大豆脂肪氧合酶的粗提取及其強(qiáng)化乳香風(fēng)味的研究

高雨婷，錢建瑛，史勁松，閆建國(guó)，許正宏*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(寧夏塞尚乳業(yè)有限公司，寧夏 銀川，750001)

奶業(yè)是健康中國(guó)、強(qiáng)壯民族不可或缺的產(chǎn)業(yè)，牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)全面且易于人體吸收[1]。乳制品的風(fēng)味是影響其質(zhì)量的重要因素[2-3]，乳脂肪對(duì)奶制品的風(fēng)味形成具有重大作用[4]，但隨著消費(fèi)者對(duì)健康意識(shí)的提高，更傾向于購(gòu)買低脂或脫脂乳制品，降低攝入過(guò)多乳脂肪帶來(lái)的健康風(fēng)險(xiǎn)[5]。但脫脂乳存在口感不濃厚，風(fēng)味不突出等缺點(diǎn)。因此，迫切需求采取新的加工技術(shù)來(lái)強(qiáng)化乳香風(fēng)味的形成，獲得風(fēng)味濃郁、可用于調(diào)配使用的天然風(fēng)味乳脂基料，既滿足消費(fèi)者的感官享受，又滿足了其對(duì)健康的需求。

利用酶解法酶解奶油獲得風(fēng)味成分增強(qiáng)的奶香基底是目前的研究熱點(diǎn)，酶可將乳脂肪分解成為脂肪酸、甲基酮及內(nèi)酯類物質(zhì)[6]，將其調(diào)配到不同的乳制品中，可提升乳制品的獨(dú)特風(fēng)味。目前的研究集中于利用脂肪酶對(duì)黃油、淡奶油等底物進(jìn)行酶解，但酶解過(guò)后產(chǎn)物具有令人不適的酸味，需要后期進(jìn)行調(diào)配。

脂肪氧合酶 (lipoxygenase，LOX)是一種含非血紅素鐵的加氧酶，專一催化具有順，順-1，4戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸及其相應(yīng)的脂，形成具有共軛雙鍵的脂氫過(guò)氧化物，再經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的反應(yīng)生成各種揮發(fā)性的脂類物質(zhì)。LOX的活性部位含有鐵離子，酶促反應(yīng)時(shí)，首先氫原子從底物上離開(kāi)，同時(shí)鐵離子被還原。第二步為分子氧與底物自由基反應(yīng)，形成過(guò)氧化自由基；最后，過(guò)氧化自由基被LOX的鐵所還原，生成氫過(guò)氧化合物，而LOX的鐵轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3+。含有順，順-1，4戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸、脂肪酸酯都可以作為L(zhǎng)OX的底物。植物中其天然底物主要是亞油酸和亞麻酸，動(dòng)物體內(nèi)其天然底物主要是花生四烯酸。LOX的來(lái)源不同或者底物不同，都會(huì)導(dǎo)致其加氧的位置不同，形成的底物也就有所差異。目前已研究發(fā)現(xiàn)2種大豆脂肪氧合酶同工酶LOX-1和LOX-2。LOX-1的底物為不飽和脂肪酸，生成13-氫過(guò)氧化物；LOX-2的底物為酯化底物，生成9-氫過(guò)氧化物或3-氫過(guò)氧化物[7]。

張嬋等[8]利用LOX處理香菇，1-辛烯-3-醇、3-辛酮等特征風(fēng)味物質(zhì)含量顯著增加，得到了香菇風(fēng)味增強(qiáng)的濃縮液。LOX也可與過(guò)氧化氫酶等協(xié)同作用，增強(qiáng)水果和蔬菜的自然香氣，例如黃瓜風(fēng)味中的風(fēng)味化合物2-反式己烯醛和2-反式-6-順式壬二烯醛，就是亞麻酸的酶促氧化分解產(chǎn)物[9]。KERLER 等[10]利用LOX催化水解后的紅花油和亞麻籽油合成氫過(guò)氧化物，氫過(guò)氧化物經(jīng)氫過(guò)氧化物裂解酶裂解產(chǎn)生己醛，總產(chǎn)率為50%。LOX催化生成的氫過(guò)氧化物分解后會(huì)產(chǎn)生六碳醇與醛，其具有青草芬芳的自然風(fēng)味，會(huì)給人帶來(lái)一種食品新鮮的感覺(jué)[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用LOX粗酶對(duì)底物黃油進(jìn)行酶解，探究LOX對(duì)強(qiáng)化乳香風(fēng)味成分效果的影響，獲得風(fēng)味濃郁的天然、安全乳脂基料，同時(shí)進(jìn)一步拓寬大豆LOX的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安佳原味黃油，恒天然商貿(mào)有限公司；黃大豆，上海裕田農(nóng)業(yè)科技有限公司；吐溫-20、硼酸、NaOH、亞油酸、冰醋酸、甲醇、二甲基亞砜，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，艾卡儀器設(shè)備有限公司；水浴鍋，太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；GC-MS-QP 2010 Ultra，日本島津；紫外分光光度計(jì)，翱藝儀器(上海)有限公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆LOX粗提取

大豆經(jīng)攪拌器打碎，用40目標(biāo)準(zhǔn)篩去皮。稱取10 g豆粉，分別加入50、100、150 mL冰水[料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15，(g∶mL)]攪拌浸提0.5、1、2、3 h后，于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，上清液即為大豆LOX粗酶液。

1.3.2 酶活力的測(cè)定

將0.25 mL吐溫-20分散于10 mL 0.2 mol/L pH 9.0硼酸鹽緩沖液，搖動(dòng)、逐滴加入0.27 mL亞油酸，充分混合，加入1.0 mL 1 mol/L NaOH溶液至澄清，調(diào)pH至9.0，緩沖液稀釋至500 mL作為底物液。

取0.1 mL粗酶液移入0.2 mL底物和2.7 mL緩沖液中，混勻，25 ℃水浴3 min后，于100 ℃水浴5 min終止反應(yīng)，于234 nm測(cè)吸光度；空白對(duì)照為0.1 mL滅活酶、0.2 mL底物和2.7 mL緩沖液于25 ℃水浴3 min。

酶活力定義為：25 ℃、pH 9.0，以亞油酸為底物的3 mL反應(yīng)體系，于234 nm處每分鐘增加0.001吸光度值定義為1個(gè)酶活力單位[12]。

1.3.3 粗酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.3.3.1 溫度對(duì)酶活力的影響

改變1.3.2中酶活力測(cè)定時(shí)的水浴溫度，測(cè)定LOX粗酶在不同反應(yīng)溫度(20～60 ℃)下的酶活力。

1.3.3.2 pH對(duì)酶活力的影響

改變1.3.2中酶活力測(cè)定時(shí)反應(yīng)體系的pH值，分別用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3～5)、硼酸-硼酸鈉(pH 6～11)緩沖液，測(cè)定LOX粗酶在不同pH下的酶活力。

1.3.3.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

在底物中分別添加終濃度為0.1和1 mol/L的一價(jià)金屬離子(Na+、K+)、二價(jià)金屬離子(Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+)，測(cè)定添加金屬離子后LOX粗酶的酶活力，以未添加金屬離子的酶活力為100%。

1.3.3.4 底物促溶劑對(duì)酶活力的影響

在緩沖液中分別添加體積分?jǐn)?shù)為2%和6%的甲醇、二甲基亞砜促進(jìn)底物在緩沖液內(nèi)分散，測(cè)定添加底物促溶劑后LOX粗酶的酶活力，以未添加促溶劑的酶活力為100%。

1.3.4 LOX酶解對(duì)風(fēng)味的影響

取50 mL黃油加入LOX粗酶5 mL，磁力攪拌混勻，40 ℃反應(yīng)1 h后，90 ℃水浴10 min滅酶，于室溫下6 000 r/min離心10 min，取上層油相為產(chǎn)物進(jìn)行揮發(fā)性成分分析和感官評(píng)價(jià)。

1.3.5 酶解溫度對(duì)風(fēng)味的影響

取50 mL黃油加入LOX粗酶5 mL，磁力攪拌混勻，分別于35、40、45和50 ℃反應(yīng)1 h后，90 ℃水浴10 min滅酶，于室溫下6 000 r/min離心10 min，取上層油相為產(chǎn)物進(jìn)行揮發(fā)性成分分析和感官評(píng)價(jià)。

1.3.6 酶解時(shí)間對(duì)風(fēng)味的影響

取50 mL黃油加入LOX粗酶5 mL，磁力攪拌混勻，分別于40 ℃反應(yīng)1、2、3 h后，90 ℃水浴10 min滅酶，于室溫下6 000 r/min離心10 min，取上層油相為產(chǎn)物進(jìn)行揮發(fā)性成分分析和感官評(píng)價(jià)。

1.3.7 揮發(fā)性成分分析

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法，取5 mL樣品，加入10 μL 50 mg/L 4-甲基-2-戊酮作為內(nèi)標(biāo)，置于20 mL頂空瓶中，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

