超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定動物組織中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和 其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺殘留量

◎ 鄭陸紅，張慧瓊，陳 茹，黃柳霞

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質量監(jiān)督檢驗站，廣東 廣州 511442）

氯霉素類藥物是一類廣譜抑菌抗生素，常見的氯霉素類藥物主要包括氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP）和氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）及其代謝物氟苯尼考胺（Florfenicol Amine，F(xiàn)FA）等[1]。氟苯尼考是一種新型酰胺醇類抗生素，氟苯尼考胺是氟苯尼考的主要代謝產(chǎn)物，通常以氟苯尼考胺作為動物體內(nèi)氟苯尼考的殘留標示物[2-3]。 氯霉素對人體的造血系統(tǒng)損害極大，易引起再生障礙性貧血，也可導致致命的“灰嬰綜合征”[4]，我國和歐盟等國家都禁止其在食用的動物源性產(chǎn)品中使用。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250號公告將氯霉素列入了《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》[5]，不允許在動物食品中有殘留。由于甲砜霉素和氟苯尼考抗菌譜與氯霉素相似，較氯霉素其毒性有所降低，抗菌活性和安全性優(yōu)于氯霉素，目前已廣泛應用于獸醫(yī)臨床防治細菌性疾病，但仍然對胚胎有影響[6]。為保障食品安全，我國制定了甲砜霉素和氟苯尼考在動物源性食品中的最大殘留限量，GB 31650—2019規(guī)定了甲砜霉素和氟苯尼考可用于豬、牛、羊、家禽和魚，但特別規(guī)定“家禽（產(chǎn)蛋禁用）”，最高殘留限量分別為50 μg·kg-1和100～3 000 μg·kg-1[7]。

高效液相色譜-串聯(lián)質譜（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLCMS/MS）法為目前檢測氯霉素類藥物最常用的方法。國內(nèi)外報道的動物組織中氯霉素類藥物的殘留檢測方法很多[8-11]，但存在許多局限性，不能滿足當前動物性食品中霉素素類藥物殘留檢測效率的需要。部分方法檢測藥物殘留種類覆蓋不全，缺少對氟苯尼考的殘留標示物氟苯尼考胺的檢測，或針對的動物組織不全，適用范圍有限等[12-15]。目前采用HPLC-MS/MS同時對豬肉、雞肉和魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量分析的檢測方法報道較少。本研究在GB/T 22338—2008[16]和GB 31658.5—2021[17]標準方法的基礎上進行改進，采用氯霉素-D5作為內(nèi)標，堿化乙酸乙酯提取，正己烷去除油脂，通過MCX固相萃取柱凈化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測豬肉、雞肉和魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的方法。本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定量準確，適用于大批量豬肉、雞肉和魚肉樣品中氯霉素類藥物的定性、定量分析，為政府加強對違規(guī)使用獸藥問題的監(jiān)管提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素-D5（CAS 202480-68-0），BePure公司；氯霉素（CAS 56-75-7，純度98.0%），F(xiàn)irst Standard公司；甲砜霉素（CAS 15318-45-3，純度99.31%）、氟苯尼考（CAS 73231-34-2，純度99.90%）和氟苯尼考胺（CAS 76639-93-5，純度99.5%），Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、乙腈、正己烷，色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司；乙酸分析純，天津市康科德科技有限公司；氨水，色譜純，上海安譜科技股份有限公司；Oasis MCX固相萃取小柱（60 mg/3 mL），美國Waters 公司；豬肉、雞肉和魚肉樣品采購于某網(wǎng)購平臺。

AB Sciex Triple Quad 4500高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，AB Sciex公司；分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；均質機、MS3 digital漩渦混合器，德國IKA公司；Multi Reax渦旋振蕩器，德國Heidolph公司；AutoEva-6氮吹儀，杭州奧盛儀器公司；ROTINA 380R 離心機，德國Hettich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試料的制備

