下瘀血湯對(duì)肝癌細(xì)胞生物活性及Nanog信號(hào)通路表達(dá)的影響

莫國(guó)臻 黃關(guān)璇 石宇昕 吳秀芹 曹傳輝

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院,廣州,510280)

肝癌是一種發(fā)生在肝臟的惡性腫瘤,其發(fā)病率較高,致死人數(shù)較多。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明,世界上每年約60萬(wàn)人患肝癌,在我國(guó),患有肝癌的人數(shù)占全世界的50%之多[1-2]。早期肝癌患者無(wú)明顯的癥狀,患者在檢查時(shí)多為中晚期,因此導(dǎo)致肝癌晚期患者在5年內(nèi)的生存率僅有5%[3-4]。對(duì)于癌癥的治療,我國(guó)目前主要以手術(shù)以及化療為主,但化療的耐藥性較強(qiáng),使得患者在的預(yù)后達(dá)不到理想目標(biāo)。近年來(lái),中藥在臨床上對(duì)于治療肝癌具有一定的優(yōu)勢(shì),中藥中下瘀血湯最早用于婦女產(chǎn)后瘀血等,根據(jù)近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),下瘀血湯可抗肝纖維化、防治肝硬化[5-6]。下瘀血湯由生大黃、桃仁、土鱉蟲(chóng)等多為中藥組成,周岱翰教授運(yùn)用下瘀血湯治療肝癌積累了豐富經(jīng)驗(yàn)[7]。Nanog(胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子)是一種與干細(xì)胞特性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,近年來(lái)研究表明,癌細(xì)胞中的干細(xì)胞樣特性(為高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因特征)與腫瘤的惡性發(fā)展及預(yù)后聯(lián)系密切,因此Nanog在腫瘤中的作用引起了醫(yī)學(xué)界的重視[8-9]。至今,在前列腺癌等多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)Nanog的表達(dá)異常,在肺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤的過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)Nanog的異常表達(dá)[10-11],但對(duì)于癌細(xì)胞活性的具體作用機(jī)制目前為止尚不明確,因此本研究探討下瘀血湯對(duì)肝癌細(xì)胞的作用及對(duì)Nanog的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取10只6～8周齡健康SD大鼠,雄性,體質(zhì)量(0.12±0.02)kg,購(gòu)自上海西唐生物公司(動(dòng)物合格證號(hào):粵檢證字第95A08號(hào))。常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食飲水,飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人肝癌細(xì)胞HepG2來(lái)自廣州吉妮歐公司,置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h,待細(xì)胞完全貼壁后,更換培養(yǎng)液(10%胎牛血清杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)),待細(xì)胞融合度到80%～90%時(shí),傳代,吸棄培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)沖洗3次,胰蛋白酶(0.25%)消化,完全培養(yǎng)基中斷。將剩余貼壁細(xì)胞吹打脫落,收集細(xì)胞懸液至離心管中(15 mL)離心5 min,離心半徑8 cm,1 500 r/min。去上清液,重懸,按1∶3比例接種到新的培養(yǎng)瓶,做好標(biāo)記,繼續(xù)培養(yǎng)。取3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本研究已通過(guò)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):2017-074)。

1.1.2 藥物 下瘀血湯:生大黃(四川商宇藥業(yè)公司，批號(hào):074180801),桃仁(上海哈靈公司，批號(hào):120953-200705),土鱉蟲(chóng)(廣東三藍(lán)公司，批號(hào):Z19991101),由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院中藥制劑室煎制,濃度為每毫升含生藥量0.4 g。

1.1.3 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液(上海吉諾生物公司,貨號(hào):CM0104),胎牛血清(杭州沃豐生物公司,貨號(hào):SFBE),酶標(biāo)儀(上海閃譜科技公司,型號(hào):ReadMax 1900),流式細(xì)胞儀(賽默飛世爾科技生命科學(xué)產(chǎn)品，型號(hào)：Attune NxT)，胰蛋白酶(上海實(shí)維儀器技術(shù)公司,型號(hào):9002-07-7)。

1.2 方法

1.2.1 分組與含藥血清制備 將培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞HepG2采用數(shù)字隨機(jī)法分為空白血清組、低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清組、高劑量含藥血清組。10只大鼠采用數(shù)字隨機(jī)法分為正常組及下瘀血湯湯組,常規(guī)喂養(yǎng),下瘀血湯組灌服(22.15 g/kg)水煎濃縮液,正常組給予同等劑量蒸餾水灌胃,2次/d,共干預(yù)1周,最后一次灌胃2 h后,正常組及下瘀血湯組大鼠均戊巴比妥麻醉(3%),心臟取血,分離血清,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 下瘀血湯干預(yù)方法 空白血清組:正常細(xì)胞在150 μL 10%大鼠空白血清培養(yǎng)基+13.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基;低劑量含藥血清組:正常細(xì)胞在75 μL 2.5%大鼠下瘀血湯含藥血清+75 μL 7.5%大鼠空白血清培養(yǎng)基+13.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基;中劑量含藥血清組:正常細(xì)胞在75 μL 5%大鼠下瘀血湯含藥血清+75 μL 5%大鼠空白血清培養(yǎng)基+13.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基;高劑量含藥血清組:正常細(xì)胞在150 μL 10%大鼠下瘀血湯含藥血清+13.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 MTT檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞活性 將各組癌細(xì)胞(3×103個(gè)/孔)接種到96孔板中,貼壁后饑餓24 h,待細(xì)胞的密度培養(yǎng)到50%時(shí),更換培養(yǎng)基,加入MTT于37.5 ℃,5%CO2下培養(yǎng),4 h后離棄上清液,加入DMSO,采用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度OD值。

