液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鱸魚中磺胺二甲嘧啶的不確定度評(píng)定

竇明理 夏玉吉 黃 萍 王 明 陶 滔 王 毅*

1.四川省食品檢驗(yàn)研究院 四川成都 611731 2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(白酒監(jiān)管技術(shù)) 四川成都 611731

鱸魚以其鮮美的肉質(zhì)、豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值作為重要的經(jīng)濟(jì)魚類，近些年來(lái)得到廣泛養(yǎng)殖。在養(yǎng)殖過(guò)程中由于養(yǎng)殖密度大、投餌量大、排泄物較多、死亡魚體未及時(shí)清除以及其他諸多原因會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖群體患病，增加死亡率[1]?；前奉愃幬锸侵妇哂袑?duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，具有穩(wěn)定、抗菌譜廣、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)而廣泛使用，其能夠抑制大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌[2，3]。已有多種磺胺類衍生物作為抗菌藥物應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和集約化畜牧業(yè)[4，5]。其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌性豎鱗病、爛鰓病、鞭毛蟲(chóng)病等有良好的防治效果[6]。然而磺胺類藥物的大劑量使用和不遵守休藥期的規(guī)定會(huì)導(dǎo)致可食動(dòng)物組織中殘留的磺胺超標(biāo)[7]。磺胺類藥物不易代謝，很容易在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，進(jìn)而對(duì)人體健康造成危害[8]。其會(huì)對(duì)人體有泌尿系統(tǒng)及肝損害、胃腸道及消化系統(tǒng)不良癥、過(guò)敏癥狀、溶血性貧血、再生障礙性貧血等嚴(yán)重反應(yīng)[9，10]。GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥殘留最大限量》中明確指出了磺胺二甲嘧啶和磺胺類總量的殘留限量[11]。

測(cè)量不確定度是表征賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)，能夠表明對(duì)測(cè)量結(jié)果有效性信心的增加[12，13]。食品檢驗(yàn)工作是食品安全監(jiān)管，維護(hù)舌尖安全的有力保障，測(cè)量不確定度在食品檢驗(yàn)工作中的運(yùn)用十分廣泛。

本研究以磺胺類藥物中磺胺二甲嘧啶為代表，氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)鱸魚樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示指南》，建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)不確定度來(lái)源進(jìn)行評(píng)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，阿爾塔科技有限公司；

氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，阿爾塔科技有限公司；

甲醇，F(xiàn)isher chemical公司；

乙腈，F(xiàn)isher chemical公司；

甲酸，Sigma-Aldrich公司；

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

電子天平，美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；

高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取鱸魚樣品5g，置于50mL聚丙烯離心管中，加入600ng氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶內(nèi)標(biāo)，渦旋混合1min，避光放置10min，加入20mL含1%甲酸的乙腈，渦旋混勻，再加入10g無(wú)水硫酸鈉，超聲振蕩提取20min，8 000r/min離心5min，將上清液收集至50mL刻度離心管中，殘?jiān)尤?0mL含1%甲酸的乙腈；重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，加入10mL乙腈飽和正己烷，渦旋1min，靜置分層，棄去上層正己烷，乙腈層再用10mL乙腈飽和正己烷重復(fù)提取一次，棄去正己烷，乙腈層于40℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，殘?jiān)靡译孓D(zhuǎn)移至20mL容量瓶定容搖勻，過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件

液相色譜條件：色譜柱，Agilent ZORBAX Ecilipse Plus C18Rapid Resolution HD 3.0×150mm 1.8μm；流動(dòng)相:(A)0.2%甲酸水溶液，(B)0.2%甲酸乙腈；流速0.5mL/min；進(jìn)樣量2μL；柱溫40℃；洗脫梯度見(jiàn)表1。

表1 洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧(ESI+)；監(jiān)測(cè)模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓3 500V，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10L/min，鞘氣溫度320℃，鞘氣流速10L/min。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2所示。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.4 不確定度來(lái)源分析

建立鱸魚樣品中磺胺二甲嘧啶含量的數(shù)學(xué)模型，如公式(1)。

(1)

式中：X為試樣中磺胺二甲嘧啶的含量，單位為μg/kg；

C為試樣提取液中磺胺二甲嘧啶的濃度，單位為ng/mL；

V為試樣定容體積，單位為mL；

m為稱樣量，單位為g；

R為稀釋倍數(shù)。

根據(jù)數(shù)學(xué)模型(1)可知，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)鱸魚樣品中磺胺二甲嘧啶的測(cè)量不確定度引入途徑包括重復(fù)測(cè)量引入、回收率引入、校正曲線擬合引入、校正溶液配制引入、樣品稱量定容前處理操作引入、檢測(cè)儀器引入等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量計(jì)算

2.1.1 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度分量

稱取6份鱸魚試樣，進(jìn)行處理后測(cè)定分析，得到檢測(cè)結(jié)果分別為170.2、173.5、164.2、164.8、162.8、162.6μg/kg，平均含量為166μg/kg。

據(jù)根貝塞爾公式，測(cè)量重復(fù)性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式(2)計(jì)算。

(2)

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式(3)計(jì)算。

(3)

2.1.2 回收率引入的不確定度分量

稱取6份鱸魚空白試樣，進(jìn)行處理后測(cè)定分析，得到回收率分別為99.40%、101.13%、102.00%、94.70%、101.34%、90.79%，平均回收率為98.2%。

據(jù)根貝塞爾公式，回收率引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式(4)計(jì)算。

(4)

回收率引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式(5)計(jì)算。

(5)

