全自動(dòng)固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定 醬鹵肉制品中胭脂紅的優(yōu)化

◎ 蘇駿敏，沈昌瑩，張樹(shù)權(quán)

（東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞 523808）

胭脂紅，又稱(chēng)為酸性紅18、麗春紅4R，屬于合成著色劑，是一種被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中的單偶氮類(lèi)人工合成色素[1]。人工合成色素與天然色素相比，具有著色能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、成本低廉等優(yōu)勢(shì)[2]。因此醬鹵肉制品在生產(chǎn)過(guò)程中有時(shí)會(huì)加入胭脂紅，以改善食品的色澤外觀，提高人們的食欲。但人工合成色素具有慢性毒性，在人體內(nèi)蓄積分解后，有可能會(huì)轉(zhuǎn)化成致癌物質(zhì)，且具有致畸性，長(zhǎng)期過(guò)量使用危害人體健康[3-8]。同時(shí)，不法分子可能通過(guò)使用胭脂紅掩蓋變質(zhì)肉等不良原料的外觀[9-10]。依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[11]的規(guī)定，醬鹵肉制品中禁止使用胭脂紅，但仍存在不少不法商販在醬鹵肉制品生產(chǎn)過(guò)程中超范圍使用胭脂紅。目前，測(cè)定食品中胭脂紅的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法有 GB/T 9695.6—2008[12]和GB 5009.35—2016[13]，該檢測(cè)方法前處理操作步驟煩瑣，均采用聚酰胺吸附法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有大量目標(biāo)物損失，且對(duì)于油脂含量較高的樣品在檢測(cè)中易出現(xiàn)提取率低、凈化效果不佳、回收率較低等問(wèn)題，不適用于大批量樣品的檢測(cè)。

本研究在現(xiàn)行國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法基礎(chǔ)上，對(duì)除脂、提取和凈化步驟進(jìn)行改進(jìn)，采用固相萃取法替代國(guó)標(biāo)方法中的聚酰胺粉末吸附法，通過(guò)全自動(dòng)固相萃取儀，自動(dòng)完成固相萃取凈化全過(guò)程，以期為醬鹵肉制品中胭脂紅的測(cè)定提供一種快捷、靈敏度高的檢測(cè) 方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀（配備1240-元素光電二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Fotector Plus高通量全自動(dòng)固相萃取儀（廈門(mén)?？苾x器有限公司）；3K 15高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；HS 501數(shù)顯型振蕩搖床（德國(guó)IKA公司）；Evatros氮吹濃縮儀（Goojung公司）；METTLER TOLEDO SevenExcellence型數(shù)字式精密酸度計(jì)（美國(guó)梅特勒公司）。

甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；無(wú)水乙醇、一水合檸檬酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；氨水（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；乙酸銨（色譜純，山東西亞化學(xué)股份有限公司）；甲酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；Cleanert PWAX固相萃取柱（6 mL，500 mg）、Cleanert PA聚酰胺固相萃取柱（6 mL，1 g）（北京艾杰爾科技公司）；Oasis WAX固相萃取柱（150 mg，6 mL）、Oasis HLB（200 mg，6 mL）（美國(guó)Waters公司）；Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；0.45 μm水系濾膜（深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水；胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)22001，濃度0.500 mg·mL-1，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）。

樣品來(lái)自廣東省內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)抽樣。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

甲醇-甲酸溶液（3+2，體積比）：量取甲醇30 mL， 甲酸20 mL，混勻；15%氨水甲醇溶液：取15 mL氨水，用甲醇定容至100 mL；20%乙醇-氨溶液：量取20 mL氨水、70 mL無(wú)水乙醇、10 mL水，混勻；檸檬酸溶液：稱(chēng)取20 g 檸檬酸，加水定容至100 mL；水（pH=6.0）：取100 mL水，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.0；水（pH=4.0）：取100 mL水，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0。

1.2.2 樣品前處理

稱(chēng)取5 g（精確至0.001 g）粉碎均勻的醬鹵肉制品于50 mL離心管中，加入20%乙醇-氨溶液20 mL，旋緊蓋子，渦旋1 min，置于振蕩搖床上振蕩提取20 min 后，于-18 ℃冷凍30 min，8 000 r·min-1、4 ℃離心5 min， 上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，再分別用15 mL、10 mL提取液重復(fù)提取2次，合并提取液，用乙醇-氨溶液定容至刻度。精密移取上清液10 mL，70 ℃氮吹濃縮至約2 mL，混勻后待凈化。

