槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間肌原纖維蛋白降解及品質(zhì)的影響

柴雨薇 向小梅 陳 琳 馮憲超

西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100

雞肉是我國(guó)主要食用肉類(lèi)之一，因其高蛋白、低脂肪和低膽固醇的特點(diǎn)，廣受消費(fèi)者喜愛(ài)，雞肉的消費(fèi)增長(zhǎng)趨勢(shì)也越來(lái)越明顯。自1995年以來(lái)，中國(guó)已成為第二大肉雞生產(chǎn)國(guó)，其肉雞產(chǎn)量超過(guò)歐盟[1]。因此改善雞肉品質(zhì)的研究引起人們關(guān)注。

嫩度、色澤和保水性是肉類(lèi)品質(zhì)的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。肉在宰后儲(chǔ)藏過(guò)程涉及許多生化和代謝反應(yīng)，可讓其產(chǎn)生特殊氣味和滋味，且變得柔軟多汁，進(jìn)而肌肉會(huì)轉(zhuǎn)化為可食用肉，該過(guò)程稱為“宰后成熟”[2,3]。宰后成熟過(guò)程涉及一系列復(fù)雜變化，鈣蛋白酶和細(xì)胞凋亡酶等內(nèi)源性酶單獨(dú)或協(xié)同作用，以降解肌原纖維蛋白，損傷肌細(xì)胞骨架，從而改善肉的嫩度[4～6]。

近年來(lái)，類(lèi)黃酮因其潛在的疾病預(yù)防和健康保護(hù)作用而受到廣泛關(guān)注。槲皮素是廣泛存在于蔬菜和水果中的天然類(lèi)黃酮，具有價(jià)格低、安全性高、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)。槲皮素已被發(fā)現(xiàn)具有抑制腫瘤、抗衰老、抗炎等多種生物活性，與其強(qiáng)大的抗氧化作用密切相關(guān)。槲皮素能清除活性氧自由基，降低氧化應(yīng)激引起的損傷，對(duì)機(jī)體氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)有積極意義[7]。此外，動(dòng)物體內(nèi)抗氧化能力也與肉品質(zhì)具有重要聯(lián)系，抗氧化能力越強(qiáng)，肉中的膽固醇和脂質(zhì)氧化反應(yīng)速率越慢，肉保水性越好，肉的色澤和嫩度得到提高[8]。研究表明在飼料中補(bǔ)充槲皮素能改善肉品質(zhì)量，減少肉雞[9]和肥育羔羊[10]中的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，降低脂質(zhì)氧化率，延長(zhǎng)肉質(zhì)保質(zhì)期。在育肥豬日糧中加入25mg/kg槲皮素可顯著提高宰后肉pH值和色度，降低滴水損失[11]。槲皮素還被應(yīng)用于肉制品加工中改善肉品質(zhì)。豬肉餅中添加槲皮素可顯著減少蛋白質(zhì)羰基化合物的形成，增強(qiáng)氧化穩(wěn)定性，改善肉餅顏色和品質(zhì)[12]。含量為1mg/mL槲皮素的可食用涂層，可降低油炸雞腿在冷藏儲(chǔ)存期間的pH值，提高L*值和氧化穩(wěn)定性[13]。此外，槲皮素處理宰后雞胸肉能誘導(dǎo)自噬和凋亡，破壞肌原纖維結(jié)構(gòu)，增加肉嫩度[14]。但槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間肌原纖維蛋白降解的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究將槲皮素用于宰后雞肉處理，探究其在成熟期間對(duì)肌鈣蛋白-T降解的影響，并用注射和浸漬兩種處理方式研究槲皮素對(duì)雞肉品質(zhì)的影響，為肉類(lèi)品質(zhì)的調(diào)控提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雄性三黃雞，楊凌農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；

槲皮素(95%)，美國(guó)阿拉丁公司；

食用性槲皮素(≥95%)，廈門(mén)中天生物科技有限責(zé)任公司；

羧甲基纖維素鈉(食品級(jí))，河南萬(wàn)邦化工科技有限公司；

肌鈣蛋白-T抗體(T6277)，美國(guó)Sigma公司；

μ-鈣蛋白酶抗體(#2556)、cleaved-caspase-3抗體(#9661)、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；

