頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析玫瑰醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及特征

張林祥，張蕾，秦子涵，陳嘉慧，邢利民，朱軍莉*

1(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州，310018) 2(湖州老恒和釀造有限公司，浙江 湖州，313213)

浙江玫瑰醋又稱玫瑰米醋，是我國傳統(tǒng)名醋中的液態(tài)發(fā)酵型食醋。浙江玫瑰醋以秈米為原料，在每年的4、5月份投料，經(jīng)自然發(fā)花、沖缸放水、開耙通風(fēng)、低溫陳釀等過程制成，其釀造過程中微生物基本來自周邊空氣和草缸蓋，并通過微生物的優(yōu)勝劣汰以及環(huán)境的篩選，在達到微生物動態(tài)平衡的同時，不斷使淀粉糖化、酒化、醋化，形成頗有特色的地方產(chǎn)品。玫瑰醋中含有大量有機酸、氨基酸以及微量礦物質(zhì)等成分，色澤晶瑩透澈，醇香可口。目前傳統(tǒng)玫瑰醋的研究集中在其傳統(tǒng)工藝的改進，如乙醇及醋酸發(fā)酵條件的優(yōu)化[1-2]，而對其風(fēng)味成分研究鮮有報道。

固相微萃取技術(shù)(solid-phase microextraction,SPME)結(jié)合GC或GC-MS被廣泛應(yīng)用于食醋揮發(fā)性成分檢測。WANG等[3]采用SPME-GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)江香醋的主要風(fēng)味物質(zhì)為乙酸、乙酸乙酯、糠醛、苯乙醇、四甲基吡嗪、3-羥基丁酮和苯甲醛。ZHU等[4]利用SPME-GC-MS結(jié)合GC-O確定了丙酸、乙酸、丁酸、乙偶姻、3-甲基丁酸和糠醛是山西陳醋中主要特征性風(fēng)味物質(zhì)。揮發(fā)性成分也是玫瑰醋風(fēng)味物質(zhì)的重要組成，是評價玫瑰醋品質(zhì)的重要指標，而關(guān)于玫瑰醋風(fēng)味的研究較少，方冠宇[2]利用SPME-GC-MS對浙江玫瑰醋發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分進行測定，將玫瑰醋樣品分成發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期3大類，并得出不同發(fā)酵階段特征性香氣成分。

鑒于此，本研究分析6種不同產(chǎn)地來源的玫瑰醋理化品質(zhì)，采用HS-SPME-GC-MS對傳統(tǒng)玫瑰醋的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行檢測，并利用氣味活性值(odor activity value，OAV)結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)和變量投影重要性值(variable importance in projection，VIP)分析玫瑰醋樣品中的特征風(fēng)味物質(zhì)，獲得玫瑰醋關(guān)鍵差異香氣成分，為提升玫瑰醋風(fēng)味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種玫瑰醋樣品均為市售，產(chǎn)地及配料如表1所示；葡萄糖、CuSO4、NaCl、無水乙醇、NaOH、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、磷酸、鹽酸，均為分析純；β-苯乙醇、乙酸乙酯、苯甲醛、2-乙基丁酸、乙酸，均為國產(chǎn)色譜純。

表1 玫瑰醋產(chǎn)地及配料信息Table 1 Origin and ingredient information of rosy vinegar

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀，美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Supelco公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；酒精計，武強縣華洋儀表廠；PHS-3C酸度計，上海雷磁儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 理化指標的測定

酸度：參照GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》；還原糖：參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》；氨基酸態(tài)氮：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》；色率：參照周利南等[5]的方法進行測定。

1.3.2 感官評價方法

感官分析采用定量描述性分析進行[6]。感官評價小組由8名經(jīng)過培訓(xùn)的成員(4名男性和4名女性，23～30歲)組成。成員首先獨立形成玫瑰醋香氣描述詞，隨后進行組合討論，確定玫瑰醋的8個感官描述屬性(水果香、麩皮香、焦糖香、焦香、杏仁香、黃油香、煙味、酸味)。小組成員被要求在0～5的范圍內(nèi)記錄每種屬性的香氣強度(0=不可感知，5=非常高的強度)。所有感官分析均在特定的感官品評室進行，每個樣品隨機編號重復(fù)測定3次，最終評分取平均值。

