試論發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

梁欣竹，謝 杰

（南充市南部生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站,四川 南充 637300）

在社會(huì)經(jīng)濟(jì)和工業(yè)事業(yè)不斷發(fā)展的背景下，水污染、大氣污染等問題持續(xù)涌現(xiàn)出來，對(duì)自然生態(tài)環(huán)境造成極大的影響，并且不利于人與自然和諧發(fā)展，環(huán)境污染監(jiān)測(cè)工作也引發(fā)社會(huì)各界廣泛關(guān)注。以往開展環(huán)境污染監(jiān)測(cè)工作，多數(shù)情況下會(huì)對(duì)理化分析和生物監(jiān)測(cè)技術(shù)方法加以運(yùn)用，前者在廢水指標(biāo)監(jiān)測(cè)中應(yīng)用，雖然能夠得到準(zhǔn)確的常規(guī)指標(biāo)數(shù)據(jù)，但是無法反映水質(zhì)綜合毒性的大小，后者運(yùn)用主要以魚類、藻類為受試對(duì)象，盡管可以科學(xué)判斷毒物對(duì)生物造成的直接影響，但是具體操作十分繁瑣，并且需要投入大量的時(shí)間精力，將發(fā)光細(xì)菌法運(yùn)用到其中以后，這些問題就能夠迎刃而解，并且實(shí)際操作較為簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果也能一目了然[1]。本文聯(lián)系發(fā)光細(xì)菌基本概述，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的分類、發(fā)光原理和測(cè)定方法進(jìn)行細(xì)致分析，并嘗試從工業(yè)廢水毒性測(cè)定、特定水域毒性測(cè)定、有機(jī)化合物毒性測(cè)定、農(nóng)藥殘留測(cè)定等方面入手，詳盡探討發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的實(shí)踐應(yīng)用，同時(shí)對(duì)發(fā)光細(xì)菌未來應(yīng)用發(fā)展進(jìn)行展望，使之在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

1 發(fā)光細(xì)菌基本情況分析

1.1 發(fā)光細(xì)菌的分類

發(fā)光細(xì)菌作為可以在正常生理?xiàng)l件下，發(fā)射可見熒光的一類細(xì)菌，其熒光波長(zhǎng)可以達(dá)到490 nm，在黑暗環(huán)境下能夠清晰地看見。目前發(fā)光細(xì)菌種類主要有：（1）異短桿菌屬，比如發(fā)光異短桿菌；（2）發(fā)光桿菌屬，主要有明亮發(fā)光桿菌和鰒發(fā)光桿菌；（3）希瓦氏菌屬，比如羽田希瓦氏菌；（4）弧菌屬，包含哈維式弧菌、美麗弧菌生物型Ⅰ、地中?；【?，另外中國(guó)學(xué)者分離到一株淡水發(fā)光細(xì)菌被命名為青?；【⑶遗c異短桿菌都屬于淡水發(fā)光細(xì)菌范疇，由于異短桿菌具有致病性，因此青?；【蔀槲ㄒ坏囊环N非致病淡水型發(fā)光細(xì)菌，同時(shí)也是難得的水質(zhì)監(jiān)測(cè)好材料[2]。

1.2 青?；【奶匦?/h3>

青?；【俏覈?guó)學(xué)者從青海湖的裸鯉體表分離得到的一種發(fā)光細(xì)菌，并且經(jīng)過表型特性測(cè)定、發(fā)光光譜測(cè)定、弧菌抑制試驗(yàn)等以后，確定該發(fā)光菌為一新種，根據(jù)采集地點(diǎn)將其命名為青?；【?。作為一種非致病的淡水型發(fā)光細(xì)菌，它能夠持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)射藍(lán)綠光，最大發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm，在遇到有毒有害物質(zhì)以后，會(huì)很快被抑制發(fā)光，并且發(fā)光抑制程度與所受有毒有害物質(zhì)的毒性及濃度存在一定對(duì)應(yīng)關(guān)系，再加上青?；【€有一般海洋發(fā)光細(xì)菌的可應(yīng)用特性，因此被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、水質(zhì)土壤沉積物毒性測(cè)定的工作中，并能夠取得較好應(yīng)用效果。

