一種高產(chǎn)谷氨酰胺酶的米曲霉菌種的篩選 及應(yīng)用的研究

◎ 滑歡歡，扈圓舒，梁 亮，伍加文，黃敏斯，陸邦煉，梁蘭蘭

（廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528400）

醬油是一種以大豆、小麥、麩皮等為主要原料，經(jīng)過微生物發(fā)酵形成的富含營養(yǎng)的調(diào)味品?，F(xiàn)有的釀造醬油工藝，包括原料蒸煮、制曲、發(fā)酵以及淋油等步驟[1]。醬油的釀造是利用米曲霉菌株分泌的不同水解酶類，將原料中的大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)、淀粉質(zhì)等）分解成呈味的多肽、氨基酸、糖類、磷脂、維生素和有機(jī)酸等小分子物質(zhì)，形成醬油的營養(yǎng)成分，使醬油具有高的營養(yǎng)價值，并賦予醬油獨(dú)特的風(fēng)味，即咸、酸、鮮、甜、苦五味調(diào)和。因此，米曲霉菌種對醬油的釀造尤為重要，是醬油釀造的基礎(chǔ)，其性能對醬油質(zhì)量和產(chǎn)能影響甚大[2]。

有研究表明，米曲霉在醬油生產(chǎn)的制曲階段分泌的酶系種類和活力狀況對醬醪發(fā)酵成熟的快慢、原料利用率的高低、成品色澤的濃淡以及味道的鮮美與否都有著直接的關(guān)系[3]。而在米曲霉生長過程中分泌的眾多酶系中，谷氨酰胺酶活性的高低將直接影響到天然釀造原油中谷氨酸的含量，以及影響成品的口感鮮味，進(jìn)而影響醬油產(chǎn)品的品質(zhì)[4]。

目前，我國的醬油釀造已廣泛使用純粹培養(yǎng)的米曲霉，常用的米曲霉菌株主要為As3.042和As3.951。上述兩種菌株是國內(nèi)醬油生產(chǎn)廠家普遍使用的優(yōu)良菌株，其能夠產(chǎn)出豐富的蛋白酶水解酶，其中主要以中性和堿性蛋白酶為主[5]；但是這兩種菌株產(chǎn)出的其他酶系不足，使得原料中各種成分（如蛋白質(zhì)原料）不能完全被分解，因而導(dǎo)致釀造醬油風(fēng)味不足，尤其是產(chǎn)出的谷氨酰胺酶不足導(dǎo)致鮮味不佳[6]。因此，廠家為了保證醬油產(chǎn)品的良好的鮮味，往往會通過額外添加谷氨酸鈉等鮮味劑來提高產(chǎn)品品質(zhì)，生產(chǎn)出符合消費(fèi)者口味的產(chǎn)品。然而，隨著生活水平的提高，人們?nèi)找骊P(guān)注健康飲食，額外添加這些鮮味劑不僅會給消費(fèi)者留下不好的印象，還會使得生產(chǎn)成本增加，最終影響了產(chǎn)品的競爭力[7]。所以，通過釀造醬油過程天然獲取的鮮味日益受到重視[8]。因此，設(shè)法提高米曲霉在制曲階段的谷氨酰胺酶活力是高端醬油提高天然鮮味的重要途徑。

目前，醬油的優(yōu)劣通過醬油中氨基酸態(tài)氮含量來判斷；氨基酸態(tài)氮含量是指以氨基酸態(tài)氮形式存在的氮元素的含量，它代表了醬油中氨基酸含量的高低。因此，當(dāng)醬油的氨基酸態(tài)氮含量越高，則被認(rèn)為其質(zhì)量越好，風(fēng)味越好。這也使得國內(nèi)的醬油生產(chǎn)廠家大多致力于追求高氨基酸態(tài)氮含量即高氨基酸生成率的醬油，致力于提高醬油的原料利用率，而對提高醬油鮮味、甜味等風(fēng)味指標(biāo)的研究較少[9]。但實(shí)際上氨基酸態(tài)氮含量表示的是醬油中各種氨基酸的總含量，并不能表示某一種氨基酸的含量（如谷氨酰胺酶含量），因此氨基酸態(tài)氮含量高不代表醬油的鮮味、甜味等個別風(fēng)味指標(biāo)優(yōu)秀。本文主要研究通過改變菌種種類來提高醬油曲中的谷氨酰胺酶活力，進(jìn)而提高醬油中的谷氨酸含量，達(dá)到在原料利用率不變的基礎(chǔ)上提高醬油的風(fēng)味[10]。

此外，現(xiàn)有的米曲霉產(chǎn)孢子能力強(qiáng)，即產(chǎn)孢量較大，會對醬油生產(chǎn)過程產(chǎn)生相當(dāng)大的影響，制曲過程中，在松曲和出曲時，容易出現(xiàn)孢子滿天飛的問題而影響生產(chǎn)環(huán)境和工作環(huán)境。由于米曲霉孢子不溶于水，所以產(chǎn)孢量大的大曲吸水時間變長，即與鹽水的混合時間會延長。同時成熟的大曲會產(chǎn)熱，隨著大曲與鹽水混合時間的延長，增加了雜菌滋生的隱患。