1.3.3 SPME-GC-MS檢測方法

取醋樣12.5 mL置于20 mL頂空瓶中，加入100 μL 2-乙基丁酸內(nèi)標物，用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。將頂空瓶放入50 ℃水浴鍋平衡10 min，然后將已在240 ℃進樣口老化至無雜峰的萃取頭插入頂空瓶中距離液面1 cm處，50 ℃下吸附30 min，取出后插入GC進樣口，240 ℃下解析2 min，進行GC-MS分析。

GC條件：色譜柱采用DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.5 μm)，進樣口溫度240 ℃，不分流進樣，載氣為氦氣，恒流模式；柱流速1 mL/min；程序升溫：柱溫30 ℃保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z33～500。GC-MS測定結(jié)果通過NIST14數(shù)據(jù)庫檢索進行初步鑒定，再結(jié)合檢測組分的保留時間、質(zhì)譜等進行定性。以2-乙基丁酸為內(nèi)標物，并配制混合標準溶液，采用加標法測定各組分的相對校正因子fi，相對校正因子(fi)按公式(1)計算[2]：

(1)

式中：ΔWi和ΔAi分別為組分標準品i的增加質(zhì)量濃度(μg/L)和對應(yīng)增加峰面積；Ws和As為內(nèi)標物s的質(zhì)量濃度(μg/L)與峰面積。

待測風(fēng)味物質(zhì)的含量按公式(2)計算：

(2)

式中：Wi和Ai分別為被測組分的質(zhì)量濃度(μg/L)與峰面積；Ws和As分別為內(nèi)標物的質(zhì)量濃度(μg/L)與峰面積。

1.4 關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)分析

對各種揮發(fā)性化合物定量后，按公式(3)計算揮發(fā)性成分OAV：

OAVi=Ci/Ti

(3)

式中：Ci，化合物i的質(zhì)量濃度，μg/L；Ti，化合物i氣味閾值，μg/L，化合物氣味閾值來源于文獻[7～9]。通常認為OAV>1時，該化合物對總體香氣可能有貢獻價值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5和Excel對實驗數(shù)據(jù)進行處理、分析以及圖形繪制；采用SPSS 20.0進行差異顯著性的分析，以P<0.05為差異顯著；采用SIMCA-P進行PLS-DA和VIP值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰醋理化指標分析

6種玫瑰醋樣品的理化性質(zhì)如表2所示。玫瑰醋的還原糖含量為1.30～6.14 g/100 mL，其中以M5玫瑰醋含量最高，可能與后期調(diào)配添加的蔗糖相關(guān)。還原糖是細菌分解淀粉及低聚糖產(chǎn)生的產(chǎn)物，適量的還原糖可以豐富醋柔和的口感[10]。玫瑰醋樣品pH值為2.73～3.07，總酸含量在3.40～4.41 g/100 mL之間，兩者存在一定的相關(guān)性，總酸含量高的玫瑰醋樣品pH值低，這與之前的研究一致[10]。玫瑰醋的pH值低于陳醋，其中山西和鎮(zhèn)江陳醋pH值分別為3.67～3.88和3.35～3.97[11]，主要原因可能是原料、發(fā)酵微生物和儲存時間的差異。

6種玫瑰醋的氨基酸態(tài)氮含量為0.082～0.109 g/100 mL，其中M5樣品玫瑰醋略低于其他組。氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，該指標越高，表明玫瑰醋鮮味越好[12]。玫瑰醋以其色澤鮮艷的玫瑰紅色而聞名，采用色率對玫瑰醋色澤進行量化評價，色率數(shù)值越大表示玫瑰醋顏色越深。6組玫瑰醋中M1樣品為暗紅色，而其他5組玫瑰醋色率相近，為透亮的玫瑰紅色，不同來源玫瑰醋顏色差異可能與陳釀時間、發(fā)酵原料有關(guān)[13]。

