市售嬰配粉美拉德反應(yīng)產(chǎn)物含量及其儲藏期間變化規(guī)律

魏妙宏，宋博，畢日秀，張書文，逄曉陽，蘆晶,2*，呂加平*

1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京，100193)2(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京，100048)

世界衛(wèi)生組織建議在嬰兒出生后的6個月進(jìn)行純母乳喂養(yǎng)[1]，但母乳喂養(yǎng)受多重因素的影響，在某些情況下無法實現(xiàn)全母乳喂養(yǎng)或者不得不中斷母乳喂養(yǎng)[2]。嬰幼兒配方粉是替代母乳實施人工喂養(yǎng)嬰幼兒的唯一營養(yǎng)來源，其營養(yǎng)品質(zhì)和功能特性對嬰幼兒的生長發(fā)育及健康體質(zhì)十分重要。然而，為了保證食用安全性及長貨架期，嬰配粉往往經(jīng)歷比常規(guī)乳制品更強(qiáng)烈的熱處理[3]。熱處理雖能達(dá)到殺菌和制粉的目的，但也會對嬰配粉的營養(yǎng)價值和食用安全性產(chǎn)生一定的不利影響[4]。

美拉德反應(yīng)是乳制品熱處理過程中重要的化學(xué)變化之一，它是以乳蛋白賴氨酸的糖基化為主要反應(yīng)并交互作用形成復(fù)雜產(chǎn)物的特定羰氨褐變反應(yīng)，也可以稱之為非酶褐變。嬰配粉中富含蛋白質(zhì)和還原糖，因此極易發(fā)生美拉德反應(yīng)。該反應(yīng)主要有早、中、晚3個過程，糠氨酸是早期反應(yīng)的主要指示物?？啡┗衔锖挺?二羰基化合物是中期反應(yīng)的主要產(chǎn)物[5]。糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)，是由BROWNLEE等[6]提出的概念，用于描述美拉德反應(yīng)晚期的產(chǎn)物，N-ε-羧甲基-L-賴氨酸[N-ε(carboxymethyl)lysine,CML]和N-ε-羧乙基-L-賴氨酸[N-ε(carboxyethyl)lysine,CEL]是乳制品中常見的美拉德晚期糖基化產(chǎn)物。AGEs可能會對人體心血管、腎臟造成一定的影響[7]，也有可能促進(jìn)炎癥的發(fā)生[8]，在糖尿病和尿毒癥中發(fā)揮重要的病理生理學(xué)作用[9]。

美拉德反應(yīng)的影響因素有很多，比如貯藏溫度、貯藏時間、pH等[10]。本研究主要通過測定市售嬰配粉中不同階段美拉德反應(yīng)產(chǎn)物糠氨酸、5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)、乙二醛、丙酮醛、2,3-丁二酮、CML以及CEL含量的變化，調(diào)研不同品牌嬰配粉美拉德副產(chǎn)物含量及貯藏過程中美拉德副產(chǎn)物的變化規(guī)律，用于指導(dǎo)提高市售嬰配粉的質(zhì)量和安全性。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

糠氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，上海安譜實驗科技有限公司；乙二醛、丙酮醛、2,3-丁二酮標(biāo)準(zhǔn)品、CML標(biāo)準(zhǔn)品、羧乙基賴氨酸標(biāo)品(CEL)，美國Sigma公司；5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品，上海摩貝試劑公司；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜級)、甲酸(色譜純)、濃鹽酸(密度 1.19 g/mL)、三氟乙酸(色譜純)、乙酸銨，北京國藥有限公司；Ⅰ段嬰幼兒配方粉，北京各大超市。

YQ107-02超高效液相色譜儀，美國Waters公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；2300全自動凱氏定氮儀，安捷倫科技丹麥FOSS；3K15離心機(jī)，德國Sigma公司；Model 680 酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 樣品制備

Ⅰ段嬰幼兒配方粉包括6種國內(nèi)品牌和8種國外品牌，嬰配粉的信息包括蛋白質(zhì)含量、生產(chǎn)日期以及生產(chǎn)原材料等。具體樣品信息如表1所示。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information sheet