混合蛋白酶抑制劑，德國(guó)Roche公司；

BCA(bicinchoninic acid)蛋白檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Thermo Scientific公司；

聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜、ECL發(fā)光液，美國(guó)Millipore公司；

苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒、脂質(zhì)氧化(Malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

變頻電麻機(jī)(SQ805A)，江蘇吳江安能電子科技有限公司；

IKA均質(zhì)機(jī)(T-18)，德國(guó)IKA公司；

Bio-Rad電泳儀(12-0625)、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽(221BR)、XRS凝膠成像系統(tǒng)(JS680B)，美國(guó)伯樂(lè)公司；

自動(dòng)熒光顯微鏡(DM6 B)，德國(guó)Lecia公司；

Victor X3多功能酶標(biāo)儀M4，上海美谷分子儀器有限公司；

色度儀(Ci7600)，上海愛(ài)色麗色彩科技有限公司；

pH計(jì)(PHS-3C)，上海雷磁儀器廠；

質(zhì)構(gòu)分析儀(TA.XT.plus)，英國(guó)Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選用45日齡平均體重為2.0～2.5kg的雄性三黃雞8只，使用變頻電麻機(jī)將其擊暈5s后用刀割頸部血管放血屠宰，而后快速收集胸肌，去除明顯的脂肪和結(jié)締組織備用。

將宰后新鮮雞胸肉切成小塊(約0.2g/塊)，立即將約5g肉在液氮中快速冷凍，并作為0天樣品。其余樣品隨機(jī)分為兩組，按照1∶2(w/v)(肉重/試劑溶液體積)比例，分別浸泡于0.5%羧甲基纖維素鈉-0.9%氯化鈉溶液和100μg/mL槲皮素溶液(混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉[15]-0.9%氯化鈉溶液)中，置于4℃下成熟1d、3d和5d。每個(gè)儲(chǔ)存期結(jié)束后，將樣品在液氮中快速冷凍，以備后續(xù)蛋白提取及試劑盒等檢測(cè)。

將宰后新鮮雞胸肉均勻分割成約20g肉塊，樣品按如下方式分為三組：一組作為對(duì)照組不作處理；一組使用注射器以10∶1(w/v)(肉重/試劑溶液體積)的比例注射100μg/mL槲皮素(食用性)溶液；另一組以比例為1∶2(w/v)(肉重/試劑溶液體積)浸于100μg/mL槲皮素(食用性)溶液30min后瀝干10min。然后將所有樣品真空包裝在聚乙烯袋中，并置于4℃儲(chǔ)存1d、3d和5d，待每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出用于品質(zhì)測(cè)定。

1.3.2 蛋白提取

蛋白的提取參考Chen L[16](2015)等方法。肌漿蛋白的提取按以下步驟進(jìn)行。取1g肉樣加入3mL肌漿蛋白提取液(25mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，1mmol/L二硫蘇糖醇，5mmol/L NaF，1mmol/L PMSF，1% Triton X-100和混合蛋白酶抑制劑，pH值7.6)，在4℃下靜置20min后均質(zhì)3次，每次15 000r/min持續(xù)10s。然后在4℃，15 000g下離心30min，收集上清液，用BCA(bicinchoninic acid)蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后將樣品調(diào)至同一濃度。

肌原纖維蛋白的提取按以下步驟進(jìn)行。取1g肉樣中加入7.5mL緩沖液(100mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2·H2O，2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，1mmol/L NaN3，2mmol/L Na4P2O7·10H2O，10mmol/L馬來(lái)酸，pH值6.8)，在4℃下靜置20min后均質(zhì)三次，每次15 000r/min持續(xù)10s。然后在4℃，1 000g下離心10min。棄去上清液，在沉淀中加入7.5mL不含焦磷酸鹽的緩沖液，進(jìn)行均質(zhì)離心，重復(fù)3次。沉淀中加入7.5mL 15mmol/L Tris(pH值8.0)，進(jìn)行均質(zhì)離心，重復(fù)2次。最后將沉淀溶解在Tris中，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后將樣品調(diào)至同一濃度。

向肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中加入樣品處理液(10%β-巰基乙醇、20%甘油、0.001%溴酚藍(lán))，混勻后于99℃水浴中加熱5min。

1.3.3 免疫印跡分析

參考Wang T[14](2022)等方法，使用12.5%的下層分離膠和4%的上層濃縮膠，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后在10V電壓下進(jìn)行轉(zhuǎn)印。用1% TBST緩沖液(10mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，0.05%吐溫20，pH值7.5)配置含5%脫脂奶粉的封閉液，將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜置于封閉液中并于室溫環(huán)境下在搖床上封閉3h。膜封閉后用TBST緩沖液清洗5次，每次8min，之后用濾紙輕吸后放入配置好的相應(yīng)蛋白一抗中，置于4℃冰箱孵育過(guò)夜。將一抗孵育后的PVDF膜用TBST溶液清洗，用濾紙吸干后，置于相應(yīng)二抗中，室溫下在搖床上孵育2h。二抗孵育結(jié)束后，用TBST清洗膜，濾紙吸干后，取適量ECL發(fā)光液均勻滴加于膜上，采用Chemi Dox凝膠成像系統(tǒng)以及Quantity One軟件，對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行圖像采集和灰度分析。

1.3.4 免疫組化

參考Acar V[17](2021)等方法。將肉樣切成1cm×1cm×1cm肉塊，置于4%多聚甲醛中固定24h。經(jīng)脫水、透明和包埋后，將樣品連續(xù)切為4μm大小的切片。將組織切片置于充滿檸檬酸(pH值6.0)抗原修復(fù)溶液的壓力鍋中進(jìn)行抗原修復(fù)。將石蠟切片放入60℃烘箱60min，經(jīng)過(guò)脫蠟水化，抗原修復(fù)后用PBS洗滌2次，每次5min，滴加山羊血清37℃封閉15min，滴加一抗(cleaved-caspase-3)并于37℃孵育2h，然后用PBS洗滌2次，每次5min，接著添加二抗，然后進(jìn)行DAB顯色，用純凈水沖洗后用蘇木精復(fù)染，純凈水沖洗15min后，進(jìn)行梯度酒精脫水(80%：2min；95%：2min；100%：5min)，然后用二甲苯透明，透明后用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。通過(guò)熒光顯微鏡采集免疫熒光圖像進(jìn)行分析。

1.3.5 活性氧(Reactive oxygen species，ROS)含量檢測(cè)

參考黃琳琳[18](2022)等方法并稍作修改。取500mg肉樣與3mL裂解緩沖液(10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L蔗糖，0.1mmol/L EDTA·2Na，0.8% NaCl，pH值7.47)均質(zhì)1min，將勻漿物在3 000g下離心15min，離心后取上清測(cè)蛋白濃度。取100μL上清與100μL檢測(cè)緩沖液(裂解緩沖液+10μM底物DCFH-DA)混合，37℃孵育30min，在激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm處測(cè)定熒光值。結(jié)果表示為熒光強(qiáng)度(g蛋白)。

1.3.6 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)

將10mg組織樣品與100μL SOD樣品制備液混合，4℃下勻漿后，12 000g離心5min，取上清待測(cè)。參考試劑盒的具體要求配制所需的工作液。將樣品與工作液混合后，孵育30min，利用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度值。結(jié)果表示為酶活力(U/mg蛋白)。

1.3.7 丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量檢測(cè)

按照1.3.2肌漿蛋白提取方法進(jìn)行。測(cè)定樣品蛋白濃度后，進(jìn)行MDA測(cè)定。按照說(shuō)明書(shū)配制工作液后，稀釋標(biāo)品至1、5、10、50、100、200μmol/L并測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中加入工作液，在100℃水浴加熱15min后離心。取上清測(cè)定532nm波長(zhǎng)吸光度值。結(jié)果表示為MDA含量(nmol/mg蛋白)。