1.2.3.2 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)各組Nanog的表達(dá) 用Trizol裂解各組HepG2細(xì)胞,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄,將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增條件為,94 ℃預(yù)變性5 min后,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35 cycle,72 ℃延長(zhǎng)10 min,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，G3PDH)為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bcl-2、胱天蛋白酶-3的表達(dá) 將HepG2細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行裂解并提取核蛋白,并對(duì)核蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)量,分裝后,保存在零下20 ℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進(jìn)行混均,按照4∶1的比例進(jìn)行電泳。后將蛋白樣品(50 μm)轉(zhuǎn)移聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,脫脂奶粉封閉1 h。加入1抗按1∶100稀釋后孵育過(guò)夜,TTBS漂洗3次,10 min/次,最后加入2抗對(duì)溶液稀釋,常溫封閉。取出PVDF膜,漂洗1次/隔10 min,共3次,二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色后照相,后計(jì)算其蛋白表達(dá)含量。

1.2.3.4 流失細(xì)胞儀檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞的凋亡情況 收集細(xì)胞(2×105/孔)接種于6孔板中,胰蛋白酶消化,完全培養(yǎng)基終止;PBS清洗,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，1 250 r/min,離心半徑8 cm,離心6 min,棄上清,混入500 μL Binding Buffer(結(jié)合緩沖液)重懸。加入5 μL Annexin V-FITC混勻、10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混勻,室溫避光孵育5～15 min,隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3.5 Transwell法檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞的侵襲力 各組MCF-7細(xì)胞接種與6孔板中,將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層,37 ℃下呈凝膠狀態(tài),細(xì)胞數(shù)目為1×105/mL，上室中加入細(xì)胞懸液,下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基,37.5 ℃,培養(yǎng)2 d,取出培養(yǎng)基,拭去殘留細(xì)胞,現(xiàn)配結(jié)晶紫,每孔500 μL,將小室放入,25 ℃染色30 min,PBS清洗1次,晾干。顯微鏡觀察每個(gè)樣本連續(xù)選5清晰視野進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì),然后計(jì)算器平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞活性比較 4組肝癌細(xì)胞OD值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均有所增加,空白血清組與低劑量含藥血清組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性均較為接近(P>0.05)空白血清組在24 h、48 h、72 h時(shí)OD值均高于中劑量、高劑量含藥血清組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清組、高劑量含藥血清組任意2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)肝癌細(xì)胞活性比較

2.2 肝癌細(xì)胞中Nanog mRNA的表達(dá)結(jié)果比較 空白血清組肝癌細(xì)胞中Nanog mRNA的水平高于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清組、高劑量含藥血清組任意2組肝癌細(xì)胞中Nanog mRNA的水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組Nanog mRNA水平比較

2.3 肝癌細(xì)胞中Bcl-2、胱天蛋白酶-3蛋白表達(dá)結(jié)果比較 空白血清組肝癌細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平高于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組(P<0.01),胱天蛋白酶-3的蛋白表達(dá)水平低于低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組(P<0.01);低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組3組肝癌細(xì)胞中Bcl-2、胱天蛋白酶-3蛋白任意2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)圖1、表4。

表4 各組Bcl-2、胱天蛋白酶-3水平比較

2.4 肝癌細(xì)胞凋亡率比較 空白組肝癌細(xì)胞凋亡最少，隨著藥物劑量的增加肝癌細(xì)胞凋亡增加，Q2與Q4相加顯示肝癌細(xì)胞凋亡數(shù)量。見(jiàn)圖2?？瞻籽褰M肝癌細(xì)胞凋亡率與低劑量含藥血清組比較明顯降低(P<0.01),中劑量含藥血清組肝癌細(xì)胞凋亡率高于低劑量含藥血清組(P<0.01),與中劑量含藥血清組比較,高劑量含藥血清組肝癌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.5 肝癌細(xì)胞侵襲能力比較 空白血清組肝癌細(xì)胞的侵襲數(shù)量高于低劑量含藥血清組(P<0.01),中劑量含藥血清組肝癌細(xì)胞的侵襲數(shù)量低于低劑量含藥血清組(P<0.01),高劑量含藥血清組肝癌細(xì)胞的侵襲數(shù)量最少,顯著低于其他3組(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表6。