取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并均質。

1.2.2 提取

稱取試樣2.0 g于50 mL離心管中，準確加入100 μL 100 ng·mL-1氯霉素-D5溶液，渦旋混勻，靜置15 min， 加入乙酸乙酯-氨水（98+2，V/V）溶液10 mL，振蕩1 min，10 000 r·min-1離心3 min，轉移上清液于另外一只離心管中，殘渣重復提取2次，合并3次提取液。離心管中加入5%乙酸2 mL，振蕩混勻，于40 ℃ 水浴中濃縮至1.5 mL。轉移至50 mL離心管中，用5%乙酸2 mL洗滌氮吹管，洗滌液轉移至同一離心管，加正己烷5 mL脫脂，振蕩1 min，10 000 r·min-1離心5 min，棄上層，下層提取液重復脫脂一次，備用。

1.2.3 凈化

將提取液轉移至MCX固相萃取小柱（60 mg/3 mL，使用前依次用2 mL甲醇和2 mL水活化）中，棄去。用2 mL 5%乙酸溶液淋洗，用5 mL 10%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴中氮吹干。用0.5 mL 30%乙腈水溶溶解殘渣，混勻后經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后供UHPLC-MS/MS分析。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速： 0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量2 μL；流動相：A為0.1%氨水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0.00～1.30 min， 95%A；1.30～5.00 min，95%A→10%A； 5.00～6.00 min，10%A；6.0～6.01 min，5%A； 6.01～7.00 min，95%A。

1.2.5 質譜條件

電噴霧（ESI）離子源，正負離子切換掃描模式；氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素-D5采用負離子掃描方式，多反應監(jiān)測模式（MRM），氣簾氣30 psi，碰撞氣9 psi，離子化電壓-4 500 V，溫度550 ℃，噴霧氣50 psi，輔助加熱器50 psi；氟苯尼考胺采用正離子掃描方式，多反應監(jiān)測模式（MRM），氣簾氣30 psi，碰撞氣9 psi，離子化電壓5 500 V，溫度550 ℃，噴霧氣50 psi，輔助加熱器50 psi；采集參數(shù)見表1。

表1 氯霉素類藥物信息及質譜參數(shù)優(yōu)化條件表

1.2.6 標準工作曲線的配制

分別稱取適量氯霉素類藥物標準品于各自的容量瓶中，用乙腈配制成1 mg·L-1的標準儲備液。準確移取適量各標準儲備液于容量瓶中，用30%乙腈水溶液稀釋成1 000 μg·L-1的混合標準中間液。準確移取適量混合標準中間液用相應的空樣品基質提取液稀釋成濃度為0.5～100.0 μg·L-1的系列混合標準工作溶液，氯霉素-D5內(nèi)標濃度為20 μg·L-1。

1.3 結果處理

實驗結果采用MultiQuant軟件進行繪圖和數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素為弱極性物質，在C18色譜柱上有較強的保留，色譜條件相對容易選擇；而氟苯尼考胺為堿性化合物，極性較強在C18柱上保留較弱。本方法比較了水-乙腈、0.1%氨水-乙腈和5 mmol·L-1乙酸銨溶液-乙腈作為流動相時各化合物的分離情況。選擇水-乙腈作流動相時，氟苯尼考胺的出峰時間較早，易受雜質干擾，從而影響定量結果。而5 mmol·L-1乙酸銨溶液-乙腈作流動相時，氟苯尼考胺有拖尾現(xiàn)象，峰型不對稱。選擇0.1%氨水-乙腈作流動相時，調整流動相的pH值，氟苯尼考胺的保留時間為3.48 min，分離度和峰形效果較好。通過對比不同的流動相、色譜柱、初始比例以及流速，最終發(fā)現(xiàn)Waters BEH C18（100 mm×2.1 m，1.7 m）對氟苯尼考胺有一定的保留。為更好地分離待測物和樣品中的雜質，本方法最終選用乙腈的初始比例為5%，0.1%氨水溶液和乙腈進行梯度分析，樣品總的運行時間為7 min，讓雜質能夠完全流出，避免下一針樣品產(chǎn)生柱上污染，降低了氟苯尼考胺的基質效應，本方法在相對較短時間內(nèi)能較好地分離4種物質，滿足對目標物的定性和定量要求。