全自動(dòng)固相萃?。阂来斡? mL甲醇、6 mL水（pH=6.0）活化后，上樣，再用6 mL水（pH=4.0）、6 mL甲醇-甲酸（3+2），6 mL水（pH=6.0）淋洗，6 mL 15%氨水甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，70 ℃氮吹至近干，殘?jiān)? mL水溶解，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過(guò)濾后進(jìn)高效液相色譜儀檢測(cè)分析。

1.2.3 儀器條件

（1）全自動(dòng)固相萃取儀凈化程序詳見(jiàn)表1。

表1 全自動(dòng)固相萃取儀凈化程序表

（2）液相色譜儀條件。色譜柱：Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A甲醇；B 0.02 mol·L-1乙酸銨溶液；梯度洗脫程序見(jiàn)表2；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 508 nm。

表2 流動(dòng)相洗脫梯度表

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 除脂條件的優(yōu)化

醬鹵肉制品中含有大量的油脂，其對(duì)胭脂紅的提取存在較大影響，且易在凈化時(shí)堵塞固相萃取柱，因此在前處理提取過(guò)程中需去除脂肪。根據(jù)文獻(xiàn)[14]，QuEChERS EMR-Lipid可用于去除樣品基質(zhì)中脂質(zhì)的干擾，本文采用冷凍去脂（-18 ℃）、QuEChERS方法、石油醚除脂方法進(jìn)行比較分析，考察3種除脂方法對(duì)醬鹵肉制品中胭脂紅提取的影響，提取率結(jié)果見(jiàn) 表3。

表3 不同除脂方法下胭脂紅的提取率表（n=3）

根據(jù)表3結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)冷凍去脂的醬鹵肉制品的胭脂紅提取率最高，QuEChERS方法的提取率最低。同時(shí)，分別比較了-18 ℃、4 ℃、常溫下離心對(duì)樣品中胭脂紅提取率的影響，發(fā)現(xiàn)在4 ℃離心的提取率最高。因此，選用冷凍去脂并在4 ℃離心作為醬鹵肉制品的去脂方法。

2.1.2 提取液氨水濃度的選擇

胭脂紅極性較強(qiáng)，易溶于水，難溶于乙醇。用水作為提取液，提取效果不理想，難以提取出與蛋白質(zhì)結(jié)合的胭脂紅，且提取液中雜質(zhì)較多。因此，分別用10%、20%、30%、40%和50%氨水溶液作為提取液，考察氨水濃度對(duì)醬鹵肉制品中胭脂紅提取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，當(dāng)氨水濃度為20%時(shí)，胭脂紅的提取效率最高。當(dāng)氨水濃度在20%～50%時(shí)，隨著氨水濃度的升高，提取液愈發(fā)渾濁，這是由于氨水濃度過(guò)高導(dǎo)致樣品中的脂肪游離進(jìn)提取液。氨水濃度過(guò)高不利于后續(xù)冷凍除脂，導(dǎo)致提取液中干擾增多，提取效率下降。因此最終選擇20%氨水溶液，即為無(wú)水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）作為提取液。

圖1 不同濃度氨水下胭脂紅的平均提取效率圖（n=3）

2.1.3 固相萃取柱凈化條件的優(yōu)化

本研究參考了國(guó)標(biāo)和相關(guān)文獻(xiàn)[12-17]，研究考察胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)溶液用Cleanert PWAX（500 mg，6 mL）、Cleanert PA（1 g，6 mL）、Oasis WAX（150 mg，6 mL）和Oasis HLB（200 mg，6 mL）固相萃取柱在不同淋洗和洗脫條件下的回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同固相萃取柱在不同淋洗、洗脫條件下的回收率表

由表4可看出，Cleanert PWAX固相萃取柱回收率在0%～70%，Oasis HLB固相萃取柱回收率在19%～30%，且PWAX柱使用較低濃度的氨水甲醇溶液不能將胭脂紅從柱中洗脫出來(lái)，HLB柱對(duì)胭脂紅的吸附效果不佳，很難保留。Oasis WAX柱在使用水和甲醇淋洗時(shí)回收率較好，能達(dá)到70%以上，隨著氨水甲醇洗脫液濃度的增加，回收率逐漸上升。Cleanert PA萃取柱在使用甲醇-甲酸（3∶2）作為淋洗液，15%氨水甲醇洗脫時(shí)，效果較好，回收率可達(dá)到90%以上。