1.3 糠氨酸和賴氨酸的測定

參照NY/T 939—2016《巴氏殺菌乳和UHT滅菌乳中復(fù)原乳的測定》，改變部分條件進(jìn)行測定。稱取1.5 g樣品于水解管中，加2 mL蒸餾水進(jìn)行溶解，加入10.6 mol/L HCl溶液6 mL，混合均勻，在110 ℃下加熱水解18～24 h。取出樣品冷卻后過濾，濾液待測。取2 mL樣品水解液，按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法測定樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。將1 mL水解液與5 mL質(zhì)量濃度6 g/L的乙酸銨溶液混勻以后用0.22 μm水相濾膜過濾，經(jīng)UHPLC測定，按照外標(biāo)法進(jìn)行定量檢測。

色譜條件：色譜柱：HSST3(100 mm×4.6 mm，2.5 μm)；柱溫35 ℃；檢測波長280 nm；流動相：0.1%三氟乙酸水溶液為流動相A，甲醇為流動相B；洗脫條件：流速0.5 mL/min；B相梯度洗脫程序：0～8 min，0%～13.2%；8～8.5 min，13.2%～100%；8.5～10 min，100%～0%；10～12 min，0%。

牛奶中發(fā)現(xiàn)的賴氨酸阻滯物為Amadori化合物形式，不能被消化，稱為“封閉賴氨酸”，封閉的或糖基化的賴氨酸降低了賴氨酸在代謝過程中的生物利用度，這意味著牛乳營養(yǎng)價值的損失[11]。參考BOSCH等[12]的計算方法，利用全自動氨基酸分析儀測定樣品中賴氨酸的含量，并計算封閉賴氨酸的含量，來指示賴氨酸的損失程度，計算如公式(1)所示：

封閉賴氨酸含量/%=

(1)

式中：M賴，賴氨酸的相對分子質(zhì)量，146.19 Da；M糠，糠氨酸相對分子質(zhì)量，254.28 Da；ω(糠)， 糠氨酸含量；ω(賴),賴氨酸含量。

1.4 5-HMF的測定

按照NY/T 1332—2007《乳與乳制品中5-羥甲基糠醛含量的測定 高效液相色譜法》測定。分別稱取2 g嬰配粉樣品于50 mL離心管中，加7.3 mL水溶解，向各樣品離心管中加入5 mL草酸溶液混勻，80 ℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫，再加入10 mL甲醇混勻后加入3 mL亞鐵氰化鉀和3 mL乙酸鋅混勻，振搖后靜置15 min，然后將樣液以6 000 r/min離心10 min，將上清液置于50 mL容量瓶中，沉淀中加入10 mL甲醇，6 000 r/min離心10 min，合并2次上清液，濾紙過濾后用甲醇定容至50 mL，用0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾待測。

色譜條件：色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫30 ℃;檢測波長284 nm;流動相：甲醇為流動相A，水為流動相B;洗脫條件：流速0.8 mL/min；洗脫程序：甲醇與水按照15%和85%等度洗脫。

1.5 α-二羰基化合物的測定

參照畢日秀等[13]的方法進(jìn)行測定。分別配制不同濃度的乙二醛、丙酮醛、2，3-丁二酮3種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1 mL進(jìn)行衍生反應(yīng)，加入10 mg/mL的鄰苯二胺水溶液300 μL，在60 ℃水浴(50 r/min)條件下反應(yīng)30 min，冰水冷卻后經(jīng)過0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，上樣測定，分別繪制目標(biāo)物的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取1 g樣品溶解，加2 mL蒸餾水于15 mL離心管中，加入8 mL甲醇，渦旋振蕩1 min，離心15 min(10 000 r/min)使蛋白沉淀，上清液備用。取3 mL上清液于密封棕色瓶中，加入400 μL鄰苯二胺水溶液(10 mg/mL)，60 ℃水浴振蕩30 min。后經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)行UHPLC。

色譜條件：色譜柱：HSST3(100 mm×4.6 mm，2.5 μm);柱溫35 ℃;檢測波長320 nm;流動相：0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B;洗脫條件：流速0.3 mL/min;B相梯度洗脫程序，0～15 min，20%～30%；15～18 min，30%～50%；18～22 min，50%～80%；22～30 min，80%;30～32 min，80%～20%；32～35 min，20%。