1.3 發(fā)光原理分析

生物發(fā)光是一種酶催化的化學(xué)反應(yīng)，并且與其他的熒光和磷光有顯著的區(qū)別，它的發(fā)光不依賴于原始光子的吸收。由于細(xì)菌發(fā)光最為主要的兩種物質(zhì)是黃素單核苷酸和長(zhǎng)鏈脂肪醛，細(xì)菌熒光酶不僅可以催化還原型的黃素單核苷酸和長(zhǎng)鏈脂肪醛，還能在氧氣參與情況下發(fā)生氧化反應(yīng)并釋放出光子，由于在一定條件下發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度是恒定不變的，當(dāng)其與無機(jī)、有機(jī)毒物等受試物相接觸以后，細(xì)菌的新陳代謝就會(huì)受到影響，并且有毒物濃度的大小與發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度變化呈現(xiàn)出一定比例關(guān)系，可以使用相關(guān)儀器監(jiān)測(cè)出來，最終得到受試物毒性的大小[3]。

1.4 測(cè)定方法

常見的發(fā)光細(xì)菌測(cè)定方法有：（1）新鮮發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)測(cè)定法，將發(fā)光細(xì)菌接種到液體發(fā)光培養(yǎng)基中，并做好溫度控制工作，促進(jìn)其進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后配置含有3%氯化鈉鹽度的菌懸液，促使其與菌種進(jìn)行充分接觸，時(shí)間要控制在15 min以內(nèi)，當(dāng)達(dá)到發(fā)生作用設(shè)定時(shí)間以后，就可以對(duì)對(duì)照管和樣品管的發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行觀察、讀取和記錄，這一方法運(yùn)用較為簡(jiǎn)便，并且能夠保證最終檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量；（2）發(fā)光細(xì)菌和藻類混合測(cè)定法，考慮到一些有毒有害物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌不能產(chǎn)生直接的毒害作用，不過這些有毒有害物質(zhì)能夠?qū)υ孱惍a(chǎn)生毒害作用，這時(shí)候開展毒性測(cè)定工作，就可以充分利用有毒有害物質(zhì)的這一特性，將培養(yǎng)好的發(fā)光菌懸液和藻類懸液混合以后，一起加入測(cè)試管中，使之與試液充分混合，在經(jīng)過一段時(shí)間的光照以后，再對(duì)發(fā)光菌的光強(qiáng)度變化進(jìn)行有效測(cè)定，同時(shí)由于有毒有害物質(zhì)對(duì)藻類產(chǎn)生的毒害作用，會(huì)對(duì)藻類的光合作用產(chǎn)生一定干擾，使之放氧能力不斷降低，這時(shí)候發(fā)光細(xì)菌也會(huì)因?yàn)槿毖醵霈F(xiàn)發(fā)光能力下降情況，這時(shí)候也就能夠根據(jù)光合作用放氧多少導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度出現(xiàn)變化，對(duì)有毒物質(zhì)的毒性大小進(jìn)行合理推算；（3）發(fā)光細(xì)菌冷凍干燥制劑測(cè)定法，將培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的發(fā)光細(xì)菌，運(yùn)用特殊方法制作成為干燥粉劑，并在冰箱中制成凍干粉劑，在使用時(shí)就可以加入2%的氯化鈉溶液使其復(fù)蘇，然后運(yùn)用到有毒物質(zhì)毒性測(cè)定當(dāng)中，這種方法運(yùn)用最為主要的特點(diǎn)就是每次使用發(fā)光細(xì)菌都具有相同的生理狀態(tài)，并且靈敏性一致、操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)勢(shì)較為明顯[4]。