對(duì)比胭脂紅樣品加標(biāo)提取液過(guò)柱凈化效果情況，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，經(jīng)Cleanert PA柱凈化后胭脂紅的回收率最高，Oasis HLB柱回收率最低。綜合考慮到胭脂紅的回收率，以及為降低廢液污染和節(jié)約成本，最終選擇水（pH=4.0）、甲醇-甲酸（3∶2）、甲醇作為淋洗液，15%氨水甲醇作為洗脫液，Cleanert PA作為凈化用固相萃取柱。

圖2 不同固相萃取柱對(duì)胭脂紅回收率的影響圖（n=3）

2.1.4 氮吹濃縮溫度的優(yōu)化

將洗脫液收集于10 mL試管中，分別考察在55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃下進(jìn)行氮吹的胭脂紅的回收率。結(jié)果表明，氮吹溫度對(duì)胭脂紅的回收率影響不明顯，考慮到在55 ℃～65 ℃下氮吹耗時(shí)較長(zhǎng)，因此確定氮吹溫度為70 ℃。

2.1.5 針式過(guò)濾器的選擇

洗脫液經(jīng)氮吹至近干后，加水定容至1 mL，過(guò) 0.45 μm濾膜后上機(jī)檢測(cè)。考察對(duì)比北京振翔科技有限公司的親水PTFE濾頭、津騰的PTFE濾頭和深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司的PES濾頭、上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司的Nylon濾頭。上機(jī)結(jié)果顯示，經(jīng)PES濾頭過(guò)濾的待測(cè)液中胭脂紅含量較高，原因可能是Nylon和PES膜對(duì)胭脂紅有所吸附[17-18]。故選用深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司的PES濾頭用于洗脫液的過(guò)濾。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍及方法檢出限

準(zhǔn)確吸取適量胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用水稀釋成濃度為50.0 μg·mL-1的貯備液，再用水將貯備液依次稀釋成濃度為0.01 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1和20.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣量為10 μL，以胭脂紅質(zhì)量濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。胭脂紅質(zhì)量濃度在0.01～50.00 μg·mL-1線性良好，相關(guān)系數(shù)≥0.999，斜率為0.827 3。按照本試驗(yàn)前處理方法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行處理，以色譜峰3倍信噪比 （S/N=3）求得方法檢出限（Limits of Detection，LOD），本方法胭脂紅的方法檢出限為0.02 mg·kg-1，低于國(guó)標(biāo)方法GB/T 9695.6—2008，滿足試驗(yàn)要求。

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

平行稱(chēng)取18份醬鹵肉空白基質(zhì)樣品，分別在 0.1 mg·kg-1、5.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-13個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度加標(biāo)樣品重復(fù)測(cè)定6次，加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，胭脂紅在3個(gè)添加水平的回收率為85.2%～94.7%，滿足GB/T 27404—2008[19]附錄F.1中要求被測(cè)組分含量在0.1～1.0 mg·kg-1以及1～100 mg·kg-1，回收率分別在80%～110%、90%～110%的要求。與國(guó)標(biāo)方法GB/T 9695.6—2008回收率60%～80%相比較，本方法回收率顯著提升，且精密度良好，能滿足檢測(cè)的要求。

表5 加標(biāo)回收率和精密度表（n=6）

3 結(jié)論與討論

本研究采用無(wú)水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）作為提取液，通過(guò)冷凍除脂、低溫離心，使用聚酰胺固相萃取柱，采用固相萃取法替代國(guó)標(biāo)中的聚酰胺吸附法[20]，并且全過(guò)程無(wú)需對(duì)提取液調(diào)節(jié)pH值，氮吹后定容即可上機(jī)，適用于富含油脂的醬鹵肉制品中的胭脂紅的測(cè)定。同時(shí)，采用全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行凈化，無(wú)需人工干預(yù)，自動(dòng)完成固相萃取柱的活化、上樣、淋洗、洗脫和收集等全過(guò)程。采用本方法進(jìn)行測(cè)定，回收率與相關(guān)文獻(xiàn)方法比較有較大的提升，方法檢出限低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 9695.6—2008。同時(shí)，本方法前處理方便快捷，節(jié)省了提取凈化用試劑的消耗，降低污染，能滿足大批量醬鹵肉制品中胭脂紅的日常檢測(cè)。