慢性HBV感染者血清持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)免疫耐受機(jī)制的研究進(jìn)展

吳 婕，張英杰，周華君，成 軍（.蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 33000；.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇三醫(yī)院，杭州 3003）

在全球范圍內(nèi)，慢性乙型肝炎感染者約有2.57億人[1]，每年死于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染及其相關(guān)性疾病的約有88.7 萬(wàn)人，我國(guó)屬于HBV 中高度流行區(qū)。乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）作為HBV感染者血清中率先出現(xiàn)的病毒蛋白標(biāo)志物，國(guó)內(nèi)外專家一致認(rèn)為：當(dāng)患者血清HBsAg 完全清除或出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換即為慢性HBV感染理想的治療終點(diǎn)[2]。慢性HBV感染者中存在著一部分血清持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)人群（經(jīng)1年以上隨訪，血清HBsAg 檢測(cè)3 次以上，每次采樣間隔3 個(gè)月以上且檢測(cè)結(jié)果均在10.0 IU/ml 以下，呈持續(xù)低水平表達(dá)的一類慢性HBV感染者），其可能與病毒的清除、變異及隱匿性HBV感染密切相關(guān)。血清低水平的HBsAg 常反映出宿主對(duì)HBV 復(fù)制及細(xì)胞再感染具有較好的免疫抑制能力[3]，然而持續(xù)低水平的HBsAg 可能無(wú)法刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答或低應(yīng)答，長(zhǎng)期的無(wú)應(yīng)答或低應(yīng)答狀態(tài)可能導(dǎo)致宿主針對(duì)持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)形成免疫耐受，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全清除HBV?，F(xiàn)就近年來國(guó)內(nèi)外血清持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)的慢性HBV感染者其免疫耐受機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 低水平HBsAg與免疫耐受

1.1 低水平HBsAg定義 有報(bào)道[4]使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）定義定量檢測(cè)血清HBsAg ＜50.0 IU/ml 為低水平HBsAg，但有研究顯示ELISA 檢測(cè)低水平HBsAg存在漏檢情況[5]。由于檢測(cè)方法、高靈敏度試劑盒的陸續(xù)開發(fā)，關(guān)于低水平HBsAg的定義不斷更新，然而根據(jù)研究?jī)?nèi)容的差異，實(shí)驗(yàn)室對(duì)高水平HBsAg和低水平HBsAg 也有不同的分組標(biāo)準(zhǔn)。如劉立等[6]對(duì)低水平HBsAg 患者的肝臟組織病理變化的研究中，選用HBsAg 在0.05～1 400 IU/ml 為低水平組。熊洪海等[7]對(duì)干擾素聯(lián)合核苷類藥物治療HBV的研究中，定義HBsAg 定量低于4 000 ng/ml 為低水平組。JIN 等[8]在評(píng)估HBsAg/抗-HBs 共存的血清學(xué)模式與慢性HBV感染者肝細(xì)胞癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系中，將血清HBsAg水平＜1 000 IU/ml的樣本視為低水平組。而本實(shí)驗(yàn)室采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的ELISA 定量檢測(cè)血清HBsAg，一般認(rèn)為血清HBsAg 含量＜5.0 ng/ml 或＜10.0 IU/ml 為低水平HBsAg[9]，相較以往研究對(duì)低水平HBsAg 陽(yáng)性的檢出率明顯提高，而低水平HBsAg 檢出是否存在假陽(yáng)性，必要時(shí)可對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1.2 持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)免疫耐受 血清持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)的形成機(jī)制可能與多種因素有關(guān)，如基因突變致使病毒逃避免疫監(jiān)視（S 基因突變[10],Pre-S 基因突變[11],C 基因突變[12]），表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致HBsAg表達(dá)減少（HBV DNA 高度甲基化[13],microRNA 反饋機(jī)制[14],組蛋白低乙?；痆15]），宿主免疫系統(tǒng)功能紊亂形成免疫耐受（免疫因子IL-6,IL-10 等）[16-17]及循環(huán)免疫復(fù)合物（circulating immune complex,CIC）形成[18]等。血清持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)為病毒與宿主清除在多種因素作用下，達(dá)到一種相對(duì)穩(wěn)定而復(fù)雜的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[19]，其中HBV 免疫耐受研究被認(rèn)為是持續(xù)低水平HBsAg 形成的關(guān)鍵因素，已成為持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)形成機(jī)制研究的熱點(diǎn)和HBV 治療突破口。截至目前，臨床上針對(duì)HBV 治療不斷嘗試多種途徑來打破免疫耐受，從而激活免疫應(yīng)答：如聯(lián)合核苷類藥物和干擾素提高HBsAg 轉(zhuǎn)陰率[7]，調(diào)控細(xì)胞因子（IFN-γ,IL-4 等）濃度進(jìn)行非特異性免疫調(diào)節(jié)治療[20]，運(yùn)用抗HBV 治療性疫苗進(jìn)行特異性免疫治療[21]等，但效果卻差強(qiáng)人意。因此，深入研究持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)免疫耐受的形成機(jī)制，將為HBV 臨床治療提供新思路。