2 發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

2.1 工業(yè)廢水毒性測(cè)定

隨著工業(yè)事業(yè)不斷發(fā)展，各類工業(yè)企業(yè)開展生產(chǎn)活動(dòng)所產(chǎn)生的廢水，也是造成水體污染的重要因素之一，并且在受納水體污染物達(dá)到一定濃度以后，就會(huì)引發(fā)生物中毒反應(yīng)，并出現(xiàn)生理功能紊亂、組織細(xì)胞病變、行為發(fā)生異常等狀況，這時(shí)候運(yùn)用發(fā)光細(xì)菌可以對(duì)廢水的綜合毒性進(jìn)行有效測(cè)定。實(shí)際操作中，可以采用發(fā)光細(xì)菌方法和魚類、蚤類測(cè)定方法，得到工業(yè)廢水急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果，并提出有毒/無毒、百分?jǐn)?shù)等級(jí)和對(duì)數(shù)等級(jí)三個(gè)毒性比較方法標(biāo)準(zhǔn)，其中百分?jǐn)?shù)等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)在國(guó)內(nèi)運(yùn)用更多，詳見表1，相關(guān)人員采用百分?jǐn)?shù)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)造紙工業(yè)產(chǎn)生的廢水毒性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)制漿廢水對(duì)發(fā)光細(xì)菌存在較強(qiáng)的抑制作用，測(cè)定毒性等級(jí)為Ⅱ級(jí)，側(cè)面也提示造紙工業(yè)廢水毒性監(jiān)測(cè)，使用發(fā)光細(xì)菌方法切實(shí)可行，甚至還可以對(duì)其實(shí)施連續(xù)性的監(jiān)測(cè)。與此同時(shí)，運(yùn)用發(fā)光細(xì)菌對(duì)合成燃料過程排出的廢水生物毒性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，也能取得較好的效果。由于從煤、焦油砂沉積物等中，對(duì)燃料進(jìn)行回收的過程會(huì)產(chǎn)生大量的生物毒性廢水，并且這類廢水中含有多種有機(jī)、無機(jī)污染物，對(duì)每種有毒化合物進(jìn)行單獨(dú)分析不夠現(xiàn)實(shí)，并且受到污染物之間加和和拮抗作用影響，導(dǎo)致各污染物毒性之和并不能夠代表這類廢水的綜合毒性，這時(shí)候采用發(fā)光細(xì)菌對(duì)綜合毒性進(jìn)行測(cè)定就顯得更為優(yōu)越，執(zhí)行時(shí)還可以將發(fā)光細(xì)菌與化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合起來，可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)廢水毒性有效測(cè)定與分析，并為工業(yè)廢水毒性物質(zhì)的快速鑒別和有效去除奠定良好基礎(chǔ)[5]。

表1 發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)百分?jǐn)?shù)法等級(jí)劃分

2.2 特定水域毒性測(cè)定

當(dāng)水體環(huán)境遭受嚴(yán)重污染以后，勢(shì)必也會(huì)對(duì)水域生態(tài)平衡造成極大的影響，而水體環(huán)境遭受污染以后，水體存在污染物種類也十分復(fù)雜，并且運(yùn)用單一理化指標(biāo)對(duì)這些污染物的濃度進(jìn)行檢測(cè)表示難度較大，但是在對(duì)這些污染物進(jìn)行生物毒性試驗(yàn)之后，就可以得到水體污染負(fù)荷與生物學(xué)效應(yīng)之間呈現(xiàn)的具體關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)水體污染現(xiàn)狀及污染物毒性的綜合評(píng)價(jià)。具體操作中，可以采用發(fā)光細(xì)菌，對(duì)特定水域漁業(yè)污染物的毒性進(jìn)行監(jiān)測(cè)和測(cè)定，實(shí)際執(zhí)行要對(duì)溫度、pH值進(jìn)行嚴(yán)格控制，避免因?yàn)檫@些因素對(duì)最終試驗(yàn)結(jié)果帶來不利影響。最終試驗(yàn)表明，在溫度和pH值適宜條件下，運(yùn)用發(fā)光細(xì)菌開展急性毒性監(jiān)測(cè)工作，可以明確漁業(yè)事故發(fā)生的主要原因[6]。同時(shí)，還可以采用發(fā)光細(xì)菌對(duì)區(qū)域污水毒性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，操作中要將之與生物毒性研究方法相結(jié)合起來，并對(duì)工業(yè)污水排水系統(tǒng)進(jìn)行急性毒性監(jiān)測(cè)分析，所得結(jié)果顯示工業(yè)排放廢水生物毒性比較高，并且會(huì)對(duì)受納河流生物生存質(zhì)量和微生物群落形成造成極大的影響，這一監(jiān)測(cè)結(jié)果也能夠?yàn)槲廴踞槍?duì)性防治與處理提供有力的支持。