2.2 質譜條件的選擇

UHPLC-MS/MS采用的是電噴霧離子化（ESI）使化合物帶電，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考為酸性化合物，采用負模式電噴霧離子源；氟苯尼考胺含有氨基官能團，選擇用正模式電噴霧離子源，進行離子掃描。表1中為確認的質譜采集參數(shù)；圖1為氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺和氯霉素-D5的標準品多反應監(jiān)測模式離子描譜圖。

圖1 氯霉素藥物標準溶液總離子流圖

2.3 線性關系、檢出限和定量限

分別用3種空白基質提取液配制標準工作曲線，以各待測物與氯霉素-D5的濃度比X為橫坐標，以各待測物與氯霉素-D5峰面積比Y為縱坐標，進行回歸分析，得到各待測物的回歸曲線方程及相關系數(shù) （表2）。由表2看出，4種化合物線性關系良好，相關系數(shù)（R2）均大于0.999，可用于準確定量。結合本方法的前處理過程，以3倍信噪比時的響應值計算檢出限，本方法氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限均為 0.1 μg·kg-1，氟苯尼考胺的檢出限為0.5 μg·kg-1；以 10倍信噪比時的響應值計算本方法的定量限，4種待測物的定量限均為1.0 μg·kg-1。

2.4 基質效應

基質效應（Matrix Effect，ME）的產(chǎn)生是由于待測物與基質成分中的磷脂、膽固醇等內(nèi)源性物質一同流出色譜柱，從而產(chǎn)生競爭抑制引起的[18]。在HPLC-MS/MS測定復雜樣品時，由于內(nèi)源性的物質極性較大，會同待測物離子競相競爭液滴表面，導致待測物的離子化效率降低或增強，引起響應的降低或增高，影響定量的精密度和準確度。分別用3種空白基質提取液配制的標準工作曲線與用30%乙腈水溶液配制的標準工作曲線進行對比，以兩條曲線的斜率比值作為考察基質效應強弱的指標，公式為ME=（基質匹配標準工作曲線的斜率/無基質標準工作曲線的斜率-1）×100%。|ME|＜20%，為弱基質效應；|ME|為20%～50%，為中等基質效應，而|ME|＞50%，為強基質效應。氯霉素類藥物的基質效應見表2。從實驗結果可以看出，豬肉、雞肉和魚肉中氟苯尼考胺的|ME|在20%～50%，為中等基質抑制效應，而氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的|ME|均小于20%，為弱基質效應。

表2 氯霉素類藥物的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限與基質效應表

2.5 回收率及精密度實驗

分別在豬肉、雞肉和魚肉3種不同基質的陰性樣品中添加低、中、高3個濃度水平的氯霉素類藥物，每個加標水平平行測定6次，計算其回收率和相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。表3的分析結果表明，本方法精密度高（RSD＜10%），準確度好，回收率在81%～112%。

表3 氯霉素類藥物添加水平、回收率及RSD表（n=6）

3 結論

本方法采用堿化乙酸乙酯提取，正己烷去除油脂，通過MCX固相萃取柱凈化，減少基質干擾；采用空白基質提取液配制標準工作曲線以及同位素內(nèi)標法定量來降低基質效應，以滿足測定靈敏度和專屬性的要求；通過質譜電噴霧正負離子切換多反應監(jiān)測模式實現(xiàn)了一針進樣4種氯霉素類藥物的同時測定。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考在0.5～100.0 μg·L-1具有良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）均大于0.999，檢出限均為 0.1 μg·kg-1，方法回收率為83%～112%，相對標準偏差小于10%；氟苯尼考胺在1～100 μg·L-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）大于0.999，檢出限為0.5 μg·kg-1，方法回收率為81%～110%，相對標準偏差小于10%。本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定量準確，方法檢出限能夠滿足食品安全風險監(jiān)測的要求，適用于日常大批量豬肉、雞肉和魚肉樣品中氯霉素類藥物及其代謝物殘留的定性、定量分析。