1.3.8 pH值的測(cè)定

參考GB 5009.237-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》[19]中的方法。取1g肉樣，置于10mL 0.1mol/L氯化鉀溶液中，均質(zhì)3次，用pH計(jì)測(cè)定肉液pH值，測(cè)3次取平均值。

1.3.9 剪切力的測(cè)定

參考Chen L[20](2021)等方法。取不同宰后成熟時(shí)間的樣品放入真空包裝袋中，并在75℃水浴中加熱，直到樣品內(nèi)部中心溫度達(dá)到70℃。將煮后的肉塊冷卻后，按照平行于肌纖維的方向切成長(zhǎng)條(0.5cm×0.5cm×4cm)。使用質(zhì)構(gòu)分析儀(測(cè)試速度2mm/s，位移25mm，觸發(fā)力10.0g，探頭Warner-Bratzler)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果用剪切力(N)表示。

1.3.10 色度的測(cè)定

參考李鳴[21](2018)等方法。將色度儀校正后分別測(cè)定不同宰后成熟時(shí)間的雞胸肉的L*、a*、b*值，每個(gè)樣品取三個(gè)不同位置測(cè)定并取平均值。

1.3.11 蒸煮損失率的測(cè)定

參考魏心如[22](2014)的方法。將處理后的樣品，稱重記錄(m1)后，放入自封袋中，置于75℃水浴中加熱，待肉樣的中心溫度達(dá)到70℃吋取出冷卻到室溫，濾紙吸干水分后再次稱量記錄(m2)。蒸煮損失率用公式(1)表示如下：

(1)

式中：

m1是蒸煮前的重量(g)；

m2是蒸煮后的重量(g)。

1.3.12 感官品質(zhì)的測(cè)定

將雞胸肉切成厚度1cm左右的雞肉塊，剪切整形后備用?？諝庹ㄥ?00℃烤制15min后放置于白色盤(pán)子中供感官評(píng)價(jià)。參照GB/T 22210-2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》[23]，由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)、具有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的12名專業(yè)人員(6男、6女)對(duì)產(chǎn)品的色澤、滋味和組織狀態(tài)進(jìn)行打分。感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory Evaluation Criteria

1.3.13 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)至少3次，表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan檢驗(yàn)比較各組均值之間的差異。p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間肌原纖維蛋白降解的影響

2.1.1 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間肌鈣蛋白-T(troponin-T)降解的影響

troponin-T是一種重要的肌原纖維蛋白，在成熟期間troponin-T可以降解產(chǎn)生28-30 kDa的片段，28-30 kDa降解片段的出現(xiàn)和troponin-T原片段的減少可作為剪切力降低和嫩度改善的標(biāo)志[24]。Tasoniero G[25](2022)等在雞胸肉宰后成熟期間觀察到troponin-T的降解。以降解片段與原片段表達(dá)的比值表示troponin-T的降解，如圖1所示，槲皮素處理組降解片段表達(dá)量和降解片段與原片段的比值在宰后成熟期間均高于對(duì)照組，且在宰后第3天和第5天差異極顯著(p<0.01)。表明槲皮素可以促進(jìn)雞肉宰后成熟期間troponin-T的降解。troponin-T是肌原纖維中細(xì)肌絲的組成成分，而I帶是由細(xì)肌絲形成的。且在槲皮素處理的宰后雞肉的超微結(jié)構(gòu)中觀察到I帶嚴(yán)重?fù)p傷[14]。進(jìn)一步說(shuō)明槲皮素降解troponin-T對(duì)肌原纖維結(jié)構(gòu)造成破壞，從而促進(jìn)嫩度的增加。

圖1 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間肌鈣蛋白-T降解的影響Fig. 1 Effect of quercetin on troponin-T degradation of chicken during post-mortem ageing注：A、B分別為肌鈣蛋白-T的條帶和相對(duì)光密度值；“**”代表差異極顯著(p<0.01)，“ns”代表差異不顯著(p>0.05)。

