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。對照品（50μg.mL）和供試品色譜圖見圖3。

圖3 供試品和對照品（50μg/mL）

2.2.4 含量測定方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性 精密吸取“2.2.1”項下配制的對照品溶液，加乙腈-0.1%磷酸水溶液（36:64，v/v）稀釋，分別制成每mL含黃柏堿200、100、50、20、10μg的溶液，吸取上述溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，作為縱坐標(biāo)y，濃度作為橫坐標(biāo)x，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=25340x-220723（r2=0.9995）。結(jié)果表明，方法在10~200μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.2.4.2精密度 吸取供試品溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，連續(xù)6次，記錄黃柏堿峰面積，計算RSD值。結(jié)果得RSD為0.90%，表明方法精密度良好。

2.2.4.3 穩(wěn)定性 將供試品溶液放置在HPLC的自動進(jìn)樣器中，放置后分別于0、2、4、6、8、12h使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，計算含量和含量的RSD值。結(jié)果得RSD為1.82%，表明方法所制供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4.4 重復(fù)性 按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，計算RSD值。結(jié)果得RSD為1.98%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 加樣回收率 精密吸取柏參洗劑0.5mL置于10mL容量瓶中，加入黃柏堿對照品溶液適量（表1），加乙腈-0.1%磷酸水溶液（36:64，v/v）稀釋并加至刻度。所得溶液濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。吸取所得溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，計算含量，回收率和回收率的RSD值。結(jié)果得平均回收率為96.74%，RSD為2.65%，表明方法準(zhǔn)確度良好（表1）。

表1 加樣回收率測定結(jié)果（n=3）

2.3 樣品測定結(jié)果 取10批柏參洗劑，按“2.2.2”項下方法每批樣品平行制備2份供試品溶液，使用“2.2.3”項下的HPLC方法測定，記錄黃柏堿峰面積，計算含量。結(jié)果顯示，10批樣品黃柏堿含量為0.6017~0.8065 mg/mL（表2）。

表2 10批樣品含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

柏參洗劑共有6個藥味，其中黃柏、苦參已成功開發(fā)出薄層鑒別方法，能夠滿足制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的需要。為完善研究資料，同時更加全面地了解該制劑的質(zhì)量信息，我們還參考藥典或文獻(xiàn)方法對土茯苓、野菊花、紫花地丁、甘草等藥味進(jìn)行了TLC鑒別方法摸索[9-11]。結(jié)果顯示，土茯苓、野菊花、紫花地丁經(jīng)優(yōu)化后未在供試品中找到與對照藥材相對應(yīng)的斑點(diǎn)；甘草雖有清晰斑點(diǎn)與對照藥材對應(yīng)，但陰性對照存在干擾。因此，上述藥味的鑒別方法均不列入本文。

在方中無法檢出土茯苓、野菊花、紫花地丁、甘草等藥味的原因，可能與柏參洗劑的制備方法有關(guān)：該制劑為藥材飲片水提制備，由于溶劑極性和工藝條件（溶劑量、提取時間、提取循環(huán)等）的限制，部分成分可能無法得到充分提取，或在提取過程中受到破壞。同時，TLC法無法排除一些保留值和斑點(diǎn)相似的成分，因此容易存在陰性干擾。上述因素可能導(dǎo)致方中部分藥味無法檢出，但由于本文所用方法能夠成功檢出黃柏、苦參斑點(diǎn)，參考《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑管理規(guī)范》相關(guān)規(guī)定，列入正文藥味達(dá)到或超過全方的1/3，具有較好的代表性，因此可以認(rèn)為本研究成功建立了柏參洗劑的鑒別方法。

含量測定研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們曾經(jīng)將苦參堿和氧化苦參堿列入標(biāo)準(zhǔn)，但由于上述兩種成分在制劑中的峰響應(yīng)明顯低于黃柏堿，且其與后者洗脫所需流動相條件差異較大，加之分離苦參堿與氧化苦參堿需要更加復(fù)雜的梯度條件，故最終僅將黃柏堿列為含量測定指標(biāo)。在優(yōu)化色譜條件時，所涉及因素較少，且無需對藥典方法進(jìn)行修改，提高了研究效率。此外，文獻(xiàn)報道顯示，部分復(fù)方中藥多指標(biāo)含量同時測定研究中對鹽酸小檗堿和黃柏堿進(jìn)行了同時測定，但主要針對關(guān)黃柏，而非本文中柏參洗劑所用的川黃柏；同時，《中國藥典》2020年版黃柏【含量測定】項下規(guī)定指標(biāo)性成分為黃柏堿（關(guān)黃柏則為鹽酸小檗堿），基于醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑含量測定方法通常選擇盡可能與藥典相關(guān)規(guī)定一致或接近的原則，本研究最終僅測定黃柏堿。

色譜條件優(yōu)化方面，由于柏參洗劑所含藥味較多，如前段所述，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化，苦參堿與氧化苦參堿等成分難以實(shí)現(xiàn)基線分離，部分條件下還會影響黃柏堿的峰型、分離度。本文所用HPLC條件為藥典中黃柏堿測定的條件，在該條件下，黃柏堿的分離度和峰型較好，但其余化合物重疊、拖尾等情況較為普遍，綜合考慮整體分析效率及研究目標(biāo)（君藥中藥典規(guī)定指標(biāo)性成分的準(zhǔn)確測定），因此決定維持原有色譜條件不變。