表2 玫瑰醋理化指標分析結(jié)果Table 2 Analysis results of physical and chemical indexes of rosy vinegar

2.2 玫瑰醋感官評價

采用感官定量描述分析比較6種不同產(chǎn)地玫瑰醋樣品香氣，篩選出了8個描述玫瑰醋風(fēng)味的詞匯，即果香、麩皮香、焦香、焦糖香、煙味、黃油香、杏仁香、酸味，并考察玫瑰醋綜合復(fù)雜性，如圖1所示。M2、M3、M4三種玫瑰醋具有更強的水果味和黃油味，而M1、M5、M6玫瑰醋樣品表現(xiàn)出更強的麩皮香氣以及煙味。從香氣層面來看，各玫瑰醋香氣特征存在明顯的差異，可能與原料、發(fā)酵和陳釀工藝的差別有關(guān)。6種玫瑰醋中水果香、麩皮香、焦糖香氣及綜合復(fù)雜性的香氣特征都具有顯著性差異，其中麩皮香差異最大。福建紅曲米醋更具備甜味、澀味、甜香、果香、麩皮香、花香和酒香味，山西老陳醋則表現(xiàn)出甜香、烘烤香、堅果香、酸香、花果香和奶香[14]。

圖1 玫瑰醋感官評價分析Fig.1 Sensory evaluation of rosy vinegar注：*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001

2.3 玫瑰醋香氣成分分析

為評價6種玫瑰醋香氣差異，采用HS-SPME-GC-MS分析鑒定玫瑰醋樣品的揮發(fā)性化合物成分及含量，結(jié)果如圖2和表3所示。6種玫瑰醋樣品中共檢測出56種化合物，包括7種醇類物質(zhì)、7種醛類物質(zhì)、9種酸類物質(zhì)、15種酯類物質(zhì)、5種酮類物質(zhì)、2種酚類物質(zhì)以及11種雜環(huán)類物質(zhì)。6組玫瑰醋揮發(fā)性成分各組分含量占比存在一定差異，其中酯類、酸類和醛酮類在玫瑰醋的所有香氣化合物中占比較高。M2揮發(fā)性化合物含量最高，為6 389.26 μg/L，其他3種杭嘉湖產(chǎn)玫瑰醋揮發(fā)性成分含量相近，而非杭嘉湖產(chǎn)2種玫瑰醋揮發(fā)性成分含量較低。

圖2 玫瑰醋揮發(fā)性成分種類含量Fig.2 The content of volatile components in rosy vinegar

酸類物質(zhì)是食醋最重要的成分之一，占玫瑰醋香氣總量的44.60%～62.71%，賦予玫瑰醋特定的風(fēng)味及感官屬性。6種玫瑰醋中酸類物質(zhì)含量差別不大，乙酸是含量最高的物質(zhì)，為2 263.70～3 077.65 μg/L，其與發(fā)酵中糠醛的生成以及酯化反應(yīng)相關(guān)。6組玫瑰醋樣品中均檢測出丙酸，可能是微生物通過特殊的發(fā)酵工藝條件或者利用某些特定的原料作用產(chǎn)生，在四川麩醋及山西老陳醋中也有檢出[15]，為玫瑰醋提供油脂奶酪香氣。

表3 玫瑰醋揮發(fā)性成分含量 單位：μg/L

注:-表示未檢出；同行標有不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

酯類化合物占香氣總量的16.32%～24.01%，是玫瑰醋中定性定量的風(fēng)味化合物最豐富的類別之一，主要產(chǎn)生于酒精和醋酸發(fā)酵階段。乙酸乙酯是除乙酸外玫瑰醋中含量最高的香氣化合物，賦予玫瑰醋水果香及花香[16]。異丁酸乙酯、異戊酸乙酯在6種玫瑰醋中均有檢出，含量較低，但具有較低的閾值，是玫瑰醋香氣重要的組成部分。