2.1.2 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間μ-鈣蛋白酶(μ-calpain)的影響

傳統(tǒng)的肉品成熟理論一直認(rèn)為μ-calpain是宰后肉成熟過(guò)程中最重要的內(nèi)源酶，有利于肌肉向食用肉的轉(zhuǎn)化。μ-calpain是一種異二聚體，由28和80kDa亞基組成，是一種鈣依賴性蛋白酶。肌肉宰后μ-calpain發(fā)生自溶，從80kDa降解為75kDa，激活μ-calpain的活性。如圖2所示，在雞肉宰后成熟過(guò)程中，槲皮素處理組μ-calpain的80kDa亞基自溶，出現(xiàn)75kDa條帶且75kDa/80kDa的相對(duì)密度顯著高于對(duì)照組(p<0.01)。μ-calpain的激活與肉保水性及嫩度正相關(guān)[26]，且被認(rèn)為是肌原纖維蛋白水解過(guò)程中最大的貢獻(xiàn)者[27]。Huang J C[28](2016)等發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)μ-calpain活性促進(jìn)了troponin-T降解。而用鈣蛋白酶抑制劑處理宰后雞肉導(dǎo)致μ-calpain活性降低并抑制troponin-T的降解[29]。這些結(jié)果表明在雞肉宰后成熟期間槲皮素促進(jìn)μ-calpain的激活，從而加速troponin-T的降解，進(jìn)一步改善肉的嫩度。

圖2 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間μ-鈣蛋白酶的影響Fig. 2 Effects of quercetin on μ-calpain of chicken during post-mortem ageing注：A、B分別為μ-鈣蛋白酶的條帶和相對(duì)光密度值；“**”代表差異極顯著(p<0.01)。

2.1.3 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間細(xì)胞凋亡酶-3(caspase-3)活性的影響

細(xì)胞凋亡是一種自然發(fā)生的細(xì)胞死亡過(guò)程，存在于肉的宰后成熟過(guò)程中。Caspase-3是凋亡介導(dǎo)因子之一，以無(wú)活性的前體酶原存在于細(xì)胞中，被切割后生成活性caspase-3(cleaved-caspase-3)而活化，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[30]。有研究指出超聲使宰后雞肉caspase-3活性升高，促進(jìn)凋亡，從而降低剪切力，增加嫩度[20]。本研究利用免疫組化對(duì)雞肉組織中的cleaved-caspase-3進(jìn)行標(biāo)記，cleaved-caspase-3的陽(yáng)性反應(yīng)物部位呈棕黃色或棕褐色。結(jié)果如圖3所示，隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和槲皮素處理組雞肉組織中cleaved-caspase-3陽(yáng)性表達(dá)物逐漸增加，并在第5天最為明顯，而且槲皮素處理組cleaved-caspase-3陽(yáng)性表達(dá)物蓄積和肌纖維結(jié)構(gòu)破損程度在宰后成熟期間均高于對(duì)照組。結(jié)果表明槲皮素在宰后成熟期間可以激活caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chen L[31](2012)等發(fā)現(xiàn)caspase-3抑制劑處理宰后雞胸肉導(dǎo)致μ-calpain活性和表達(dá)降低。且超聲激活宰后雞肉caspase-3，間接上調(diào)μ-calpain活性，增強(qiáng)了troponin-T 30kDa降解產(chǎn)物的積累[16]。這些結(jié)果表明在雞肉宰后成熟期間槲皮素增加caspase-3活性并觸發(fā)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)μ-calpain的激活，進(jìn)一步降解troponin-T，破壞肌原纖維結(jié)構(gòu)，從而增加肉的嫩度。

圖3 宰后雞肉組織cleaved-caspase-3免疫組化Fig. 3 Immunohistochemistry of cleaved-caspase-3 in chicken tissues during post-mortem ageing注：G～C.為對(duì)照組；D～F.為槲皮素處理組。標(biāo)尺：100μm。