2 持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)免疫耐受形成機(jī)制

2.1 病毒自身適應(yīng)性變異與免疫逃逸 HBV 屬嗜肝DNA 病毒科，由于病毒基因組特殊的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA 結(jié)構(gòu)，致使現(xiàn)有的治療策略仍無(wú)法徹底根除HBV[22]，只要有少量DNA 殘留即可作為模板進(jìn)行病毒復(fù)制，極易引起HBV 復(fù)發(fā)。慢性HBV感染者體內(nèi)存在大量的HBV 顆粒和病毒蛋白，病毒蛋白和免疫系統(tǒng)之間能發(fā)生多種相互作用，有研究表明[23]，HBV 通過RNA 中間體完成復(fù)制，其過程易出錯(cuò)，導(dǎo)致迅速產(chǎn)生密切相關(guān)但不完全相同的病毒變異株，包括可以逃脫宿主免疫應(yīng)答和抗病毒治療的病毒變異株。HBsAg 由單個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)編碼，該閱讀框被Pre-S1,Pre-S2和S 區(qū)域中的三個(gè)框內(nèi)起始密碼子分開[24]，張凱等[25]研究發(fā)現(xiàn)Pre-S2 缺失突變使病毒缺失免疫反應(yīng)相關(guān)表位，影響T 細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別，病毒逃避宿主免疫監(jiān)視，使其在體內(nèi)呈現(xiàn)低水平復(fù)制；另外，HBV 變異株的基因組中易發(fā)生大量缺失突變可以進(jìn)一步增加慢性HBV感染的復(fù)雜性，并且HBV 有完整的蛋白質(zhì)外殼及很強(qiáng)的自我保護(hù)能力，一般藥物難以清除，而且HBV 由于免疫逃逸產(chǎn)生變異，當(dāng)藥物持續(xù)作用于特定部位，導(dǎo)致該部位堿基發(fā)生改變，極易產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而使原有針對(duì)HBV 治療的敏感藥物失效。KIRDAR 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，部分接受核苷/核苷酸類似物治療的慢性HBV感染者，HBV pol/S 基因產(chǎn)生耐藥性突變，這種HBV自身適應(yīng)性變異可能使病毒發(fā)生免疫逃逸，形成免疫耐受。

2.2 病毒感染靶細(xì)胞 HBV 主要在肝細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制，如果要徹底抑制HBV 復(fù)制，藥物需進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮作用。肝臟誘導(dǎo)免疫耐受的功能具有獨(dú)特性[27]，呈現(xiàn)持續(xù)性表達(dá)的抗原常會(huì)誘導(dǎo)肝臟針對(duì)該抗原產(chǎn)生局部或全身性的免疫耐受而非免疫應(yīng)答。肝臟的生理結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成等特性為肝臟誘導(dǎo)免疫耐受提供時(shí)間、空間基礎(chǔ)，從而通過誘導(dǎo)T 細(xì)胞克隆清除、克隆無(wú)能、免疫偏離及誘導(dǎo)免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞等多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)性免疫耐受[28-29]，同時(shí)HBV 利用肝臟的免疫耐受環(huán)境，可能導(dǎo)致病毒持續(xù)感染和癌癥快速發(fā)展[30]。也有研究結(jié)果表明適應(yīng)性免疫細(xì)胞在肝臟中比其他器官更易耐受[31]，且適應(yīng)性免疫反應(yīng)與肝耐受性微環(huán)境之間存在關(guān)系[32]。這種具有耐受力的微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致肝臟T 細(xì)胞功能障礙，包括克隆缺失、無(wú)反應(yīng)、衰老、偏離和衰竭[30]。肝臟擁有大量的肝細(xì)胞、非實(shí)質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用有助于在肝臟中誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫耐受[33]。還有報(bào)道[34]稱肝外組織如腎、脾、胰等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HBV DNA，這些部位因無(wú)法引起有效的免疫應(yīng)答，逃避宿主免疫性清除，導(dǎo)致病毒反復(fù)被釋放，形成肝外病毒儲(chǔ)存庫(kù)，反復(fù)感染肝細(xì)胞而致慢性化感染。