醛類化合物主要來源于脂氧化和降解，玫瑰醋中醛類物質(zhì)含量較高，占香氣含量的10.88%～22.24%。玫瑰醋中主要的醛類化合物有糠醛、苯乙醛、苯甲醛、異戊醛以及3-甲基丁醛，其中糠醛是在陳釀過程中通過氨基酸脫氨、脫羧形成，具有焦糖氣息，其含量與陳釀時間相關(guān)[16]。苯甲醛、苯乙醛和3-甲基丁醛的形成與氨基酸的代謝密切相關(guān)。苯甲醛是一種芳香醛，具有糖果、甜味和杏仁氣味[17]。ZHU等[4]發(fā)現(xiàn)在山西老陳醋釀造過程中乳酸菌參與苯甲醛的形成。苯乙醛是另一種芳香醛，具有強烈的甜香和巧克力的香味，可能與苯乙醇氧化或苯丙基氨基酸降解有關(guān)[15]。

醇類化合物在玫瑰醋中占香氣總量的2.55%～8.19%，大多數(shù)由微生物分解糖苷類、氨基酸和脂肪酸產(chǎn)生，主要產(chǎn)生于酒精發(fā)酵階段[18]。玫瑰醋中醇類化合物含量第2的是苯乙醇，含量為62.05～142.94 μg/L，主要來源于酵母菌的氨基酸代謝產(chǎn)物[19]。而異戊醇和2,3-丁二醇分別增加玫瑰醋水果和奶油香氣，醇類物質(zhì)組成可能與釀造過程微生物的多樣性及高溫和酯化反應(yīng)相關(guān)[4]。

酮類以3-羥基-2-丁酮(又叫乙偶姻)為主要揮發(fā)性成分，該物質(zhì)具有牛奶香氣，且合成途徑較多，可通過2,3-丁二醇氧化生成，也可由丙酮酸轉(zhuǎn)化或經(jīng)過糖酵解生成[20]。除此之外，2,3-丁二酮也是玫瑰醋中含量較高的酮類物質(zhì)，3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二酮是山西陳醋中的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，也是關(guān)鍵風(fēng)味化合物吡嗪的前體[21]。

雜環(huán)及酚類物質(zhì)在玫瑰醋中含量較少(<1%)，形成過程較復(fù)雜，主要由釀造原料帶入。在M1、M2、M4玫瑰醋樣品中檢測出2,3,5,6-四甲基吡嗪即川芎嗪，在M2樣品中含量最高，達到342.59 μg/L，該物質(zhì)具有很好的藥理作用，具有抗血栓、抑制癲癇、抗腫瘤的作用[22]。

2.4 玫瑰醋揮發(fā)性成分OAV分析

風(fēng)味物質(zhì)對玫瑰醋整體風(fēng)味的貢獻可結(jié)合化合物的閾值進行評價，風(fēng)味物質(zhì)的閾值不同，對整體風(fēng)味貢獻也有差異[23]。結(jié)合表3化合物的定性定量結(jié)果及文獻中對應(yīng)化合物在水中的閾值，計算得到OAV(表4)。在6種玫瑰醋樣品中，共計算得到7種OAV>1風(fēng)味物質(zhì)，分別為異戊醛、苯甲醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、3-乙?；?2-丁酮、2,3-丁二酮、2-乙?；秽４碱惣八犷惢衔镌诿倒宕字泻枯^高但一般具有較高的氣味閾值，對玫瑰醋風(fēng)味貢獻較小，而部分低濃度的化合物例如3-乙?；?2-丁酮、2,3-丁二酮、2-乙?；秽韧惢螂s環(huán)類物質(zhì)會對玫瑰醋風(fēng)味造成比較大的影響。

表4 玫瑰醋揮發(fā)性成分的閾值、氣味描述及氣味活性值Table 4 Threshold, odor description and OAV of volatile components in rosy vinegar

玫瑰醋樣品中7種香氣化合物的OAV不同，總體來說，玫瑰醋香氣主要以水果香、奶油香和黃油香為主，這與M2、M3、M4在感官上呈現(xiàn)甜香相符，而在所有樣品中乙酸乙酯、3-乙?；?2-丁酮和2,3-丁二酮OAV均遠高于其他香氣化合物，可認為乙酸乙酯、3-乙?；?2-丁酮和2,3-丁二酮可能是浙江玫瑰醋特征風(fēng)味香氣成分。