1.6 CEL、CML測定

參照賈曉迪[14]的方法，稍作修改進(jìn)行測定。稱取0.4 g樣品，加3 mL正己烷脫脂3次，晾干；加1 mL硼氫化鈉溶液和1.5 mL硼酸鹽緩沖溶液，4 ℃還原12 h，隨后緩慢加入 0.5 mL 20%的三氯乙酸終止反應(yīng)，再以10 000 r/min離心10 min使蛋白沉淀，除去上清液后將沉淀蛋白用4 mL 6 mol/L的鹽酸溶解，氮吹 1 min后封管，置于110 ℃的烘箱中水解24 h備用。水解后的樣品經(jīng)N2吹干，用超純水復(fù)溶后過固相萃取柱凈化，收集樣液并過0.22 μm水相濾膜上樣測定。

色譜條件：色譜柱：HSST3(100 mm×4.6 mm，2.5 μm);檢測波長320 nm;流動相：0.1%甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B;洗脫條件：流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;B相梯度洗脫程序，0～2 min，10%～90%；2～3 min，90%；3～4 min，90%～10%；4～5 min，10%。

質(zhì)譜條件：在正電離模式下運(yùn)行：源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，碰撞氣流0.15 mL/min，脫溶劑氣體流量600 L/h，毛細(xì)管電壓3 kV。色譜運(yùn)行在5 min內(nèi)完成。通過監(jiān)控CML和CEL的母離子分別為205和219m/z，子離子均為84m/z進(jìn)行采集。

1.7 熒光強(qiáng)度測定

用酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，反映美拉德反應(yīng)程度。參照畢日秀等[13]的方法進(jìn)行測定，取0.5 g樣品放入10 mL離心管中，加入1 mL超純水溶解后，再加入4 mL pH 4.6的乙酸鹽緩沖溶液。搖勻后，以4 000×g離心10 min。用濾紙過濾后，向0.5 mL上清液中加入4.5 mL超純水。當(dāng)測量高級美拉德產(chǎn)品的熒光強(qiáng)度(fluorescence of advanced Maillard reaction products，F(xiàn)AMP)時，激發(fā)波長設(shè)置為360 nm，發(fā)射波長設(shè)置為440 nm。當(dāng)測量色氨酸的熒光強(qiáng)度(fluorescence of tryptophan，F(xiàn)Trp)時，激發(fā)波長設(shè)定為290 nm，發(fā)射波長設(shè)定為340 nm。綜合熱損傷指數(shù)(fluorescence of advanced Maillard products and soluble tryptophan，F(xiàn)AST)反映了單位蛋白質(zhì)中FAMP的相對含量，可以綜合指示熱處理后牛乳的損傷程度。根據(jù)公式(2)計算FAST指數(shù)：

(2)

式中：FAST，綜合熱損傷指數(shù)；FAMP，高級美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度；FTrp，色氨酸熒光強(qiáng)度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 25和Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理與作圖分析。各實驗均平行重復(fù)3次，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嬰配粉美拉德早期反應(yīng)程度

糠氨酸是人造氨基酸，由Amadori化合物用6 mol/L HCl溶液在110 ℃ 24 h水解形成的。早期美拉德產(chǎn)品沒有明顯的顏色，在280 nm沒有紫外吸收峰，轉(zhuǎn)變?yōu)榭钒彼嵩?80 nm處有很強(qiáng)的紫外線吸收，可以通過高效液相色譜檢測[15]。因此，美拉德反應(yīng)早期的反應(yīng)程度可以根據(jù)產(chǎn)物中糠氨酸的含量來反映，從而進(jìn)一步判斷嬰配粉加工過程中蛋白質(zhì)的熱損傷程度。

如圖1、2所示，不同品牌的嬰配粉糠氨酸和封閉賴氨酸含量不同，糠氨酸含量在300.44～856.64 mg/100 g，封閉賴氨酸含量在6.06%～16.16%，其中D4品牌的糠氨酸及封閉賴氨酸含量顯著高于其他品牌,其封閉賴氨酸含量高達(dá)16%，封閉賴氨酸比例高會影響嬰幼兒對賴氨酸的攝入。CONTRERAS-CALDERN等[16]研究了4種嬰配粉的糠氨酸含量在55～1 937 mg/100 g，糠氨酸含量的差異性可能是由各市售品牌的嬰配粉的加工工藝條件和其中的糖類成分含量、蛋白質(zhì)種類以及金屬離子的種類的差異性引起[17-18]。以生牛乳為原料的嬰配粉和以奶粉為原料的嬰配粉糠氨酸含量差異不顯著(圖1-b)。室溫儲存15個月與室溫儲存3個月相比，貯藏期間糠氨酸含量有增加的趨勢，反映出美拉德反應(yīng)在儲存過程中仍在進(jìn)行。