2.3 宿主免疫

2.3.1 樹突狀細(xì)胞（DC）介導(dǎo)：DC 作為一種抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells,APC)，能攝取、加工、處理HBsAg，并分泌多種細(xì)胞因子參與慢性HBV感染者免疫耐受和免疫應(yīng)答作用的調(diào)節(jié)[35]。同時(shí)，肝臟中包含不同的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞群，這些細(xì)胞群也可以作為APC，在效應(yīng)T 細(xì)胞啟動(dòng)效率低下時(shí)，傾向于誘導(dǎo)T 細(xì)胞耐受而非T 細(xì)胞活化[36]。有報(bào)道稱血清較高水平HBsAg的慢性HBV感染者外周血中DC 發(fā)育功能障礙，IFN-α,IL-6 等細(xì)胞因子水平均有不同程度的降低[37]，并且有缺陷的DC與CD56-NK 細(xì)胞相互作用可能導(dǎo)致抗病毒免疫反應(yīng)無(wú)效，形成免疫耐受[38]。另外，SHAO 等[39]研究表明細(xì)胞因子IL-35 調(diào)節(jié)慢性HBV感染期間調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(T-reg)和CD8+T 細(xì)胞的功能，這可能有助于免疫耐受和病毒持久性。因此，在慢性HBV感染，DC 功能受損的情況下，低水平HBsAg 乙肝感染者體內(nèi)病毒可能發(fā)生免疫逃逸，DC 無(wú)法成功攝取、加工、處理低水平的HBsAg，致使機(jī)體對(duì)低水平的HBsAg 無(wú)法產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，形成免疫耐受[40]。

2.3.2 T/B 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)：慢性HBV感染與T 細(xì)胞耗竭有關(guān)[41]，表現(xiàn)為共抑制性受體的持續(xù)表達(dá)和細(xì)胞因子產(chǎn)生受損，如程序性死亡受體-1（PD-1），自然殺傷細(xì)胞受體2B4(CD244)，細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4），T 細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白-3（TIM-3），細(xì)胞因子CD160 等，血清高水平的HBsAg 可以誘導(dǎo)共抑制性受體上調(diào)，多種共抑制性受體的持續(xù)表達(dá)維持T 細(xì)胞的功能性衰竭。DOLINA 等[42]人發(fā)現(xiàn)，在慢性HBV感染中，通過高遷移率家族蛋白-1（HMGB-1）識(shí)別操作的病毒特異性TIM-3+和CD8+T 細(xì)胞可能會(huì)抑制肝臟微環(huán)境中的T 細(xì)胞反應(yīng)，繼而促進(jìn)HBV 持續(xù)感染。同時(shí)，T-reg 作為CD4+T 細(xì)胞的特殊亞群，在HBV感染宿主時(shí)，通過分泌多種效應(yīng)分子如IL-10,TGF-β 等，直接或間接抑制T 細(xì)胞反應(yīng)，從而維持免疫耐受[43]。然而，有研究顯示血清低水平HBsAg 患者較血清高水平HBsAg 患者而言，雖然CD4+T 細(xì)胞上能觀察到較低的PD-1表達(dá)，但同時(shí)報(bào)道又指出CD4+T 細(xì)胞上的2B4表達(dá)沒有明顯差異[44]。所以，低水平HBsAg的慢性HBV感染者呈現(xiàn)非活動(dòng)性HBsAg 攜帶狀態(tài)，雖然機(jī)體內(nèi)部分共抑制性受體較低，但T 細(xì)胞耗竭可能仍然存在，導(dǎo)致T 細(xì)胞功能未完全恢復(fù)，對(duì)低水平HBsAg 不能執(zhí)行正常應(yīng)答，形成免疫耐受，從而無(wú)法完全清除HBV。還有報(bào)道[40]指出當(dāng)大量病毒感染宿主時(shí)，如果T 細(xì)胞應(yīng)答不是非常強(qiáng)烈，那么，即使宿主產(chǎn)生抗病毒細(xì)胞因子，細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞也不能完全滅活HBV，最終仍會(huì)導(dǎo)致病毒呈現(xiàn)持續(xù)感染狀態(tài)。也就是說，在T 細(xì)胞應(yīng)答不全的情況下，低水平HBsAg 可能會(huì)逃脫免疫監(jiān)視，致使宿主仍然存在較弱的病毒基因表達(dá)，從而HBV 不能被完全清除。另外，與功能障礙和衰竭相關(guān)的B 細(xì)胞也表達(dá)一系列共抑制性受體，包括Fc 受體樣4（FcRL4）,PD-1和PD-L1 等，且血清低水平HBsAg 組和血清高水平HBsAg 組表達(dá)的受體無(wú)明顯差異，這也可以說明低水平HBsAg乙肝感染者B細(xì)胞功能受損，可能形成免疫耐受[44]。所以，綜上所述，低水平的HBsAg 可能誘導(dǎo)宿主T,B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生完全或不完全的免疫耐受[45]。