本文經(jīng)過誘變選育得到一株能夠高產(chǎn)谷氨酰胺酶活力的米曲霉M01，其在保持米曲霉原有高蛋白酶活力的基礎(chǔ)上，能夠高產(chǎn)谷氨酰胺酶。應(yīng)用該菌株釀造醬油等調(diào)味品時，能夠進(jìn)一步提高醬油鮮味和甜味，有效解決醬油天然鮮味不足的問題。該米曲霉產(chǎn)孢子能力略有所降低，既不影響制曲時米曲霉的生長，又不會產(chǎn)生大量孢子影響生產(chǎn)環(huán)境和工作環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造黃豆醬生產(chǎn)原料：黃豆、面粉、食鹽從市場采購；米曲霉菌種：米曲霉As3.951，由廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司提供；試劑：干酪素、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂和瓊脂粉等從市場購買。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺、培養(yǎng)箱、種曲機(jī)、NK式旋轉(zhuǎn)蒸煮鍋、發(fā)酵池、60 m3發(fā)酵罐等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米曲霉菌株誘變

取As3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子懸液，并對孢子懸液進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變（Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP）。用0.85%的無菌生理鹽水將誘變后的孢子懸液逐級稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6濃度，制成孢子稀釋液；取0.2 mL孢子稀釋液涂布于酪蛋白平板培養(yǎng)基上，31 ℃避光培養(yǎng)96 h，培養(yǎng)過程中觀察并記錄菌落的菌絲生長和產(chǎn)孢情況、透明圈形成的快慢及透明圈大小等；挑取與出發(fā)菌株As3.951相比具有菌絲生長正常、透明圈大、產(chǎn)孢時間延遲特點(diǎn)的菌落；將挑選出的目標(biāo)菌落繼續(xù)涂布于大豆蛋白平板培養(yǎng)基上，31 ℃培養(yǎng)60 h，挑取與出發(fā)菌株As3.951相比有菌落直徑大、菌絲生長正常的菌落。

1.3.2 誘變后菌株的初篩和復(fù)篩

（1）初篩方法。將突變菌株由豆汁斜面活化后轉(zhuǎn)接三角瓶培養(yǎng)，觀察生長情況，挑選其中菌絲生長旺盛和孢子著生正常的突變菌株，并采用常規(guī)方法檢測成曲的發(fā)芽率和孢子數(shù)。

（2）復(fù)篩方法。對初篩獲得的10株形狀優(yōu)良的米曲霉菌株，以出發(fā)菌株為對照菌株，進(jìn)行小試制曲和生產(chǎn)發(fā)酵篩選。

1.3.3 米曲霉M01菌株遺傳穩(wěn)定性檢測

誘變獲得選育菌株高產(chǎn)谷氨酰胺酶活的傳代穩(wěn)定性是關(guān)系菌種質(zhì)量的重要考察指標(biāo)?，F(xiàn)將選育獲得的誘變菌株米曲霉M01進(jìn)行傳代，在高、中、低3個溫度進(jìn)行了培養(yǎng)溫度與水解圈相關(guān)試驗(yàn)，對第0～10代的菌種按照常規(guī)方法進(jìn)行三角瓶培養(yǎng)、制曲和發(fā)酵，并分析孢子數(shù)、酶活力、氨基酸態(tài)氮等指標(biāo)。

1.3.4 小試規(guī)模對比米曲霉M01菌株與醬油釀造用種的產(chǎn)谷氨酸能力

選育獲得的米曲霉M01菌株具有高產(chǎn)氨基酸、全氮和谷氨酸的優(yōu)勢，與廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司菌種庫中保藏的釀造醬油用的米曲霉菌株相比較，對比不同菌株的產(chǎn)氨基酸、全氮和谷氨酸的能力。

1.3.5 米曲霉M01菌株在醬油釀造中的應(yīng)用

以單個65 m3發(fā)酵罐為單位進(jìn)行高產(chǎn)率游離谷氨酸米曲霉效果的驗(yàn)證試驗(yàn)，將選育到的米曲霉M01菌株和對照菌株分別制曲，成熟大曲按照一定比例進(jìn)行制醪，然后發(fā)酵天然油，送檢天然油的游離谷氨酸含量，并對過程中的三角瓶種、成曲和發(fā)酵天然油進(jìn)行質(zhì)量分析。

1.3.6 米曲霉M01菌株釀造醬油的感官鑒評

針對米曲霉M01菌株釀造得到的醬油，召集10名有豐富經(jīng)驗(yàn)的鑒評人員進(jìn)行感官鑒評，感官鑒評的評價指標(biāo)包括體態(tài)、色澤、香氣、鮮味、甜味、苦澀味、咸味、酸味和綜合口感，分值為0～4分，分?jǐn)?shù)越高，該項(xiàng)指標(biāo)越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 選育到菌株的復(fù)篩結(jié)果分析