2.3 有機(jī)化合物毒性測(cè)定

借助QSAR模型，對(duì)苯酚類化合物對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并采用相加指數(shù)法對(duì)聯(lián)合毒性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)苯酚能夠?qū)Πl(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生聯(lián)合作用，實(shí)際運(yùn)用就可以利用構(gòu)建的QSAR方程，對(duì)混合物取代苯酚的毒性進(jìn)行測(cè)定和分析。同時(shí)，還可以借助比較分子場(chǎng)分析方法，對(duì)不同種苯砜基乙酸酯類化合物的發(fā)光菌急性毒性進(jìn)行深入研究，所得到的3D-QSAR模型，分析也表明這類化合物發(fā)光菌急性毒性效應(yīng)與化合物分子空間場(chǎng)、靜電場(chǎng)存在十分緊密的關(guān)系，甚至還能從苯酚衍生物對(duì)發(fā)光細(xì)菌毒性定量構(gòu)效關(guān)系角度著手，對(duì)不同種類苯酚衍生物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性進(jìn)行有效測(cè)定，具體操作還能對(duì)疏水性和電性參數(shù)加以運(yùn)用，并完成定量構(gòu)效關(guān)系研究分析作業(yè)，待完成兩類化合物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性機(jī)制研究活動(dòng)以后，得到的結(jié)果也能為苯酚衍生物環(huán)境危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)和制定科學(xué)合理的防控方案提供強(qiáng)有力的支持[7]。另外，對(duì)苯酚與苯胺衍生物對(duì)發(fā)光菌的聯(lián)合毒性進(jìn)行測(cè)定，除了可以對(duì)劑量加和模型進(jìn)行運(yùn)用以外，還可以將之與單一毒物劑量和效應(yīng)參數(shù)相互聯(lián)系起來，實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物毒性的聯(lián)合預(yù)測(cè)，結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各種混合物毒性都能夠采用劑量加和模型進(jìn)行精確預(yù)測(cè)。

2.4 農(nóng)藥殘留測(cè)定

在開展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)時(shí)，為減少病蟲害發(fā)生和促進(jìn)農(nóng)作物更好生長(zhǎng)，許多農(nóng)戶都會(huì)對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行使用，特別是有機(jī)磷農(nóng)藥，實(shí)際運(yùn)用具有品種多、藥效好、防治對(duì)象多等優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長(zhǎng)期使用，也會(huì)對(duì)周圍生態(tài)環(huán)境造成極大的影響，并且有機(jī)磷農(nóng)藥多數(shù)品種都屬于高毒性，人們?cè)谑秤脦в修r(nóng)藥殘留的農(nóng)作物時(shí)，也容易出現(xiàn)慢性、急性中毒狀況，對(duì)人們生命健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，而采用發(fā)光細(xì)菌對(duì)氧化樂果、辛硫磷、甲胺磷等有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)，并通過發(fā)光細(xì)菌對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的響應(yīng)情況，科學(xué)準(zhǔn)確判定毒性濃度[8]。與此同時(shí)，還可以采用發(fā)光細(xì)菌方法對(duì)Zn、Cu、Hg等重金屬物質(zhì)的聯(lián)合毒性作用進(jìn)行研究，操作中可以將毒性加強(qiáng)指數(shù)方式融入其中，發(fā)現(xiàn)兩種金屬發(fā)生作用時(shí)，Cu與Zn主要為相加作用，而Zn與Cd主要為拮抗作用，Cd和Hg、Cu和Hg均為協(xié)同作用，而當(dāng)三種或四種金屬同時(shí)發(fā)揮作用時(shí)，聯(lián)合作用趨向于相加作用。除此之外，還可以通過發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試技術(shù)，對(duì)汽油、乙醇汽油、甲醇汽油的毒性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)毒性強(qiáng)度依次排列為汽油、乙醇汽油和甲醇汽油，操作中還可以對(duì)單純的添加劑、甲醇、乙醇毒性等進(jìn)行分別檢測(cè)，也初步判定了乙醇汽油毒性主要由汽油毒性引起。