GC-MS的分析條件：采用DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為He，流速1.6 mL/min。色譜柱起始柱溫50 ℃(保持1 min)，以8 ℃/min升到230 ℃保持5 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件為電子轟擊離子源，離子源溫度200 ℃，檢測(cè)電壓1 000 V，界面溫度250 ℃，發(fā)射電流100 mA，電子能量70 eV。

1.3.8 感官評(píng)價(jià)

由10名人員組成感官評(píng)價(jià)小組，根據(jù)各自的喜好對(duì)酶解產(chǎn)物的香氣進(jìn)行奶香味、持續(xù)感、醇厚味、異味、整體接受性5個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，滿分10分，具體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 香氣評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

2 結(jié)果與分析

2.1 LOX粗酶提取條件的優(yōu)化

料液比對(duì)LOX粗酶酶活力的影響如圖1-a所示，料液比增加，酶活力呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，最佳料液比為1∶10(g∶mL)。提取時(shí)間對(duì)LOX粗酶酶活力的影響如圖1-b所示，隨著提取時(shí)間增加，酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，最佳提取時(shí)間為1 h，可能是由于在提取前期，提取時(shí)間越長(zhǎng)，酶的溶出量越多，但隨著時(shí)間不斷增加，細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)混入提取液，影響了酶的溶出以及活力[13]。

a-料液比；b-提取時(shí)間圖1 料液比和提取時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effects of liquid ratio and extraction time on enzyme activity

2.2 LOX粗酶的酶學(xué)特性

對(duì)不同溫度下LOX的酶活力進(jìn)行分析，測(cè)得酶活力如圖2-a所示，低溫下LOX粗酶的酶活能保持較高水平，溫度在30～40 ℃時(shí)酶活較為穩(wěn)定，溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大，溫度繼續(xù)升高，酶活力下降明顯，可能是由于溫度高導(dǎo)致LOX部分失活。

考察pH對(duì)酶活力的影響，測(cè)定不同pH下LOX的酶活力如圖2-b所示。酶活力呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH達(dá)到7時(shí)酶活力達(dá)到最大。大豆LOX具有較寬的pH穩(wěn)定范圍，在本實(shí)驗(yàn)中，pH<6時(shí)酶活力出現(xiàn)下降，但仍具有活力，部分原因是其底物亞油酸在pH<7時(shí)溶解性較差，導(dǎo)致酶活力降低[14]。

研究金屬離子對(duì)酶活力的影響，結(jié)果如圖2-c所示。0.1 mol/L的Na+、K+、Mg2+對(duì)酶活力有激活作用，1.0 mol/L的K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+對(duì)酶活力有明顯的抑制作用。有些金屬離子會(huì)在酶與底物之間形成一種酶-金屬離子-底物的三元復(fù)合物，有利于底物與酶的活性中心結(jié)合[15]，從而對(duì)酶活力有提高的作用。

底物的溶解度可以影響酶和底物結(jié)合，研究促溶劑對(duì)酶活力的影響，結(jié)果如圖2-d所示。添加體積分?jǐn)?shù)為2%的甲醇、二甲基亞砜對(duì)酶活力有提升作用，原因可能是促進(jìn)了底物的溶解[16]。體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，酶活力受到了抑制，可能是高濃度的有機(jī)溶劑使部分酶失活所致。

2.3 LOX酶解對(duì)風(fēng)味的影響

實(shí)驗(yàn)前期對(duì)黃油的風(fēng)味進(jìn)行了分析，共檢測(cè)出40種主要揮發(fā)性成分(表2)，其中對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的是酸類物質(zhì)，如己酸、辛酸、正癸酸等這些飽和脂肪酸[17]，它們是構(gòu)成乳香的重要成分。醛類化合物的含量雖然不高，但風(fēng)味閾值較低，因而在奶香味形成中起著重要的作用[18]，如2, 4-壬二烯醛、壬醛等，具有加熱奶油的風(fēng)味。

a-溫度；b-pH；c-離子種類；d-促溶劑種類圖2 不同條件對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effects of temperature, pH, metal ions and additive agents on enzyme activity