根據(jù)表1和表2的結(jié)果，相對于對照菌株及其他突變菌株，菌株SY07用于制曲和發(fā)酵有更好的表現(xiàn)；將菌株SY07命名為米曲霉M01，并進(jìn)行保藏。

如表1的結(jié)果所示，選育獲得的米曲霉M01菌株具有以下特點(diǎn)。①生長速度與對照菌株相當(dāng)，孢子量大大減少。②中性蛋白酶活和谷氨酰胺酶活力顯著提高，特別是谷氨酰胺酶活力提高57%左右，預(yù)期可顯著提高發(fā)酵原油的理化指標(biāo)水平。

表1 菌株復(fù)篩制曲質(zhì)量分析結(jié)果表

如表2的結(jié)果所示，選育獲得的米曲霉M01菌株發(fā)酵指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，其具有高產(chǎn)氨基酸、全氮和谷氨酸的優(yōu)勢，其中谷氨酸比對照菌株高出49%；上述發(fā)酵指標(biāo)有利于改善發(fā)酵原油的鮮味，使口感更加豐富，因此選育獲得的米曲霉M01菌株相對于對照菌株具有明顯優(yōu)勢。

表2 菌株復(fù)篩發(fā)酵質(zhì)量分析結(jié)果表

2.2 米曲霉M01菌株遺傳穩(wěn)定性檢測

如表3和表4所示，通過10代傳代試驗(yàn)分析了米曲霉M01菌株在28 ℃、32 ℃、36 ℃ 3個溫度下的穩(wěn)定性，菌落直徑和K值的結(jié)果顯示，米曲霉M01菌株在菌落形態(tài)和蛋白酶分泌方面表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性，符合生產(chǎn)使用需求。在該菌株傳代試驗(yàn)中，由每代菌種制作三角瓶種、制得的大曲及發(fā)酵天然油的質(zhì)量分析結(jié)果可知，該菌株釀造醬油的發(fā)酵能力穩(wěn)定，適合生產(chǎn)需要。

表3 米曲霉M01在不同溫度條件下在酪蛋白培養(yǎng)基上傳代穩(wěn)定性分析表

表4 米曲霉M01傳代穩(wěn)定性的三角瓶種、成曲和發(fā)酵天然油質(zhì)量分析表

2.3 小試規(guī)模對比米曲霉M01菌株與醬油釀造用種的產(chǎn)谷氨酸能力

由表5可知，選出廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司菌種庫中產(chǎn)谷氨酸能力較高的醬油釀造用菌株，與選育得到的米曲霉M01比較大曲的谷氨酰胺酶活力和產(chǎn)谷氨酸能力。結(jié)果表明，選育出的米曲霉M01菌株產(chǎn)谷氨酰胺酶的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他菌株，產(chǎn)谷氨酸和氨基酸態(tài)氮能力也高于其他菌株。

表5 不同菌株理化指標(biāo)對比表

2.4 米曲霉M01菌株在醬油釀造中的應(yīng)用

如表6和表7的結(jié)果所示，米曲霉M01的產(chǎn)孢能力和孢子發(fā)芽能力與對照菌株相當(dāng)，而產(chǎn)中性蛋白酶和酸性蛋白酶能力則有所提高，谷氨酰胺酶活力顯著高于對照菌株，谷氨酰胺酶活力相對提升約60%；采用該菌株釀造的天然油，氨基酸態(tài)氮及原料利用率均有所提高，分別提高約22%和14%，谷氨酸含量也顯著提高，提高約80%。因此，選育獲得的米曲霉M01菌株發(fā)酵生產(chǎn)的原油鮮味更好。

表6 選育菌株釀造大曲谷氨酰胺酶活力及水黃游離谷氨酸表

表7 米曲霉M01和對照菌株的三角瓶種、成曲和發(fā)酵天然油質(zhì)量分析表

2.5 米曲霉M01菌株釀造醬油的感官鑒評

表8感官鑒評結(jié)果顯示，米曲霉M01菌株發(fā)酵的醬油的鮮味、甜味尤為突出，明顯優(yōu)于對照菌株，突出的鮮、甜味對咸味、苦澀味具有一定的掩蓋作用，所以米曲霉M01菌株發(fā)酵的醬油的咸、酸、鮮、甜、苦五味更為調(diào)和，綜合口感也更具有優(yōu)勢。

表8 選育菌株米曲霉M01發(fā)酵醬油感官鑒評結(jié)果表（單位：分）

3 結(jié)論

本文以米曲霉As3.951為出發(fā)菌株，采用ARTP誘變方法對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變獲得突變菌落，交叉使用酪蛋白平板培養(yǎng)基和豆汁平板培養(yǎng)基對突變菌落進(jìn)行篩選，得到米曲霉菌株M01。采用米曲霉M01為主力菌種釀造的原油的谷氨酸含量、氨基酸態(tài)氮含量均有顯著提高，發(fā)酵得到的原油鮮味、甜味突出，無需后期添加鮮味劑來增加醬油鮮味，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義；而且米曲霉M01還提高了原料利用率，提高了醬油的氨基酸含量。