2.3.3 單核細(xì)胞/NK 細(xì)胞介導(dǎo)：NK 細(xì)胞和單核細(xì)胞介導(dǎo)的宿主免疫是先天免疫應(yīng)答過程中的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)血清高水平HBsAg 慢性HBV感染者NK細(xì)胞功能缺陷，呈現(xiàn)失活狀態(tài)[46]。LI等[47]人觀察到HBV 可通過多種信號(hào)通路利用HBsAg 誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制性單核細(xì)胞，這些抑制性單核細(xì)胞表達(dá)的人類白細(xì)胞抗原-E（HLA-E）和PD-L1 能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)NK 細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，這樣的NK 細(xì)胞能夠抑制宿主自身CD4+和CD8+T 細(xì)胞活化，并且HBV 也能通過單核細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性NK 細(xì)胞（NKreg）下調(diào)T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)，同時(shí)有報(bào)道證實(shí)慢性HBV感染者的NK 細(xì)胞可介導(dǎo)免疫耐受或免疫損傷[48]。還有一些研究表明[49-50]：HBsAg 可通過干擾單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中的Toll 樣受體（toll-like receptors,TLR）信號(hào)途徑來抑制細(xì)胞因子的釋放，這可能有助于建立慢性感染。然而，KIM 等[44]人研究顯示血清低水平HBsAg 組和血清高水平HBsAg 組中單核細(xì)胞、NK 細(xì)胞等免疫細(xì)胞的組成無(wú)明顯差異，所以，低水平HBsAg 乙肝感染者由于長(zhǎng)期的HBV感染可能也會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞、NK 細(xì)胞功能缺陷，同時(shí)血清HBsAg 濃度較低，可能誘使單核細(xì)胞及NK 細(xì)胞正常的識(shí)別、殺傷作用受限，從而無(wú)法有效釋放抗病毒性的炎性因子及徹底抑制HBV。

2.4 年齡等其他因素 已有研究發(fā)現(xiàn)[51]：低水平HBsAg的HBV感染者年齡相對(duì)較高(＞50 歲)，持續(xù)低水平的HBsAg表達(dá)可能與非活動(dòng)性的HBV 攜帶者狀態(tài)有關(guān)，并隨著年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生。YUEN等[52]也表明HBV 變異與年齡增加及HBsAg水平降低有關(guān)，HBV 多樣性的增加可能導(dǎo)致病毒逃避免疫監(jiān)視，形成免疫耐受。此外，ALLAIN 等[53]人研究表明低收入和中等收入國(guó)家，由于在資源獲取方面落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，HBV的檢測(cè)及診斷技術(shù)受限，導(dǎo)致數(shù)十年由于醫(yī)療缺乏形成免疫耐受；雖然目前實(shí)施HBV 疫苗已降低了HBV的發(fā)病率，但仍會(huì)導(dǎo)致該地區(qū)HBV的垂直傳播，所以，這些地區(qū)慢性HBV感染者的低水平HBsAg表達(dá)可能更易形成免疫耐受。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，慢性HBV感染者持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)免疫耐受形成的原因多樣，可能是在病毒自身適應(yīng)性變異與免疫逃逸、病毒感染靶細(xì)胞、宿主免疫及其他多種因素作用下，導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法完全清除低水平HBsAg。目前，有關(guān)如何打破慢性HBV感染者持續(xù)低水平HBsAg表達(dá)免疫耐受狀態(tài)的研究報(bào)道甚少，但隨著HBV 診療技術(shù)不斷發(fā)展，低水平HBsAg 人群愈來愈引起肝病學(xué)、傳染病學(xué)及流行病學(xué)等領(lǐng)域?qū)＜业年P(guān)注。因此，通過研究低水平HBsAg 免疫耐受形成的機(jī)制，將為臨床治療中打破其免疫耐受狀態(tài)奠定基礎(chǔ)，從而為實(shí)現(xiàn)徹底清除HBV 拓展新思路。