2.1.4 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間氧化應(yīng)激的影響

宰后動(dòng)物骨骼肌細(xì)胞處于缺氧缺血狀態(tài)，機(jī)體有氧代謝受阻，促進(jìn)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。槲皮素作為一種天然抗氧化劑，具有對(duì)抗ROS的作用。如圖4所示，對(duì)照組中ROS的含量處于較高水平，而槲皮素處理可極顯著降低宰后成熟期間雞肉中的ROS含量(p<0.01)。此外ROS可通過(guò)蛋白氧化影響肉嫩度[32]。研究發(fā)現(xiàn)ROS可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，改變蛋白結(jié)構(gòu)和活性，降低水解酶活力，從而對(duì)嫩度產(chǎn)生不利影響[33]。Morzel M[34](2006)等提出肌原纖維蛋白的氧化減弱蛋白質(zhì)降解敏感性。因此槲皮素可能是通過(guò)降低ROS，減弱肌原纖維蛋白的氧化，進(jìn)一步促進(jìn)肌原纖維蛋白降解，改善嫩度。

圖4 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間ROS含量影響Fig. 4 Effects of quercetin on ROS content of chicken during post-mortem ageing注：“**”代表差異極顯著(p<0.01)。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物體系中抗氧化酶系的重要組成部分，能夠清除自由基，保護(hù)機(jī)體[35]。如圖5所示，在宰后成熟第1天和第3天，槲皮素可顯著增加雞肉中的SOD含量(p<0.05)。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)作為脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物是機(jī)體氧化應(yīng)激的典型標(biāo)志物[36]。

圖5 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間SOD活力影響Fig. 5 Effects of quercetin on SOD activity of chicken during post-mortem ageing注：“**”代表差異極顯著(p<0.01)；“*”代表差異顯著(p<0.05)；“ns”代表差異不顯著(p>0.05)。

如圖6所示，對(duì)照組中MDA含量較高，表明過(guò)氧化程度較強(qiáng)，細(xì)胞受到損傷，而槲皮素處理能顯著降低MDA水平(p<0.01)。Giteru S G[37](2017)等用含槲皮素的薄膜儲(chǔ)存鮮雞肉能顯著降低MDA含量，抑制脂質(zhì)氧化，提高肉品質(zhì)。Zhang S[38](2020)等在肉雞日糧中添加槲皮素能降低MDA水平，提高SOD活性，增強(qiáng)肉類(lèi)穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明槲皮素能減弱宰后成熟期間的氧化應(yīng)激，恢復(fù)雞肉組織中的氧化還原平衡，進(jìn)一步改善蛋白質(zhì)降解減弱和脂質(zhì)氧化，有利于雞肉品質(zhì)的提高。

圖6 槲皮素對(duì)雞肉宰后成熟期間MDA含量影響Fig. 6 Effects of quercetin on MDA content of chicken during post-mortem ageing注：“**”代表差異極顯著(p<0.01)。

2.2 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉宰后成熟期間食用品質(zhì)的影響

2.2.1 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉宰后成熟期間pH值的影響

當(dāng)肉品pH值<6.7時(shí)，雞肉的新鮮程度比較高，這是因?yàn)槿馄吩谒嵝詶l件下，致腐性微生物生長(zhǎng)繁殖速度和雞肉中的蛋白成分分解速度都受到一定程度抑制。但是當(dāng)肉品pH值>6.7時(shí)，微生物的生長(zhǎng)繁殖和蛋白質(zhì)的分解速度加快，揮發(fā)性NH3及胺類(lèi)物質(zhì)含量增加，從而降低雞肉的新鮮度和食用價(jià)值[39]。如圖7所示，在雞肉宰后成熟期間對(duì)照組和槲皮素處理組的pH值有所波動(dòng)，但始終處于5.6～6.0范圍內(nèi)，表明槲皮素注射和浸漬處理對(duì)宰后成熟期間的雞肉的pH值不會(huì)產(chǎn)生不利影響。與本研究結(jié)果一致，用含有槲皮素的可食用涂層處理的鮮雞肉在冷藏過(guò)程中pH值無(wú)顯著變化，但在儲(chǔ)藏第4天pH值超過(guò)6.7[40],可能與槲皮素濃度及處理方式不同有關(guān)。