a-國內(nèi)外品牌對比；b-原材料對比；c-生產(chǎn)日期對比D-表示國產(chǎn)品牌；I-表示進(jìn)口品牌(下同)圖1 不同品牌嬰配粉糠氨酸含量Fig.1 Furosine content in different brands of infant formula

2.2 不同嬰配粉美拉德中期反應(yīng)程度

2.2.1 5-HMF含量

美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，如5-HMF和α-二羰基化合物，沒有明顯的顏色，在一定波長下有較強(qiáng)的紫外吸收峰。因此，可以通過測定中間代表產(chǎn)物的含量來判斷美拉德反應(yīng)程度。目前尚不清楚人類接觸5-HMF是否會造成潛在的健康風(fēng)險，但高濃度的5-HMF具有細(xì)胞毒性，可對眼睛、上呼吸道、皮膚和黏膜造成刺激，且5-HMF具有潛在的誘變和致癌作用[19-20]。如圖3所示，不同品牌的嬰配粉5-HMF含量在11.89～18.51 mg/kg。原料為生牛乳或乳粉不影響產(chǎn)品中5-HMF的含量。國內(nèi)及國外品牌嬰配粉中5-HMF差異不顯著。在貯藏期間5-HMF整體含量變化較小，可能與其自身不穩(wěn)定性及與其他中間產(chǎn)物相互作用有關(guān)[21]。JANZOWSKI等[19]制定了成人攝入5-HMF的每日容許攝入量(allowable daily intake,ADI)(30～60 mg/kg體重)。新生兒正常體重在2.5～4 kg，根據(jù)Ⅰ段奶粉的包裝上對新生兒的推薦沖泡次數(shù)，新生兒每天攝入約63 g，如果按照20 mg/100 g計算(根據(jù)測得的5-HMF含量均小于20 mg/100 g)，新生兒每日攝入5-HMF含量在3.15～5.04 mg/kg，遠(yuǎn)低于成人的ADI值，說明市場上的奶粉都是相對可靠的。

a-國內(nèi)外品牌對比；b-原材料對比；c-生產(chǎn)日期對比圖3 不同品牌嬰配粉的5-HMF含量Fig.3 5-HMF content in different brands of infant formula

2.2.2 三種α-二羰基化合物含量的變化

α-二羰基化合物是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，也是AGEs的前體物質(zhì)，該系列物質(zhì)在體內(nèi)累積的含量與糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)[22]。如圖4所示，不同品牌的嬰配粉α-二羰基化合物含量不同，乙二醛含量在0.14～0.87 mg/kg，丙酮醛含量在0.15～2.7 mg/kg，2,3-丁二酮含量在3.16～9.31 mg/kg。D3品牌的丙酮醛含量顯著高于其他品牌，可能與其加工工藝條件以及額外添加的酪蛋白相關(guān)，據(jù)報道，不同產(chǎn)地、不同配方會導(dǎo)致美拉德反應(yīng)最終狀態(tài)不同[23]。奶粉作為原料和生牛乳作為原料的產(chǎn)品之間二羰基化合物含量無顯著差異。而且隨著儲存時間的延長，這3種二羰基化合物含量均上升，乙二醛含量最低增加90%，最高增加4.2倍，丙酮醛含量最低增加2.6倍，最高增加3.4倍，2，3-丁二酮含量最低增加1.2倍，最高增加1.8倍。乙二醛含量較低，基數(shù)比較小，所以含量變化明顯。這3種美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定，易受外界因素影響，反應(yīng)活性高。在胺類化合物的存在下，它們會進(jìn)一步反應(yīng)生成雜環(huán)芳香族化合物，并與高級糖基化化合物(如CML)發(fā)生反應(yīng)，影響奶粉的質(zhì)量和品質(zhì)[24]。

a、d、g-國內(nèi)外品牌乙二醛、丙酮醛、2，3-丁二酮對比；b、e、h-原材料乙二醛、丙酮醛、2，3-丁二酮對比；c、f、i-生產(chǎn)日期乙二醛、丙酮醛、2，3-丁二酮對比圖4 不同品牌嬰配粉3種二羰基化合物含量Fig.4 three dicarbonyl compounds content in different brands of infant formula