表6 各組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)誘發(fā)肝癌因素有多種,如病毒性肝炎、酒精性肝病等,患有乙肝、肝硬化患者肝癌發(fā)病率較高[12]。肝癌干細(xì)胞是肝癌的起始細(xì)胞,是一種具有很強(qiáng)的增殖分化能力的細(xì)胞,目前Nanog是肝癌干細(xì)胞的標(biāo)志物,其對(duì)于干細(xì)胞的增殖分化等具有一定的調(diào)控作用[13],有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),肝癌干細(xì)胞的增殖分化越強(qiáng)時(shí),Nanog的表達(dá)水平越高,但目前為止未發(fā)現(xiàn)有何中藥物可調(diào)控其的表達(dá),本研究探討藥物對(duì)Nanog的影響以及對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。

下瘀血湯中大黃具有清瘀熱、活血化瘀等作用,其性寒,藥性沉穩(wěn);桃仁具有去除瘀血的功效,善于破除血滯[14];下瘀血湯中大黃的有效成分大黃素根據(jù)多種研究證實(shí)可阻礙多種腫瘤細(xì)胞的分化及增殖。根據(jù)相關(guān)研究表明,下瘀血湯中的桃仁可抗血栓、抗腫瘤等作用;土鱉蟲(chóng)可破血逐瘀消積,具有促進(jìn)胃癌等癌細(xì)胞凋亡等作用。在耿燕楠[15]研究下瘀血湯對(duì)胃癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中表明,其可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡并抑制其生長(zhǎng)。根據(jù)張浩等[16]研究發(fā)現(xiàn),下瘀血湯通過(guò)下調(diào)核仁紡錘相關(guān)蛋白1(Nucleolar Spindle-associated Protein 1,Nusap1)的表達(dá)進(jìn)而阻礙肝癌細(xì)胞的增殖,同時(shí)又促使肝癌細(xì)胞凋亡加速。本研究的結(jié)果與上述研究結(jié)果相似。

肝癌干細(xì)胞具有自我復(fù)制、多項(xiàng)分化及自我增殖的功能,在體外特定條件下培養(yǎng)可抑制其分化,Nanog可通過(guò)結(jié)合靶基因調(diào)控區(qū),可有效地抑制其分化基因的表達(dá)[17]。Nanog在肝癌細(xì)胞中水平升高是由于Nanog具有自我分化分能力,在受到刺激后表達(dá)增高可影響癌細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程,使其分化增加,導(dǎo)致癌癥惡化。曾金敏等[18]研究Nanog對(duì)膀胱癌作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn),Nanog被沉默后基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)降低,且侵入到襯墊膜外側(cè)的T24細(xì)胞減少,其癌細(xì)胞侵襲力降低。楊曉文等[19]對(duì)肝癌細(xì)胞的研究中提出,下調(diào)Nanog的水平,可抑制癌細(xì)胞的增殖。本研究與上述研究結(jié)果相似,因此本研究認(rèn)為,下瘀血湯可能是通過(guò)下調(diào)Nanog水平減少癌細(xì)胞的活性。

Bcl-2(B細(xì)胞淋巴瘤-2)是凋亡抑制的標(biāo)志物,可聚集機(jī)體內(nèi)突變的物質(zhì),促使癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展,Bcl-2可通過(guò)P27來(lái)抑制細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換,具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[20]。劉曉宇和張紅[21]研究半邊蓮煎劑對(duì)肝癌的作用及對(duì)肝癌中P27及Bcl-2的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),半邊蓮煎劑可以抑制肝癌的發(fā)展,其作用機(jī)制可能與半邊蓮抑制劑減弱了Bcl-2的表達(dá)、提高了P27的表達(dá)有關(guān)。大黃是下瘀血湯中的一味中藥材。孫瑋[22]研究乳腺癌的研究中提出,大黃可降低Bcl-2的水平,促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。

胱天蛋白酶-3是由多腺苷二磷酸核糖聚合酶及APD-核糖組成細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白酶,是一種凋亡信號(hào)蛋白,對(duì)于細(xì)胞凋亡凋亡有正向促進(jìn)作用,當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí),多腺苷二磷酸核糖聚合酶的聯(lián)系被切斷,使鋅指結(jié)構(gòu)與催化區(qū)域分離,導(dǎo)致功能發(fā)揮異常,加劇凋亡[23]。孫媛和李青山[24]等通過(guò)沙利度胺聯(lián)合葉酸、氟尿嘧啶、奧沙利鉑(Folinic Acid Fluorouracil Oxaliplatin,FOLFOX)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn),其作用機(jī)制與激活胱天蛋白酶-3信號(hào)通路有關(guān)。根據(jù)耿燕楠[15]的研究表明,下瘀血湯對(duì)于胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究發(fā)現(xiàn),下瘀血湯對(duì)胃癌裸鼠異種移植瘤的抑制率為36.5%,其機(jī)制與調(diào)控胱天蛋白酶-3、Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān),這與本研究結(jié)果相似,說(shuō)明下瘀血湯促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡可能與下調(diào)Bcl-2、提高胱天蛋白酶-3的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,下瘀血湯通可抑制肝癌細(xì)胞的活性及其侵襲能力、促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡,其作用機(jī)制可能調(diào)控與Nanog信號(hào)通路,從而促進(jìn)胱天蛋白酶-3的表達(dá)、抑制Bcl-2水平有關(guān)。