圖7 槲皮素不同處理方式對(duì)宰后雞肉成熟期間pH值的影響Fig. 7 Effects of different treatments of quercetin on pH of chicken during post-mortem ageing

2.2.2 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉宰后成熟期間剪切力的影響

剪切力是衡量肉嫩度的重要指標(biāo)，剪切力越小代表肉嫩度越高[41]。如圖8所示，對(duì)照組中0天樣品的剪切力最大，為116.29N，且隨宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減小。在宰后不同時(shí)間槲皮素注射和浸漬處理組的剪切力均低于對(duì)照組，且差異極顯著(p<0.01)。先前的研究表明，在槲皮素注射處理的宰后雞肉中肌原纖維間隙變大，結(jié)構(gòu)被破壞，剪切力顯著降低[14]。在肉雞日糧中補(bǔ)充槲皮素也能降低剪切力，提高肉嫩[42]。表明槲皮素兩種處理方式均可促進(jìn)雞肉宰后成熟中的嫩化，改善雞肉嫩度。

圖8 槲皮素不同處理方式對(duì)宰后雞肉成熟期間剪切力的影響Fig. 8 Effects of different treatments of quercetin on shear force of chicken during post-mortem ageing注：顯著性分析為同一天的對(duì)照組、槲皮素注射組和槲皮素浸漬組之間的差異；“**”代表差異極顯著(p<0.01)。

2.2.3 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉宰后成熟期間色度的影響

肉色的變化主要與肌紅蛋白與氧氣結(jié)合形態(tài)有關(guān)，分為脫氧肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白，不同的結(jié)合狀態(tài)使肌肉分別呈現(xiàn)出紫紅色、鮮紅色或褐色[43]。L*值反映肉的亮度，如表2所示，槲皮素注射處理和浸漬處理與對(duì)照組相比均能提高宰后成熟期間的L*值，且槲皮素注射處理組在宰后1、3、5d與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)，槲皮素浸漬處理組在宰后第3天顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。結(jié)果表明兩種槲皮素處理方式均能提高宰后成熟期間雞肉的L*值，提高雞肉的亮度。

表2 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉L*值影響Table 2 Effects of quercetin treatments on L* value of chicken

a*值反映了肉的紅度，如表3所示，隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組雞肉的a*值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并在宰后第5天達(dá)到最低值。在宰后第1、3、5天，槲皮素注射和浸漬處理組與對(duì)照組相比，均可顯著提高雞肉的a*值(p<0.05)。結(jié)果表明槲皮素兩種處理均能改善宰后雞肉的紅度，這可能與槲皮素的抗氧化作用有關(guān)，能抑制高鐵肌紅蛋白生成。

表3 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉a*值影響Table 3 Effects of quercetin treatments on a* value of chicken

b*值則反映了肉的黃度，如表4所示，隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，雞肉的b*值呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，并在宰后第5天達(dá)到最高值，這是因?yàn)樵缀蟪墒炱陂g雞肉與氧氣充分接觸，導(dǎo)致脂質(zhì)被氧化，氧合肌紅蛋白不穩(wěn)定也被氧化成褐色的高鐵肌紅蛋白。在宰后成熟期間，槲皮素注射和浸漬處理組的b*值均低于對(duì)照組，且槲皮素注射組在宰后成熟第1天差異極顯著(p<0.01)，槲皮素浸漬處理組在宰后成熟第1、3天差異極顯著(p<0.01)。與我們結(jié)果一致，Sohaib M[44](2017)等發(fā)現(xiàn)添加槲皮素的雞肉餅a*值升高，b*值降低，脂肪和蛋白氧化被抑制。李賢[42](2021)等發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充槲皮素能提高肉雞L*、a*值，降低b*值。且槲皮素能還原高鐵肌紅蛋白產(chǎn)生亮紅色氧合肌紅蛋白[45]。這些結(jié)果表明槲皮素兩種處理均能改善雞肉宰后成熟期間的色度，歸因于槲皮素的抗氧化特點(diǎn)使其延緩了雞肉宰后成熟期間的脂質(zhì)氧化和高鐵肌紅蛋白積累。