利用LOX粗酶酶解黃油后，主要揮發(fā)性成分增加到48種，飽和脂肪酸含量增加，尤其是己酸、辛酸、丁酸含量明顯增加；醛類物質(zhì)含量略有降低；酮類物質(zhì)含量顯著增加，如2-壬酮，并且產(chǎn)生了2-庚酮，這些酮類物質(zhì)的前體來(lái)源于乳脂肪中的脂肪酸，在LOX的作用下經(jīng)過(guò)一系列的氧化分解而形成。酮類物質(zhì)尤其是甲基酮類多被描述為清新的奶油香氣，并且具有較高的香氣強(qiáng)度，是形成乳制品風(fēng)味的重要組成成分[19]；另外，酶解后δ-癸內(nèi)酯、丁位己內(nèi)酯等酯類化合物含量顯著增加，酯類雖然含量不高，但對(duì)乳中奶香的形成貢獻(xiàn)也很大[20]。其中內(nèi)酯類物質(zhì)多被描述為奶香柔軟、綿長(zhǎng)的感覺(jué)；一些脂肪酸乙酯類具有水果的甜香味，可以緩和酸類所帶來(lái)的刺激性味道，使奶香更加協(xié)調(diào)、柔和。

表2 黃油酶解前后主要揮發(fā)性成分及含量Table 2 Compositions and contents of main volatile components of butter before and after enzymatic hydrolysis

續(xù)表2

2.4 酶解溫度對(duì)風(fēng)味的影響

酶解產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分隨著酶解溫度的升高而發(fā)生改變。不同酶解溫度下酸類、醛類、酮類、酯類物質(zhì)含量如圖3-a和圖4所示。在35～50 ℃時(shí)，隨著酶解溫度的升高，酸類化合物含量明顯增加；醛類、酮類、酯類物質(zhì)的變化范圍相對(duì)不明顯。在高溫下，可能會(huì)發(fā)生如乳脂的氧化、乳蛋白的變性以及乳糖和氨基酸之間的美拉德反應(yīng)等一系列副反應(yīng)[21]。另外溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致一些成分揮發(fā)，并且酸類物質(zhì)含量過(guò)高會(huì)產(chǎn)生酸敗氣味。不同酶解溫度下產(chǎn)物的感官評(píng)分如圖5所示，酶解溫度為40 ℃時(shí)感官評(píng)價(jià)較好，因此認(rèn)為40 ℃是LOX酶解黃油強(qiáng)化風(fēng)味的適宜溫度。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)風(fēng)味的影響

不同酶解時(shí)間下?lián)]發(fā)性成分的含量如圖3-b和圖4所示，感官評(píng)分如圖5所示。酶解產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分的總量在1～3 h不斷增加，其中酸類物質(zhì)含量增加明顯，醛類、酮類、酯類物質(zhì)的變化范圍相對(duì)不明顯。酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致酶解體系酸含量過(guò)高，產(chǎn)生酸敗風(fēng)味，1 h時(shí)感官評(píng)價(jià)較好，因此認(rèn)為1 h是LOX酶解黃油強(qiáng)化風(fēng)味的適宜溫度。

a-酶解溫度；b-酶解時(shí)間圖3 酶解溫度和時(shí)間對(duì)風(fēng)味的影響Fig.3 Effects of temperature and reaction time on flavor

圖4 不同酶解產(chǎn)物中揮發(fā)性成分熱圖Fig.4 Heat map of volatile components of different enzymatic hydrolysis products

GC-MS數(shù)據(jù)的主成分分析(principal component analysis，PCA)結(jié)果如圖6所示，第一主成分(PC1)的貢獻(xiàn)率為59.7%，第二主成分(PC2)的貢獻(xiàn)率為15.1%，LOX酶解黃油前后樣品分離明顯。將滅活后的LOX粗酶與黃油在40 ℃反應(yīng)1 h，其結(jié)果與黃油、酶解后、LOX粗酶樣品均具有明顯差異，基本可以排除大豆LOX粗酶本身帶來(lái)的風(fēng)味影響。

圖6 不同酶解產(chǎn)物的揮發(fā)性成分主成分分析Fig.6 Principal component analysis of volatile components of different enzymatic hydrolysis products

3 結(jié)論

從市售大豆中提取LOX粗酶并研究其酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)LOX粗酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH為7.0。采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，對(duì)LOX粗酶酶解黃油后產(chǎn)物中的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)分析，揮發(fā)性成分達(dá)到48種，己酸、辛酸、丁酸、2-壬酮、2-庚酮、δ-癸內(nèi)酯、丁位己內(nèi)酯等成分含量顯著增加，這些是形成乳制品風(fēng)味的重要組成成分。酶解的溫度、時(shí)間等因素條件對(duì)LOX酶解后的揮發(fā)性成分有一定影響，結(jié)合GC-MS數(shù)據(jù)及感官評(píng)價(jià)結(jié)果，最終確定增強(qiáng)乳香的酶解工藝條件為溫度40 ℃，酶解時(shí)間1 h。酶解后的產(chǎn)物奶香濃郁柔和、香氣協(xié)調(diào)性好、整體接受性高，可作為天然的奶味香精在乳制品中應(yīng)用。