2.3 不同品牌嬰配粉AGEs含量

如圖5所示，不同品牌嬰配粉AGEs含量不同，CEL含量在0.14～0.34 μg/mL，CML含量在5.99～32.76 μg/mL，隨著貯藏時間的增加，特別是CML的含量增加顯著，最低增加3.2倍，最高增加7.4倍，與LI等[21]結(jié)果相似。AGEs含量上升，這可能與熱加工強(qiáng)度、儲藏時間與加工次數(shù)間存在一定的疊加作用，能夠?qū)е氯橹破分匈嚢彼崴降目焖俳档秃兔览路磻?yīng)有害產(chǎn)物水平的迅速升高。AGEs的ADI值為32～252 μg/kg[14]。按新生兒嬰配粉沖泡方式計算， CML、CEL含量之和都低于31 μg/mL，按照此值計算，新生兒每日攝入CML和CEL含量在38.8～62.0 μg/kg，與成人的ADI值相近。嬰配粉中CML及CEL應(yīng)引起注意。

a-國內(nèi)外品牌CEL含量對比；b-原材料CEL含量對比；c-生產(chǎn)日期CEL含量對比d-國內(nèi)外品牌CML含量對比；e-原材料CML含量對比；f-生產(chǎn)日期CML含量對比圖5 不同品牌嬰配粉AGEs含量Fig.5 Advanced glycation end products content in different brands of infant formula

2.4 不同品牌嬰配粉綜合熱損傷指數(shù)的變化

牛奶在加熱過程中，蛋白質(zhì)被降解，色氨酸的熒光減弱，隨著美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的積累，熒光增強(qiáng)。因此，結(jié)合色氨酸的熒光強(qiáng)度和美拉德反應(yīng)后期產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，計算FAST值來評價嬰幼兒配方奶粉的綜合熱損傷程度的變化[13]。如圖6所示，不同品牌的嬰配粉FAST不同，國內(nèi)品牌和國外品牌沒有明顯的差異，原料對FAST的變化影響不大。隨著儲存時間的增加FAST變大，F(xiàn)AST越大表明嬰配粉的美拉德反應(yīng)程度越劇烈[25]，印證了儲藏過程中美拉德反應(yīng)也在不斷進(jìn)行。

a-國內(nèi)外品牌對比；b-原材料對比；c-生產(chǎn)日期對比圖6 不同品牌嬰配粉FAST變化Fig.6 Changes of FAST index in different brands of infant formula

3 結(jié)論與討論

本研究分析了不同品牌的嬰配粉中美拉德反應(yīng)早期、中期以及晚期產(chǎn)物含量的情況，不同品牌的嬰配粉美拉德產(chǎn)物含量不同，丙酮醛和CML的含量在貯藏期間有明顯差異。這些嬰配粉在儲藏過程中美拉德反應(yīng)仍然在進(jìn)行，各種產(chǎn)物在反應(yīng)過程中均有累積，其中美拉德反應(yīng)中、末期產(chǎn)物增加速率高于初期產(chǎn)物。由于國外品牌進(jìn)口需要一定時間的運(yùn)輸和海關(guān)的檢驗，所以國外品牌嬰配粉的生產(chǎn)日期與食用期一般差距較大。各種品牌的嬰配粉蛋白質(zhì)含量、金屬離子含量與種類、熱處理強(qiáng)度以及貯藏時間差異[21,24]導(dǎo)致美拉德產(chǎn)物在儲藏過程中增加的幅度有所不同，所以在控制美拉德反應(yīng)程度和副產(chǎn)物產(chǎn)生方面，要注意加工工藝條件的選擇。綜合評價市售嬰配粉在儲藏期間的安全性，建議購買生產(chǎn)日期新鮮的奶粉，開封后在推薦日期內(nèi)食用，同時也不建議大量購買囤積，以保證其質(zhì)量和安全性。