表4 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉b*值影響Table 4 Effects of quercetin treatment on b* value of chicken

2.2.4 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉宰后成熟期間保水性的影響

蒸煮損失率越高，肉的系水能力越差，保水性越差，食用品質(zhì)越差[46]。如圖9所示，對(duì)照組雞肉樣品的蒸煮損失率在宰后成熟期間呈現(xiàn)較高水平，而槲皮素注射和浸漬處理均顯著降低雞肉的蒸煮損失率(p<0.05)。與Zhou Z Q[47](2021)等研究結(jié)果一致，槲皮素能降低腌制肉的蒸煮損失，增加含水量。且日糧中補(bǔ)充1g/kg槲皮素能降低蒸煮損失改善雞肉的品質(zhì)性狀[48]。此外，保水性與肌原纖維蛋白的降解有關(guān)，肌原纖維蛋白發(fā)生降解導(dǎo)致肌肉結(jié)構(gòu)崩塌，使水分子流失通道遭到破壞，形成“海綿效應(yīng)”，阻斷水分流失，從而提高保水性[49]。因此槲皮素可能是通過(guò)促進(jìn)肌原纖維蛋白的降解以改善宰后成熟期間雞肉的保水性。

圖9 槲皮素不同處理方式對(duì)宰后雞肉成熟期間蒸煮損失的影響Fig. 9 Effects of different treatments of quercetin on cooking loss of chicken during post-mortem ageing注：顯著性分析為同一天的對(duì)照組、槲皮素注射組和槲皮素浸漬組之間的差異；“**”代表差異極顯著(p<0.01)，“*”代表差異顯著(p<0.05)。

2.2.5 槲皮素不同處理方式對(duì)雞肉宰后成熟期間感官品質(zhì)的影響

本研究從色澤、滋味氣味和組織狀態(tài)三個(gè)方面對(duì)槲皮素不同處理方式的雞肉樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如表5所示。在宰后第1天和第2天，槲皮素兩種處理組的色澤和滋味氣味評(píng)分與對(duì)照組無(wú)顯著差異，在第3天兩種處理組的色澤和滋味氣味評(píng)分均高于對(duì)照組，且色澤評(píng)分差異顯著(p<0.05)。槲皮素注射和浸漬處理均可提高雞肉的組織狀態(tài)評(píng)分，并在宰后第3天達(dá)到顯著性差異(p<0.01)。

表5 槲皮素不同處理方式對(duì)烤制雞肉感官品質(zhì)的影響Table 5 Effects of different treatments ofquercetin on sensory qualities of fried chicken

綜上所述，槲皮素兩種處理方式均可改善烤制雞肉色澤和滋味氣味，并能夠提升雞肉組織狀態(tài)，從而改善整體的感官特性。李美瑩[50](2022)等在調(diào)理雞排中添加0.002%槲皮素可抑制雜環(huán)胺生成，提高食用安全性，且添加槲皮素的雞排香味獨(dú)特，色澤金黃，鮮嫩多汁。進(jìn)一步證實(shí)槲皮素在提升宰后雞肉感官品質(zhì)中的作用。

3 結(jié)論

本研究采用槲皮素處理雞肉探究其對(duì)宰后成熟期間肌原纖維蛋白降解及品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，槲皮素處理能夠提高μ-calpain和caspase-3的活性，降低雞肉中ROS和MDA含量，增加SOD活力，促進(jìn)troponin-T的降解。并且槲皮素注射和浸漬兩種處理方式均能穩(wěn)定雞肉在宰后成熟過(guò)程中的pH值，降低剪切力，改善肉的嫩度，提高L*、a*值，降低b*值從而改善雞肉色度，降低蒸煮損失增強(qiáng)保水性，改善烤制雞肉色澤和滋味氣味，提升雞肉組織狀態(tài)。因此，槲皮素能激活雞肉宰后成熟期間的內(nèi)源性酶，緩解氧化應(yīng)激，恢復(fù)雞肉組織中的氧化還原平衡，從而促進(jìn)肌原纖維蛋白的降解，并且槲皮素能有效提升雞肉的食用品質(zhì)。