2.1.3 校正曲線擬合引入的測(cè)量不確定度分量

校正曲線以磺胺二甲嘧啶與氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶的響應(yīng)比值為縱坐標(biāo)，磺胺二甲嘧啶與氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶的濃度比值為橫坐標(biāo)，校正溶液濃度及峰響應(yīng)見(jiàn)表3，擬合得線性回歸方程為：A=0.043552+0.028415C，r2=0.9985。

表3 校正溶液峰響應(yīng)

由校正曲線引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量按公式(6)、公式(7)計(jì)算。

(6)

(7)

公式(6)和(7)中：

a=0.043552；

b=0.028415；

P為試液測(cè)量次數(shù)，為6;

n為校正溶液測(cè)量次數(shù)，為7;

C0為樣品濃度平均值，為41.7654ng/mL。

代入數(shù)據(jù)，校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)差SR=0.08703，校正曲線標(biāo)準(zhǔn)引入不確定度為：u(3)=1.7164，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按公式(8)計(jì)算。

(8)

2.1.4 校正溶液配制引入的測(cè)量不確定度分量

根據(jù)磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，可知濃度為100.2μg/mL，擴(kuò)展不確定度±5%(k=2)，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的分量按公式(9)計(jì)算。

(9)

準(zhǔn)確吸取含磺胺二甲嘧啶100.2μg/mL和含氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL，分別用乙腈定容至10mL容量瓶中，得到濃度為1.002μg/mL的外標(biāo)儲(chǔ)備液和1μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。分別吸取上述外標(biāo)儲(chǔ)備液2、4、10、20、40、100、200μL，各加入上述內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液30μL，氮?dú)獯蹈珊缶芗尤?mL空白基質(zhì)溶液(空白基質(zhì)溶液按照樣品相同處理獲得)復(fù)溶，混勻即得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度為2.004、4.008、10.02、20.04、40.08、100.2、200.4ng/mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中，內(nèi)標(biāo)僅在最后加入30μL時(shí)會(huì)產(chǎn)生不確定度，儲(chǔ)備液配制過(guò)程的不確定度不需要考慮。操作時(shí)室溫控制為20±5℃，乙腈體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3，檢測(cè)過(guò)程中移液器使用、容量瓶定容時(shí)乙腈體積均會(huì)受到溫度影響，會(huì)導(dǎo)致體積變化，假定為均勻分布。而移液槍頭、玻璃器皿的膨脹系數(shù)很小，可忽略不計(jì)。

溫度變化引入的相對(duì)不確定按公式(10)計(jì)算。

(10)

移液器使用引入的相對(duì)不確定度見(jiàn)表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制移液器引入的不確定度

采用10mL容量瓶的容量允差為0.020mL，按均勻分布處理，則容量瓶引入相對(duì)不確定度按公式(11)計(jì)算。

(11)

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)不確定度按公式(12)計(jì)算。

(12)

2.1.5 樣品前處理引入的相對(duì)不確定度

樣品稱取過(guò)程用的電子天平檢定證書給出不確定度為1.0mg，k=2；稱樣量為5g，則其相對(duì)不確定度按公式(13)計(jì)算。

(13)

樣品加入600μL的1μg/mL內(nèi)標(biāo)后，進(jìn)行前處理，根據(jù)檢定證書，采用移液器不確定度為0.504μL，k=2，則移液器添加內(nèi)標(biāo)引入相對(duì)不確定度按公式(14)計(jì)算。

(14)

殘?jiān)靡译鎻?fù)溶后定容至20mL容量瓶，20mL容量瓶容量允差為0.03mL，按均勻分布處理，則其引入不確定度按公式(15)計(jì)算。

(15)

樣品前處理引入的相對(duì)不確定度按公式(16)計(jì)算。

(16)

2.1.6 檢測(cè)儀器引入的相對(duì)不確定度

檢測(cè)儀器為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，檢定證書給出的不確定度為U=5%，k=2，則其相對(duì)不確定度按公式(17)計(jì)算。

(17)

2.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)上述得到的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為按公式(18)計(jì)算。

urel=

(18)

u=urel×166=10.4 μg/kg

(19)

2.3 擴(kuò)展不確定度U

取置信概率p=95%，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度按公式(20)計(jì)算。

U=u×k=21 μg/kg

(20)

評(píng)定結(jié)果可表示為X=(166±21)μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

本研究建立了以氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶為內(nèi)標(biāo)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)鱸魚樣品中磺胺二甲嘧啶進(jìn)行檢測(cè)，并建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)其不確定度進(jìn)行評(píng)定，可以為其他磺胺類藥物的檢測(cè)與不確定度評(píng)定提供科學(xué)依據(jù)。

當(dāng)鱸魚樣品中磺胺二甲嘧啶含量為166μg/kg時(shí)，擴(kuò)展不確定度為21μg/kg，k=2。在測(cè)定磺胺二甲嘧啶時(shí)，不確定度來(lái)源主要有重復(fù)測(cè)量引入、回收率引入、校正曲線擬合引入、校正溶液的配制過(guò)程引入、前處理操作引入以及檢測(cè)儀器引入等。研究結(jié)果表明，校正曲線擬合、校正溶液配制和檢測(cè)儀器對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)最大，測(cè)量重復(fù)性、回收率和前處理過(guò)程對(duì)不確定度影響也不可忽視。因此，實(shí)驗(yàn)室為保證結(jié)果的可靠性，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格把控校正曲線擬合過(guò)程和標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程，并及時(shí)對(duì)所使用的檢測(cè)儀器進(jìn)行檢定校準(zhǔn)，必要時(shí)可以增加平行測(cè)定次數(shù)，采用規(guī)范的前處理操作過(guò)程都可以有效保證結(jié)果的可靠性。