2.5 玫瑰醋揮發(fā)性成分OPLS-DA及VIP分析

OPLS-DA是在PCA基礎(chǔ)上再進行計算分析的一種數(shù)據(jù)可視化分析方法，同時具備降維和監(jiān)督模式，可通過預(yù)設(shè)分類，有效去除未控制變量對最終數(shù)據(jù)造成的影響，進一步挖掘數(shù)據(jù)之間相關(guān)性，同時可以量化特征風(fēng)味物質(zhì)造成樣品之間差異的程度[24]。將玫瑰醋OAV>1的風(fēng)味物質(zhì)含量作為Y變量進行OPLS-DA建模分析。由圖3可知，模型中R2X=0.830，Q2=0.616，其中R2X=0.830表明該模型能反映83.0%數(shù)據(jù)的變化，R2和Q2高于0.5(50%)顯示該模型具有較高的可解釋度和擬合度。圖3顯示6種玫瑰醋樣品在OPLS-DA得分散點圖中組內(nèi)聚集性較好，組間有一定程度的分離。M1、M4、M5聚為一類，表明這3種樣品中香氣化合物對整體玫瑰醋香氣貢獻相似，而M2單獨聚類，提示M2玫瑰醋樣品的風(fēng)味化合物對香氣總體貢獻不同于其他5種樣品，可能與M2的風(fēng)味物質(zhì)較多有關(guān)。

圖3 玫瑰醋風(fēng)味物質(zhì)的 OPLS-DA 分數(shù)散點圖Fig.3 Scores plot of OPLS-DA model of rosy vinegar flavor compounds

利用OPLS-DA形成的VIP值的大小進行關(guān)鍵變量分析，一般來說，VIP值越大的變量對模型貢獻率越大。以VIP值>1為界限得到異戊醛、乙酸乙酯和乙酸異戊酯(圖4)是6種玫瑰醋中差異貢獻最大的代謝物，其中乙酸乙酯也是四川保寧醋和山西老陳醋之間的主要差異代謝物，與合成前體物質(zhì)乙酸的含量直接相關(guān)[24]。乙酸異戊酯同樣是鎮(zhèn)江香醋中重要的酯類物質(zhì)，含量受微生物和環(huán)境的影響，異戊醛是玫瑰醋關(guān)鍵呈香化合物，來源于發(fā)酵過程脂類物質(zhì)氧化和降解[9]。

圖4 基于OPLS-DA模型分析的VIP預(yù)測值分布圖Fig.4 Distribution of VIP forecast values based on OPLS-DA model analysis

3 結(jié)論

本研究分析和比較了6個產(chǎn)地玫瑰醋的理化特性和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明，6種玫瑰醋樣品的pH、總酸及氨基酸態(tài)氮無顯著差異，僅因工藝不同還原糖含量存在顯著性差異。玫瑰醋具有水果香、麩皮香、焦糖香氣及香氣復(fù)雜性等感官屬性，且產(chǎn)地間感官特性存在顯著性差異，特別是麩皮香值。6種玫瑰醋樣品中共鑒定出7類物質(zhì)76種風(fēng)味成分，其中浙江產(chǎn)玫瑰醋揮發(fā)性成分總量高于鎮(zhèn)江產(chǎn)地。玫瑰醋含較豐富的揮發(fā)性風(fēng)味成分，包括苯乙醇、糠醛、苯甲醛、乙酸乙酯、乙酸、異戊酸、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮等物質(zhì)。玫瑰醋樣品中OAV值>1的有7種成分，其中乙酸乙酯、3-乙?；?2-丁酮和2,3-丁二酮被認為是浙江玫瑰醋特征風(fēng)味香氣成分。PLS-DA結(jié)合VIP值判斷異戊醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯是玫瑰醋樣品風(fēng)味差異的主要風(fēng)味物質(zhì)。