3 發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用展望

相較于其他生物監(jiān)測(cè)方法，發(fā)光細(xì)菌快速、簡(jiǎn)單、靈敏等特點(diǎn)更為突出，并且發(fā)光細(xì)菌適用于大批量化合物和樣品的初篩，在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)、環(huán)境污染控制、環(huán)境科學(xué)規(guī)劃等方面有著十分廣闊的應(yīng)用前景，特別是在控制環(huán)境毒物污染和強(qiáng)化工業(yè)污染源管理方面，利用好發(fā)光細(xì)菌大有裨益?，F(xiàn)階段，發(fā)光細(xì)菌已經(jīng)在水質(zhì)、土壤、環(huán)境評(píng)價(jià)等領(lǐng)域中已經(jīng)得到十分廣泛的應(yīng)用，并取得較好毒性測(cè)定效果，伴隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，發(fā)光細(xì)菌方法也能得到進(jìn)一步完善，尤其是在該方法與其他先進(jìn)科學(xué)技術(shù)手段相聯(lián)合方面，可以為水質(zhì)分析、重金屬檢測(cè)等提供強(qiáng)有力的支持，環(huán)境污染監(jiān)測(cè)水平與質(zhì)量也能得到極大提升[9]。對(duì)發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望，主要包含：（1）利用發(fā)光細(xì)菌制作生物傳感器，考慮到一些污染物的濃度與發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度具有一定線性關(guān)系，這就為環(huán)境污染監(jiān)測(cè)提供了新的啟示，即有效利用這一線性關(guān)系穩(wěn)定、靈敏地反映污染物濃度變化情況，同時(shí)還可以采用發(fā)光細(xì)菌對(duì)識(shí)別元件進(jìn)行研發(fā)制作，比如生物毒性測(cè)試儀，將其運(yùn)用到環(huán)境污染監(jiān)測(cè)當(dāng)中，不僅功能十分強(qiáng)大，而且適用范圍比較廣、檢測(cè)靈敏度也較高；（2）發(fā)光細(xì)菌-基因工程，對(duì)基因工程技術(shù)進(jìn)行運(yùn)用，并通過相應(yīng)軟件系統(tǒng)，將其他非發(fā)光宿主細(xì)胞導(dǎo)入到其中，促進(jìn)其成為一類可以發(fā)光的細(xì)菌，由于這一細(xì)菌有了基因工程技術(shù)從旁提供支持，因此開展環(huán)境污染監(jiān)測(cè)工作，就能夠快速地測(cè)定污染物實(shí)際毒性，特別是在土壤、水體存在細(xì)菌分布情況監(jiān)測(cè)研究當(dāng)中，就可以直接通過得到的光線檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中存在微生物生長(zhǎng)、活性等情況在線監(jiān)測(cè)，甚至還可以利用發(fā)光酶對(duì)巨大芽孢桿菌進(jìn)行基因標(biāo)記，進(jìn)而得到更為穩(wěn)定發(fā)光的標(biāo)記菌株；（3）發(fā)光細(xì)菌微毒檢測(cè)，在海洋生物中，一些生物具有發(fā)光的生理現(xiàn)象，這時(shí)候就可以對(duì)這些發(fā)光菌體進(jìn)行仔細(xì)觀察和深入研究，并將重點(diǎn)放在發(fā)光細(xì)菌被化學(xué)物質(zhì)抑制上面，然后充分利用對(duì)環(huán)境較為敏感的發(fā)光細(xì)菌，對(duì)水體生物毒性進(jìn)行有效檢測(cè)，執(zhí)行時(shí)還可以分離出更多發(fā)光細(xì)菌變種，用來檢測(cè)環(huán)境污染物的致突變性，可以進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)范圍[10]。

4 結(jié)語

本文是對(duì)發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中應(yīng)用的研究，面對(duì)當(dāng)前社會(huì)發(fā)展暴露出的各種環(huán)境污染問題，社會(huì)各界對(duì)其監(jiān)測(cè)治理引起極大關(guān)注，而將發(fā)光細(xì)菌方法運(yùn)用到環(huán)境污染監(jiān)測(cè)工作當(dāng)中，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)各類污染物毒性的有效測(cè)定與評(píng)價(jià)，所得結(jié)果也能為環(huán)境污染控制、環(huán)境污染治理等提供參考依據(jù)。實(shí)際操作中，要想取得這一理想效果，就要對(duì)發(fā)光細(xì)菌的分類、機(jī)理、測(cè)定方法等有一個(gè)全面系統(tǒng)的了解，然后將之運(yùn)用到工業(yè)廢水毒性測(cè)定、特定水域毒性測(cè)定、有機(jī)化合物毒性測(cè)定等中，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，要促進(jìn)發(fā)光細(xì)菌在環(huán)境污染監(jiān)測(cè)領(lǐng)域得到更加深入的應(yīng)用，還要堅(jiān)持與時(shí)俱進(jìn)，促進(jìn)發(fā)光細(xì)菌與現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)相融合，并取得擴(kuò)大檢測(cè)范圍、提高監(jiān)測(cè)結(jié)果質(zhì)量等效果。